폴리카프로락톤 골격 및 hiPSC 유래 심장 세포의 용융 전기방사 쓰기를 사용한 3D 인간 심근 조직 생성

본 연구는 용융 전기 골격과 인간 iPSC 유래 심장 세포를 사용하여 생체 인식 3D 심장 조직을 개발하여 질병 모델링, 약물 테스트 및 재생 의학 응용 분야를 개선하는 것을 목표로 합니다. 줄기세포 심근세포에서 인간에 의한 보고는 미성숙 상태로 남아 있어 기능이 제한됩니다. 또한 심장 조직을 3D로 모델링하는 데 필요한 심각한 복잡성을 재현하는 것은 어려운 일입니다.

이 모델은 천연 심근을 더 잘 모방하여 질병 모델링, 약물 테스트 및 환자별 응용 분야를 위한 복잡한 3D 세포 외 기질 상호 작용을 가능하게 합니다. 2D 문화 및 동물 모델에 대한 보다 관련성 높은 대안을 제공합니다. 앞으로 우리의 연구는 심균학 모델을 조사하고, 3D 조직 성숙 프로토콜을 개선하고, 돼지와 같은 대형 동물 모델에서 전임상 심근 경색 치료를 위한 더 큰 구조를 개발하는 데 중점을 둘 것입니다.

시작하려면 주사기를 가압 질소 공급 파이프에 연결하고 가열 챔버 내부에 도입합니다. 용융 전기 방사 필기 장비를 켜고 온도 조절기를 챔버의 경우 섭씨 80도, 노즐의 경우 섭씨 65도로 설정합니다. 30분 후 프린트 헤드가 플레이트의 한쪽 가장자리 또는 원하는 위치에 위치할 때까지 컬렉터 플레이트를 이동합니다.

가열 챔버와 컬렉터 플레이트 사이의 거리를 z 평면에서 10mm로 수동으로 조정합니다. 전기장 공급 장치를 자동으로 연결하는 장비의 도어를 닫습니다. 질소 압력에서 전압을 7kV로 설정하고 23게이지 팁을 통해 압출하기 위해 두 개의 막대로 설정합니다.

소프트웨어에서 설계 G 코드를 로드하여 사각형 패턴 형상으로 스캐폴드를 인쇄합니다. 수집기 속도를 분당 1080mm로 조정합니다. 그런 다음 Cycle Start 버튼을 눌러 인쇄를 시작합니다.

인쇄가 완료되면 수집기에서 비계를 조심스럽게 제거합니다. 조직 제작을 위한 최종 골격을 얻기 위해 6mm 직경의 펀치를 사용하여 인쇄된 메쉬를 절단합니다. 산소 플라즈마로 5분 동안 골격을 처리합니다.

메쉬를 70% 에탄올에 30분 동안 담가 살균합니다. 멸균 증류수로 30분 동안 광범위하게 씻은 다음 건조시킵니다. 인간 iPSC 심근세포를 분리한 후, 조직 생성 배지에 세포 펠릿을 다시 현탁시키고 Neubauer 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다.

마찬가지로, 인간 iPSC 심장 섬유아세포를 분리한 후 조직 생성 배지에 세포 펠릿을 다시 현탁시키고 세포를 계수합니다. 새 튜브에 필요한 총 세포를 혼합하고 내용물을 Cell Mix라고 합니다. 그리고 실온에서 300G에서 5분 동안 원심분리기를 합니다.

그런 다음 필요한 부피의 조직 생성 배지에 세포 혼합물을 다시 현탁시킵니다. 하이드로겔 믹스를 생성하려면 실온에서 튜브에 필요한 양의 피브리노겐을 첨가하고 조심스럽게 혼합합니다. 하이드로겔 믹스를 폴리테트라플루오로에틸렌 표면에 파종하여 플레이트에 피브린이 부착되는 것을 방지합니다.

조직 부피의 절반을 피펫으로 만들어 한 방울로 남겨 둡니다. 각 방울 위에 폴리카프로락톤(PCL) 골격을 놓고 남은 부피를 골격에 추가합니다. 이제 필요한 양의 트롬빈을 추가하고 기포를 조심스럽게 피하면서 하이드로겔을 빠르게 혼합합니다.

조직을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하여 피브린 중합을 완료합니다. 멸균 핀셋을 사용하여 각 조직의 가장자리를 부드럽게 집어 아프로티닌이 보충된 조직 생성 배지가 들어 있는 12개의 웰 플레이트로 옮깁니다. 조직을 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다.

다음 날에는 2ml의 조직 유지 배지로 배지를 새로 고쳐 KSR 및 Y-27 잔류물을 제거합니다. 인간 iPSC 심근세포와 인간 iPSC 심장 섬유아세포의 8:2 혼합물을 피브린 하이드로겔에 파종하면 중합 후 1시간 이내에 골격 공극을 통해 세포가 균일하게 분포합니다. 컨포칼 면역형광 이미지는 비멘틴 표지된 인간 iPSC 심장 섬유아세포와 짝을 이룬 사르코메릭 액티닌으로 염색된 대다수의 인간 iPSC 심근세포와 PCL 골격과 상호 작용하는 3D 조직을 통한 세포의 혼합 세포 분포를 보여주었습니다.

인간 iPSC 심근세포는 규칙적인 간격의 육종 액티닌 단백질에 의해 잘 조직된 육종 구조를 나타냅니다. 세포는 2일차부터 자발적인 박동을 시작했으며, 7일차에는 분당 30회의 평균 박동 빈도로 전체 그물망에 걸쳐 안정적인 수축을 보여주었습니다. 시간이 지남에 따라 점진적인 감소가 관찰되어 14일째에는 17BPM에 도달했습니다.

그럼에도 불구하고 대사 활동은 7일째와 14일 사이에 안정적으로 유지되어 지속적인 세포 생존력을 확인했습니다. 마지막으로, 박동 조직의 추적점 분석은 초당 38마이크로미터의 수축 속도와 29마이크로미터의 수축 진폭을 보여주었습니다.