무성 양서류 배아과(Rorippa aquatica)의 재생 기반 아그로박테리움 매개 효율적인 변형

우리는 무성생 식물을 위한 단순하고 확장 가능한 아그로박테리움 변환 파이프라인의 부재를 해결하여 유전자 기능의 분자 분석을 가능하게 합니다. 최근에는 전체 유전체 및 생리학적 유전자 발현 연구에서 rorippa aquatica를 이종 친화성 모델로 도입했습니다. 이는 육지에서 수자원으로의 적응의 분자적 기초를 연구하는 데 유용합니다.

우선, 건강한 잎을 가진 두 달 된 대목 식물을 선택하세요. 잎이 완전히 가장자리가 있는 상태입니다. 20 x 30cm 크기의 식물 번식 트레이와 오토클레이브 종이 타월 두 겹을 준비하세요. 종이 타월을 깔끔하게 접고 멸균된 물로 적셔서 표면에 얇은 물층이 남을 때까지 하세요.

실험실 벤치에는 100에서 500밀리리터의 이중 증류수, 예상되는 재현탁 접종량에 적합한 멸균 용기, 마이크로 피펫, 적절한 피펫 팁이 갖춰져 있는지 확인하세요. 이제 가위를 사용해 선택한 스톡 식물의 꽃잎 밑부분 잎 10개를 빠르게 잘라내어 멸균물이 든 페트리 접시에 넣습니다. 2.5시간 후, 부탁액 1리터당 50마이크로리터의 계면활성제를 피펫팅하여 0.005% 계면활성제 농도를 얻습니다.

플라스크를 부드럽게 돌려 용액을 섞고, 접종 후 식물 이식을 위해 준비된 번식 트레이가 확보되도록 하세요. 이제 잎을 올려놓고 옆을 향하게 합니다. 메스를 사용해 잎의 중간 갈비뼈를 따라 수직으로 길이 1센티미터 크기의 조각으로 잘라내어 50밀리리터 튜브에 넣어 회전관 믹서에 넣어 접종 제거 식물로 사용한다.

모든 식물 제거 물질을 완전히 포화시킬 수 있을 만큼 충분한 부피로 아그로바크테리움 접종물을 튜브에 부어줍니다. 튜브를 로터리 믹서에 올려놓고 실온에서 10분간 교반하여 접종을 진행하세요. 그 후 겸자를 사용해 접종된 잎 제거물을 모두 제거하여 준비된 번식 트레이에 직접 넣습니다.

적신 식물을 분리하여 고르게 펴서 부분적으로 적시되 완전히 잠기지 않도록 하세요. 다음으로, 번식 트레이를 랩으로 밀봉하세요. 트레이를 어두운 환경에 놓고 22도 섭씨 상온에서 3일간 부화시킵니다.

암 부화 기간이 끝난 후에는 트레이가 투명 플라스틱 랩으로 밀봉되어 있는지 확인하세요. 필요하면 습도를 유지하기 위해 트레이에 이중 증류수를 넣습니다. 접종 트레이를 성장실로 옮기고 영양 번식 조건에서 유지하세요.

재생된 로제트 식물의 이식 적합성을 육안으로 점검하세요. 이상형을 식별하려면 최소 2에서 3밀리미터 길이의 여러 잎과 뿌리가 온전한 슈트의 존재를 확인한다. 그 후 겸자를 사용해 온전한 유전자 형질전환 로제트 소식을 절제합니다.

절제된 식물은 야생형 클론 재생에 사용되는 동일한 조건에서 이식합니다. 유전자 변형 잎과 접촉하지 않도록 조심하며 불이 붙은 로제트 식물을 제거하세요. 형질전환 잎 바로 주변의 과도한 잎을 다듬고, 화분당 한 개의 작은 식물을 이식하세요.

이식한 식물을 비료 준 후에는 충분히 물을 주고, 잎에 분무를 뿌린 뒤 적절한 조건에 놓으세요. 마지막으로, 새싹과 뿌리가 없거나 이식하기에 너무 작아 보이는 변형체가 포함된 이식 식물을 번식 트레이로 돌려보냅니다. 이 제거 식물들을 계속 선별하고 충분히 자라면 이식하세요.

한 달 된 1개월 된 모종 대부분은 키메라 루비 발현 패턴을 보였고, 소수는 완전히 루비 발현 잎을 보였습니다. 성숙한 6개월 된 우리 1T 1 묘목은 키메라 루비 발현을 보였습니다. 1 T 1 묘목에서 제거한 키메라 루비 색소 잎 부위는 무성생식 번식이 가능했습니다.

잘라낸 키메라 잎 조각은 절단 후 2주에서 4주 이내에 완전한 루비 발현 또는 키메라 형태의 1T 1 로제트 식물로 재생되었으며, 재생 과정에서 뿌리 형성이 눈에 보입니다. 한 달이 지나자 대부분의 T 1 묘목 두 개가 주로 루비 잎을 보였습니다. 우리 프로토콜은 멸균 조직 배양 단계를 우회하고, 씨앗이나 꽃이 없는 무성 생식생 식물에 대한 형태 재생 파이프라인을 제공합니다.

우리의 연구는 rorippa aquatica에서 잠수하던 에틸렌 경로 활성화에 관한 연구를 통해 육상 식물의 잠수 반응에 대한 중요한 통찰을 제공합니다. 이 방법은 빛과 호르몬 경로가 이 양서류 식물이 수중에서 변태하는 방식을 조사하는 문을 열어줍니다.