Name: Microcontact 인쇄를 통해 정렬 기능 심근 조직의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: 배우세요 마이크로콘택트 프린팅을 이용한 정렬 기능 심근 조직 생성 방법입니다. 배아줄기세포 유래 심장 전구세포를 분리하여 PDMS 기판에 배양함으로써 심장 재생의학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 Nanoscale 시스템을위한 센터 (CNS), 아니 NSF 상 아래에있는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 지원하는 국가 나노 기술 인프라 네트워크 (NNIN)의 회원에 부분에 수행되었다. ECS-0335765. CNS는 하버드 대학의 일부입니다.

정렬 기능 심근 조직을 생성 할 수있는 프로토콜은 세 가지 주요 부분으로 나눌 수 있습니다. 소프트 리소그래피 기술을 사용하여 micropatterned 마스터의 제조는 다음 프로토콜의 일부로 간주되지 않습니다하지만 기존의 방법 6을 기반으로 만들 수 있습니다. 1. PDMS 기판 위에 Fibronectin의 Microcontact 인쇄 <ol><li> 에이전트 비율과 가스를 제거하다하는 기포를 제거 할 수있는 건조기를 사용하여 어셈블리를 치료에 10시 1분 기지에 Sylgard 184 (다우 코닝) PDMS 엘라스토머를 섞는다. </li><li> ° C가 microtextured PDMS 스탬프를 얻는 65의 실내 온도 또​​는 4 시간 2 일 중 하나에 대해 20 μm 간격으로 구분하여 20 μm 폭, 2 μm 높이 산등성이와 이전에 제조 된 마스터,에 대한 PDMS 치료. </li></ol> * 건조기에 경화가 높은 공기 방울을 제거하는 것이 좋습니다. <ol start="3"><li> 유리 커버 용지 (예를 들면 위에 스핀 코트 PDMS15 μm 두께의도 얇고 PDMS 기판을 생산하는 전진의 스핀 Coater를 사용하여 2 분 5,000 rpm으로 22x22 mm). </li><li> 먼지와 먼지 입자를 제거하는 70 %의 에탄올과 우표를 청소합니다. 그 공기가 건조 보자. </li></ol> * 우표는 여러 번 사용할 수 있습니다 그러나, 정기적으로 PDMS 스탬프를 갱신하는 것은 시간이 지남에 따라 표면의 마모로 인해 권장합니다. <ol start="5"><li> 275 mTorr에서 1 분을위한 SPI 플라즈마 준비 II 플라즈마 클리너 및 프로세스의 장소 우표는 PDMS 표면은 친수성 ​​렌더링합니다. </li></ol> * 산소 플라즈마 처리는 감시해야합니다. 긴 치료 시간은 탄성체의 균열이 발생할 수 있습니다. <ol start="6"><li> 1 분에 70 %의 에탄올과 우표를 검사. 압축 공기를 신속하게 말린다. </li></ol> * 더 자세한 단계는 불임을 유지하기 위해 생물 안전 캐비닛에 수행해야합니다. <ol start="7"><li> F와 표면에 도장을 찍어 커버ibronectin 솔루션 (ddH 2 O 50 μg / ML). 이 adsorb 적어도 10 분 봅시다. </li><li> 우표에서 Fibronectin 솔루션을 흔들어서 압축 공기를 빠르게 건조. </li><li> 2 분에 우표와 PDMS 기판 사이의 등각 접촉을 설정하고 단단히 누르십시오. </li><li> ddH 2 O.있는 micropatterned 기판을 씻어 처음 사용 ° C 않는 4에 2 주 최대 ddH 2 O에 보관하십시오. ddH 2 O.에 저장 PDMS 우표 </li></ol> 2. 더블 트렌스 제닉 배아 줄기 세포 라인의 유지 보수 첫째, 배양 마우스 ES 세포에 대한 다음 미디어를 준비 : 마우스 배아 섬유 아세포의 (MEF) - 중간 : Dulbecco의 수정 된 이글 중간 (DMEM) 10 % 태아 소 혈청 (FBS) ES 세포 또는 차별화 급, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (P / S) 배아 줄기 세포 (ESC) - 중간 : DMEM 15 % FBS ES 세포 급1 % 비 필수 아미노산 (NEAA), 0.5 % P / S, 0.2 % 백혈병 억제 팩터 (난생), 0.0007 % 2 메르 캅토 에탄올 (2-ME) <ol><li> 멸균 0.1 % ddH 2 O의 젤리 37에서 adsorb 15 분 봅시다 ° C.와 코트 6 - 잘 접시 </li><li> 원뿔 튜브에 해동 나누어지는에서 50 ML PBS에 MEFs를 추가하고 5 분 1,000 RPM에서 그들을 원심 분리기. MEF - 중간에 Resuspend MEFs. </li><li> 우물에 흡착, 기음 초과 젤리와 추가 MEFs 후. MEFs 일일 첨부 할 수 있습니다. </li></ol> * 3 6 - 잘 접시에 10,000,000 MEFs의 충분 나누어지는. <ol start="4"><li> MEFs을 첨부했을 때, 원추형 튜브에서 해동 나누어지는에서 50 ML PBS에 ES 세포를 추가하고 5 분 1,000 RPM에서 그들을 원심 분리기. Resuspend의 ES의 ESC - 매체와 MEFs가 포함 된 우물에 추가의 셀. ESC - 중간의 문화 ES 세포는 합류 할 때까지 가실 수 있습니다. </li></ol> * 일단 ES 세포는 passaging는 requ이 합류를하고 있습니다 도달전면에 자라 난을 피하기 위해와 ES 세포 식민지를 유지하기 위해 ired. <ol start="5"><li> passaging에 ES 세포를 준비합니다. 기음 ESC - 매체와 멸균 PBS로 한 번 씻는다. </li><li> PBS를 대기음과 트립신 500 μl를 추가합니다. 37 번 프로세스 3.5 분 ° C. </li><li> ES 세포 식민지를 해제하고 ESC-매체 500 μl로 중화하기 위해 여러 번 다운 트립신 솔루션을 피펫합니다. </li><li> 원하는 비율에 따라 통로 ES 세포는있는 다른 잘에 대한 예를 전송 33 μl은 이전에 통과 30분의 1에 MEFs을 준비했습니다. ESC - 중간에 ES 세포를 유지하고 있습니다. </li></ol> * 30분의 1의 통과 비율은 ES 세포는 3 일 이내에 합류에 도달 할 수 있습니다. 통로 ES 세포는 체외에서 차별화 일정에 따라. 3. 더블 트렌스 제닉 배아 줄기 세포 라인과 심장 Progenitors의 절연 및 심는의 체외 차별화에 먼저, followi을 준비NG 미디어는 ES 세포의 체외에서 차별화가 필요 : 적응 - 중간 : Iscove의 수정 된 Dulbecco의 중간 (IMDM), 15 % FBS ES 세포 학년, 1 % NEAA, 0.5 % P / S, 0.2 % 난생, 0.0007 % 2-ME 차별화 - 중간 : IMDM, 15 % FBS 차별화 급. 1퍼센트 NEAA, 0.5 % P / S, 0.1M의 아스코르브 산의 ​​0.35 %, 0.0007 % 2-ME <ol><li> ES 세포는 합류에 도달했을 때 체외 차별화에 시작합니다. 멸균 0.1 % ddH 2 O의 젤리 37에서 adsorb 15 분 봅시다 ° C.와 코트 10cm 문화 요리 </li></ol> *에서 체외 분화 과정의 기간을 인식합니다. 심장 progenitors은 분리 할 수 있습니다 때까지 8 일이 소요됩니다. 이에 따라 실험을 계획합니다. <ol start="2"><li> 이전으로 수확 ES 세포. 흡착, 기음 초과 젤리 후 및 조리 문화에 ES 세포 현탁액의 약 1/3-1/2 추가적응 - 미디어를 포함하는 요리. 2 일간 문화 세포. </li></ol> * 당신의 실험에 따라 적응을위한 ES 세포의 양을 선택합니다. <ol start="3"><li> 수확은 1을 사용 PBS​​를 포함하는 50 ML 원뿔 튜브에 ES 세포를 적응. 트립신 5 ML. 5 분 1,000 rpm으로 dissociated ES 세포를 원심 분리기와 차별화 - 중간에서 그들을 resuspend. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 15cm 문화 요리 10 μl 드롭 당 약 1,000 세포의 embryoid 기관 (EBS)를 확인합니다. 37 2.5 일 동안 방울을 걸려으로 접시와 문화 EBS로 바꾸 ° C. </li><li> 2.5 일 후에 한 37 더 3.5 일 동안 차별화 - 미디어와 문화를 사용 ° C.에 6-8 15cm 문화 요리 수영장 EBS </li><li> 3.5 일 후, 원추형 50 ML 튜브에 EBS를 수집하고 약 5 분의 바닥에 가라 앉을 보자. 표면에 뜨는을 빨아 및 멸균 PBS와 EBS을 씻는다. EBS는 appr에 대한 아래에 다시 침몰하자oximately 5 분 거리에 있습니다. </li><li> 2를 처리하여 EBS를 떼어 놓다. 37 번 물 목욕에서 2 분에 트립신의 5 ML은 ° C 부드럽게 튜브를 흔들어. 그런 다음, 2를 추가합니다. 5 트립신 솔루션에 멸균 PBS의 ML과 10 ML 혈청 학적 피펫으로 세포 클러스터를 무너 뜨리는 약 8-10 시간을 위아래로 피펫. FACS 버퍼의 10 ML은 7.5 % PBS에서 FBS ES 세포 또는 차별화 급 및 0.01 % DAPI를 포함하는과 트립신을 중화. </li><li> 5 분 1,000 rpm으로 dissociated EBS를 원심 분리기와 FACS 버퍼의 약 1 ML에서 그들을 resuspend. 1 ML의 피펫으로 세포 클러스터를 무너 뜨리는 약 8-10 시간을 위아래로 피펫. </li></ol> * dissociated EBS의 예상 금액에 따라 FACS 버퍼를 추가합니다. 너무 높은 집중 세포는 FACS 동안 방해 할 수 있으며 너무 낮은 농축 전지는 불필요 FACS 시간을 연장 할 수 있습니다. <ol start="9"><li> 얻기 위해 35 μm 셀 스트레이너와 살균 내내 아래로 튜브에 세포를 전송하나의 세포 현탁액. </li><li> 정렬 차별화 된 ES 세포는 FACSAria 흐름 Cytometer를 사용하고 CVP의 인구를 정​​화 얻습니다. </li></ol> * 우리는 매우 정제 된 색 세포를 분리 할 수있는 여러 단계 게이팅 전략을 개발했습니다. 간단한에서, 우리는 앞으로 분산 진폭 (FSC-A)과 측면 분산 진폭 (SSC-A) (그림 1A)에서 첫 번째 게이트. 이것은 우리가 세포의 잔해로부터 전체 세포를 분리 할 수 있습니다. 우리는 다음 FSC-A 및 앞으로 분산 - 폭 (FSC-W) (그림 1b)에 게이트. 이것은 우리가 doublets 및 기타 휴대 집계에서 셀 singlets를 분리 할 수 있습니다. 우리는 다음 SSC-A와 사이드 분산 - 폭 (SSC-W) (그림 1C)에 게이트. 이 셀 singlets의 순도를 증가시킨다. 우리는 DAPI에 게이트가 아닌 가능한 세포 (그림 1D)에서 가능한 세포를 (DAPI - 제외) 격리 얼룩. 우리는 다음 Phycoeryhthrin 진폭 (PE-A)와 PE-Cyanine 염료 7 진폭 (PE-Cy7-A) 진정한 붉은 긍정적 (R를 얻을 수에 대한 게이트 + </&gt;를 한모금)와 진실 (R 붉은 부정적 -) 세포와 autofluorescent 붉은 부정적인 세포를 (그림 1E)을 제외 할 수 있습니다. R +와 R - 이러한 인구 (그림 1 층에서 세포 + - 셀 Fluorescein의 isothiocyanate의 진폭 (FITC-A)와 PE-A 진정한 녹색 긍정적 (G +), 그리고 진실 (G) 녹색 부정적인를 정렬하려면에 별도로 한 후 출입을 금지 아르 1G). 다음과 같이 셀의 4 인구에있는이 결과 : R + G +, R + G - R - G +와 R - G - (그림 1H). <ol start="11"><li> 10 분에 ddH 2 O의 1 % Pluronic F-127과 micropatterned 기판을 패시베이션. 그런 다음, 멸균 PBS 사람에게 3 배 씻는다. </li></ol> * Pluronic F-127을 차단하는 세포 접착 계면 활성제입니다. 이 micropatterned 지역에 세포 접착의 제한을 지원합니다. <ol start="12"><li> 무늬가 지역 주변 PDMS의 가스켓을 첨부단단히 누르십시오. Fibronectin micropatterned 기판 위에 그런 다음, 시드 CVP. </li></ol>

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</ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

이 프로토콜에서는, 우리는 그들을 정렬하고 심장 myocyte 같은로드 모양을 할 수 있습니다 어떤 cardiogenic progenitors의 정화 인구를 분리하고 micropatterned Fibronectin 기판에 씨앗을에 할 수있는 방법을 제시했다. 일반 세포 조직은 심근 조직에 대한 특히 정상 조직 기능 8,10에 대한 중요합니다. 심장 근세포는 비 등방성 셀 배열을 형성 할 때 향상된 기계적 11,12 및 electrophysiological 속성 11,13을 개발하기 위해 표시되었습니다. micropatterned Fibronectin 기판에 배양 심장 progenitors은 체외에서 막대 모양의 심근 세포로 분화 이후,이 심장 조직 생체 공학에서 apivotal 단계를 나타냅니다. Microcontact 인쇄는 체외에서 심근 조직을 닮은 2 차원 템플릿을 생성하는 데 사...

의료 치료의 최근 발전에도 불구하고, 고급 심장 마비는 선진국에서 사망률과 병적 상태의 주요 원인으로 남아 있습니다. 임상 증후군은 기능성 심근 조직의 손실과 영향을받는 개인의 신진 대사 요구를 충족 할 수있는 실패 심장의 이후 무능력으로부터 나옵니다. 심장이 제한된 재생 능력을 가지고 있기 때문에, autologous 심장 이식은 직접 손실 기능 심장 조직을 보충하기위한 유일한 현재 임상 적으로 받아 치료입니다. 기증 마음의 제한된 수의 및 장기 면역 억제 치료를 위해,이 치료의 넓은 확산 사용을 배제 할 필요 포함한 심장 이식의 상당 단점. 결과적으로, 의료 치료는 심장 질환 환자에 대한 치료의 의지가되는 것이었습니다. 약물 개발의 주요 과제는 정확하게 체외에서 정상과 병에 걸린 심근 생리를 요점을 되풀이 세포 assays의 식별합니다. <html> 줄기 세포 생물학 및 조직 공학 기술의 최근 컨버전스는 심장 재생을위한 새로운 유망 도로를 발생시킵니다. 재생 환자 특정 소스에서 기능성 심근 조직을 생성하면이 분야의 주요 사전 것입니다. 이 약물 개발 및 발견을위한 질병 특정 세포 assays의 개발을 허용하고 심장 재생 의료의 기반을 마련합니다. 인간 배아 줄기 (ES) 세포와 더 크게, 인간 유도 만능 줄기 (IPS) 세포는 심실 전구 세포와 성숙 심실 근세포의 잠재적 재생 환자 특정 소스를 나타냅니다. 줄기 세포 생물학 및 조직 공학 전략의 조합은 약물 발견 또는 고급 심장 마비의 치료를위한 심장 재생 방법으로 세포 assays의 개발에 사용할 수 있습니다 체외에서 기능 심장 조직을 생성하여이 문제를 해결합니다. _content &quot;&gt; 심장 재생의 중심 과제는 최적의 세포 유형의 식별되었습니다. 다양한 소스의 다른 multipotent cardiogenic 전구체가 발견되었습니다 있지만, 세포의 다양한 배열을, 그러나 지금까지 세포의 식별을 1 연구 한 예를 myogenic 세포의 운명에 대한 헌신과 같은 중요한 요구 사항을 충족 소스는 기능 심근 조직에 생체 나 생체과 구성에 확장 할 수있는 용량의 유지 보수 중심 문제가이 것으로 증명되었습니다. 우리는 이전에 두 유전자 변형 손쥐 시스템을 설명했습니다 그 높은 체외에서 차별화 ES 세포에서 헌신적 인 심실 progenitors (CVP)의 인구를 정화의 고립을 할 수 있습니다. 우리는 MEF2c 유전자의 Isl1에 의존 증강의 통제하에 dsRed 빨간색 형광 단백질을 표현하는 소설 두 유전자 변형 마우스를 생성하고 의 통제하에 강화 된 녹색 형광 단백질심장 별 Nkx2.5 증강. 이 두 색의 형광 기자 시스템, MEF2c 및 Nkx2.5 유전자의 표현에 따라 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)에 의해 분리 될 수 개발 ES 세포에서 첫 번째와 두 번째 심장 필드 progenitors을 기반으로합니다. CVP는 심장 조직 재생을 위해 큰 약속을 제공하는 심근 마커 및 구조와 기능 특성 3의 표현 패턴에 따라 심장 근세포 유사. 조직 공학의 분야에서 많은 발전이있었습니다했지만, 원시 세포 구조를 모방하는 것은 중요한 도전 남아있다. 이 문제를 해결하기 위해 기존의 방법은 체외에서 세포와 퍼 뜨리고 생물학적 또는 합성 공사장 공중 발판이 포함되어 있습니다. 빠른 저하, 제한된 물리적, 기계적 안정성과 낮은 세포 밀도 1,4,5 등의 공사장 공중 발판의 단점의 숫자로 인해, 우리는 비계없는 조직을 처리하려고 시도했습니다. Alt 키무릎 심장 세포는 세포 외 기질 단백질의 분비에 의해 지역 microenvironment을 수정할 수 있습니다, 그들은 세포 신호의 부재에로드 모양의 심장 근세포에 자신을 정리하는 더 제한된 용량을 갖추고 있습니다. 따라서, 기능 심근 조직을 구성하는 세포 적절한 공간 및 생물학적 단서를 제공하는 템플릿이 필요합니다. Microcontact 인쇄 정확하게 정렬 기능 심근 조직의 생성에 중요한 모든있는 세포 모양, 조직 및 기능 6-8을 제어 할 수있는 간단하고 저렴한 방법을 제공하여이 문제를 해결합니다. 그것은 정확한 패턴에 PDMS 기판에 세포 외 기질 단백질의 증착을 가능하게하므로 spatially 세포 접착에 영향을 미치는 2 μm 9 다운 이르기까지 기능 크기로 microtextured Polydimethylsiloxane (PDMS) 우표의 사용을 포함한다. 여기, 우리는 줄기 cel과 조직 생체 공학 기술을 결합하는 제안리터 생물학은 비 등방성 기능 심근 조직을 생성합니다. 따라서, 우리는 여기에 다음에 대한 최근 게시 된 접근 방식을 보여줍니다 : (1) 정렬 심근 조직에 대한 템플릿의 생성에 대한 microcontact 인쇄에 의한 PDMS 기판에 micropatterned 단백질 표면의 생성 (2) 높은에서 심장 progenitors을 정화의 분리 ES 세포는 체외에서 차별화, 그리고 (3) 생성하는 두 기술의 결합 기능 심근 조직을 정렬.

<table border="1"><tbody><tr><td> 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> L-아스코르브 산 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A4544 </td><td> ddH 2 O에 0.1M 솔루션을 준비 </td></tr><tr><td> 건조기, 진공 10 인치 </td><td> 노바 테크 인터내셔널 </td><td> 55,206 </td><td></td></tr><tr><td> 4 &#39;, 6 Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) </td><td> 생명 기술 </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정 된 이글 매체 </td><td> 열 과학 </td><td> SH30022.01 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14,190 </td><td></td></tr><tr><td> FACSAria II 흐름 Cytometer </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청ES 세포 수준 </td><td> 쌍둥이 바이오 제품 </td><td> 100-106 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 차별화 급 </td><td> 쌍둥이 바이오 제품 </td><td> 100-500 </td><td></td></tr><tr><td> 소 플라즈마에서 Fibronectin </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> F4759 </td><td> ddH 2 O 1 MG / ML에 Solubilize </td></tr><tr><td> Fisherfinest 프리미엄 커버 유리 22x22mm </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-548-B </td><td></td></tr><tr><td> 돼지의 피부에서 젤라틴 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G1890 </td><td> ddH 2 O에서 0.1 % 솔루션을 준비 </td></tr><tr><td> 전진의 스핀 Coater </td><td> 전진 연구 주식회사 </td><td> PWM32-PS-CB15 </td><td></td></tr><tr><td> Iscove의 수정 된 Dulbecco의 매체 </td><td> 열 과학 </td><td> SH30228.01 </td><td></td></tr><tr><td> 백혈병 억제 팩터 </td><td> 본인난생-분비 세포 라인에서 - 준비 </td><td></td><td> 500x 재고 솔루션을 준비 </td></tr><tr><td> 가상 비 필수 아미노산 </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - 메르 캅토 에탄올 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 배아 섬유 아세포의 </td><td> 일 12-15 마우스 배아에서 수확 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P2443 </td><td> ddH 2 O에서 1 %의 솔루션을 준비 </td></tr><tr><td> 라운드 - 어쨌든 튜브 35 μm 셀 스트레이너로 </td><td> BD Biosciences </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> SPI 플라즈마 준비 II 플라즈마 클리너 </td><td> SPI 용품 </td><td> 11005-AB </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard184 실리콘 엘라스토머 키트 </td><td> 다우 코닝 </td><td> 184 SIL ELAST KIT 0.5KG </td><td></td></tr><tr><td> 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Gibco </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> 진공계 </td><td> SPI 용품 </td><td> 11019-AB </td><td></td></tr></tbody></table>

microcontact 인쇄를 통해 정렬 기능 심근 조직의 생성

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

고급 심장 마비가 가능한 및 / 또는 모든 기능 심장 근육 세포의 손실로 인해 발생하는, 주요 부족한 임상 도전을 나타냅니다. 최적의 약물 치료에도 불구하고, 심장 마비는 선진국에서 사망률과 병적 상태의 주요 원인을 나타냅니다. 약물 개발의 주요 과제는 정확하게 체외에서 정상과 병에 걸린 인간의 심근 생리를 요점을 되풀이 세포 assays의 식별합니다. 마찬가지로, 재생 심장 생물학의 주요 과제는 임상 적으로 관련성이 높은 수량의 환자 별 심장 progenitors의 식별 및 격리 중심으로. 이러한 세포는 따라서 spatially 세포 접착을 제어하는 기하학적 단서를 제공. Microcontact 인쇄는 심장의 구조 조직과 유사한 정확한 micropatterned 단백질 형태의 생성을 허용 네이티브 심장 조직 구조 유사 기능 조직으로 조립해야합니다. 여기에우리는 높은 체외, 세포 외 기질 단백질과 micropatterned 세포 성장 표면의 생성에 차별화 만능 줄기 세포로부터 심근 세포를 정화의 고립에 대한 우리의 접근 방식을 설명하고, 비 등방성 심근 조직에 줄기 세포 유래 심장 근육 세포의 조립.

체외 차별화 된 ES 세포에서의 FACS - 정화는 progenitors의 뚜렷한 인구 (그림 1)을 공개했다. micropatterned Fibronectin의 존재는 지속적으로 Fibronectin 라인 (그림 2)의 전체 전송을 표시 immunofluorescence 현미경으로 확인되었다. G + 인구 - Fibronectin micropatterns로 FACS 절연 progenitors의 도금은 R + G +와 R의 일부 정렬되었습니다. Pluronic F-127 세포 접착의 지원 차단기가 사용 된로했지만, R + G - 그리고 R - G - 인구는 Fibronectin의 비 등방성 구조를 존중하고 인접 단백질 라인 (그림 3) 사이의 공간으로...

정렬 심근 조직의 생성 임상 유용한 목적에 줄기 세포 생물학의 최근 발전을 조절하기위한 중요한 요구 사항입니다. 여기에 우리는 세포의 형태와 기능의 정확한 제어를위한 microcontact 인쇄 방법을 설명합니다. 심장 progenitors을 파생 배아 줄기 세포의 높은 정화 인구 사용하여, 우리는 비 등방성 기능 심근 조직을 생성합니다.

Microcontact 인쇄를 통해 정렬 기능 심근 조직의 생성

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

다음 실험의 목적은 마이크로 접촉 인쇄(micro contact printing)를 통해 정렬된 기능적 심근 조직을 생성하는 것입니다. 이는 먼저 폴리디메틸실록산(poly dimethyl siloxane) 기판 위에 피브로넥틴(fibronectin)을 마이크로 접촉 인쇄함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 이중 형질전환.배아줄기세포주를 in vitro에서 분화시킨 후 형광 활성화 세포 분류법(fluorescence activated cell sorting)을 통해 분리함으로써, 강력한 심장 형성 능력을 가진 전구세포의 고순도 집단을 얻을 수 있습니다. 다음으로, 분리된 심장 전구세포를 마이크로 패턴 PDMS 기질 위에 파종하여 세포를 정렬시키고 심근세포와 유사한 막대 모양이 되도록 유도합니다. 분석 결과 및 면역형광 분석을 통해 심장 전구세포의 성공적인 분리와 등방성 성장이 확인되었습니다.등방성 심근 조직을 생성하면 질환 특이적 세포 분석법을 통한 약물 개발 및 발견의 가능성을 높임으로써 줄기세포 생물학 및 조직 바이오공학 분야를 발전시키는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 심장 재생 의학의 토대를 마련할 수 있습니다. 먼저, PDMS 엘라스토머를 경화제와 10:1 비율로 혼합하고 잘 섞어줍니다.기포를 제거하기 위해 데시케이터를 사용하여 어셈블리를 탈기합니다. 20 micron 너비와 2 micron 높이의 툴 리지(tool ridge)가 20 micron 간격으로 배치되어 이전에 제작된 마스터에 PDMS를 붓고, 실온의 데시케이터에서 이틀 동안 경화시켜 미세 질감 PDMS 스탬프를 얻습니다. 그 후 플라스마 세정기를 사용하여 PDMS 스탬프 표면을 친수성으로 처리합니다.스탬프를 70% ethanol로 1분간 멸균합니다. 생물안전작업대 내에서 압축 공기로 빠르게 건조합니다. 멸균된 스탬프 표면을 fibronectin 용액으로 덮고, 흡수 후 최소 10분 동안 방치합니다.스탬프에서 피브로넥틴 용액을 털어내고 압축 공기로 빠르게 건조합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 스탬프와 이전에 준비한 PDMS 코팅 유리 커버스립 사이에 2분 동안 정밀하게 접촉시킨 후 단단히 누릅니다. 마이크로 패턴 기질을 증류수로 헹굽니다.즉시 사용하지 않을 경우, 4 °C에서 최대 2주 동안 증류수에 보관하십시오. 6-웰 플레이트를 증류수에 희석한 멸균 0.1% gelatin으로 코팅하고 37 °C에서 15분 동안 흡수시킵니다. 이 시간 동안, 원심분리관에 PBS 50 mL를 넣고 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts) 분주물을 추가하여 세포를 준비하십시오. 1000 RPM에서 5분 동안 원심분리한 후, 이를 meth 배지에 다시 현탁하십시오.배양 시간이 지나면 과잉의 젤라틴을 흡입하여 제거하고 웰에 MES를 첨가합니다. MES가 부착될 수 있도록 하루 동안 둡니다. 원추형 튜브에 PBS 50 milliliters를 넣고 적정 분량의 배아줄기세포 또는 ES 세포를 추가하여 준비한 후 원심분리합니다.ES 세포를 1000 RPM에서 5분 동안 원심분리한 후 ESC 배지에서 재현탁합니다. 마이토콘드리아가 포함된 웰에 ES 세포를 첨가하고, ES 세포가 합류(confluence) 상태가 될 때까지 ESC 배지에서 배양합니다. 먼저 ESC 배지를 흡입하여 제거하고 멸균 PBS로 세포를 1회 세척합니다.그 다음 PBS를 흡입하여 제거하고, 웰(well)에 500 µL의 trypsin을 첨가합니다. 플레이트를 37 °C에서 3분 30초 동안 배양합니다. trypsin 용액을 피펫으로 여러 번 상하로 섞어줍니다.먼저 ES 세포 콜로니를 해리합니다. 그런 다음 웰에 ESC 배지 500 µL를 첨가하여 트립신 용액을 중화합니다. 필요한 비율에 따라 ES 세포를 분주합니다. 여기서는 ES 세포를 1:30 비율로 계대 배양하여 3일 이내에 컨플루언스 상태에 도달하도록 합니다.ES 세포가 합류(confluence)에 도달하면 인비트로(in vitro) 분화를 시작합니다. 먼저 10cm 배양 접시를 증류수에 희석한 멸균 0.1% 젤라틴으로 코팅하고 37°C에서 15분 동안 흡수시킵니다. 이 시간 동안 이전과 동일한 방법으로 ES 세포를 수확합니다.15분이 경과하면 과잉의 젤라틴을 흡입하여 제거하고, 배양 접시에 담긴 적응 배지에 E ES 세포 현탁액의 약 3분의 1에서 절반 정도를 첨가합니다. 적응 배지에서 세포를 이틀 동안 배양한 후, 1.5 mL의 trypsin을 사용하여 적응된 ES 세포를 PBS가 담긴 50 mL 원심 분리관에 수확합니다. 1000 RPM에서 5분 동안 원심 분리하고, 분화 배지에 다시 현탁합니다.15 centimeter 배양 접시에 분화 배지 10 microliter 방울당 약 1000개의 세포로 배아체(embryo bodies, EBS)를 형성합니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 플레이트를 뒤집어 배양합니다. EBS는 37 degrees Celsius에서 2.5일 동안 현탁 배양(hanging droplets)합니다.2.5일 후, 6~8개의 15cm 디쉬에 담긴 EBS를 분화 배지를 사용하여 하나의 디쉬로 옮기고 3.5일 동안 추가로 배양합니다. 다시 3.5일이 지나면 EBS를 50mL 코니컬 튜브에 수집하고, 모든 EBS를 수집하기 위해 플레이트를 멸균 PBS로 한 번 세척합니다. 그다음 EBS가 바닥으로 가라앉을 때까지 약 5분 동안 둡니다.그런 다음 상층액을 제거하고 EBS를 멸균 PBS로 세척합니다. EBS가 다시 바닥에 가라앉을 때까지 약 5분 동안 둡니다. trypsin 2.5 milliliters를 첨가하여 EBS를 해리시키고, 37 °C의 항온수조에서 튜브를 2분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다.그런 다음 멸균된 PBS 2.5 milliliters를 트립신 용액에 첨가하고, 10 milliliter serological Pipette로 약 8~10회 파이펫팅하여 세포 응집체를 분해합니다. 7.5% E ES cell 또는 분화 등급 FBS와 0.01% DPI가 포함된 PBS 기반의 fax buffer 10 milliliters를 사용하여 트립신을 중화시킨 후, 분리된 EBS를 1000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다. 이어서 상층액을 제거하고 약 1 milliliter의 fax buffer를 첨가한 뒤, 1 milliliter 파이펫으로 약 8~10회 파이펫팅하여 세포 응집체를 분해합니다.단일 세포 현탁액을 얻기 위해 35 micron 세포 스트레이너가 장착된 멸균 라운드 바텀 튜브로 세포를 옮깁니다. aria 유세포 분석기를 사용하여 분화된 ES 세포를 분류하고, 정제된 전전환 심실 전구세포 집단을 확보합니다. 자세한 게이팅 전략은 프로토콜의 텍스트 부분을 참조하십시오.증류수에 1%onic F1 27을 희석하여 마이크로 패턴 기판을 10분 동안 처리합니다. 그 후 멸균된 PBS로 세 번 세척합니다. 패턴 영역 주변에 PDMS 가스켓을 부착하고 단단히 누릅니다.그 다음, 심장 전구세포를 피브로넥틴 마이크로 패턴 기판 위에 파종합니다. 다음 이미지들은 인 비트로(in vitro) 분화 6일 차 ES 세포의 대표적인 유세포 분석 차트입니다. 이 이미지는 전방 산란 진폭 FSCA와 측방 산란 진폭 SSCA에 대한 게이팅을 보여줍니다.이를 통해 전체 세포를 세포 파편으로부터 분리할 수 있습니다. 여기서는 FSCA와 전방 산란광 폭 FSCW에 대한 게이팅 과정이 나타나 있습니다. 이를 통해 더블렛 및 기타 세포 응집체로부터 단일 세포(singlet)를 분리할 수 있습니다.이 이미지는 SSCA와 SSCW를 이용한 산란광 게이팅을 보여줍니다. 이를 통해 단일 세포(singlets)의 순도를 높일 수 있습니다. 또한, 이 이미지는 FSCA와 DPI 염색을 이용한 게이팅을 보여주며, 이를 통해 비생존 세포로부터 생존 가능한 DPI 음성 세포를 분리할 수 있습니다.여기에서는 DI seven PE SI seven에서 fico, rine, PE 및 PE cyan에 대한 게이팅이 나타나 있습니다. 이를 통해 진성 red 양성 및 진성 red 음성 세포를 얻고, 자가형광 red 음성 세포를 제외할 수 있습니다. 이 이미지들은 red 양성 및 red 음성 집단 내에서 진성 green 양성 및 진성 green 음성 세포를 분리할 수 있도록 하는 fluorescein isothiocyanate amplitude fit CA 및 PEA에 대한 게이팅을 보여줍니다.in vitro 분화된 ES 세포의 FACS 정제 결과, 이 유세포 분석 도표에서 보는 바와 같이 네 가지의 뚜렷한 전구세포 집단이 확인됩니다. 네 가지의 뚜렷한 전구세포 집단은 red 양성 green 양성, red 양성 green 음성, red 음성 green 양성, 그리고 red 음성 green 음성입니다. 이 대표적인 면역형광 현미경 이미지는 마이크로 패턴화된 피브로넥틴 기판을 보여줍니다.스케일 바는 80 microns를 나타냅니다. 이 이미지는 배아 유래 facts(상단 패널의 분리된 전구세포)와 피브로넥틴 마이크로 패턴 위에서 5일간 추가 배양한 ESL 유래 facts(하단 패널의 분리된 전구세포)의 대표적인 면역형광 현미경 사진을 보여주며, 핵은 파란색으로 염색되었습니다. S-M-M-H-C-A는 빨간색으로 염색되었으며, sarcomeric alpha actinin은 녹색으로 나타납니다.스케일 바는 40 microns입니다. 이 영상을 시청한 후에는 심장 전구세포라는 재생 가능한 세포원으로부터 이방성 기능성 심근 조직을 생성하는 방법에 대해 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 프로토콜에서는 모세관 힘 리소그래피를 사용하여 두 개의 별개의 고분자 재료로 만든 생체 모방 심장 세포 배양 하층의 제작을 보여줍니다.  설명된 방법은 in vitro 및 in vivo 응용 프로그램을 위해 거시적 심장 조직의 구조와 기능을 엔지니어링할 수 있는 확장 가능하고 비용 효율적인 기술을 제공합니다.

심장 조직 공학을위한 모세관 력 리소그래피

이 원고는 표면 마커 발현과 세포 분류를 사용하여 정의된 공학적 심장 조직의 생성을 설명합니다. 그런 다음 정의된 조직을 다중 조직 생물반응기에서 사용하여 심장 세포 치료의 메커니즘을 조사하여 기능적이면서도 제어된 인간 심장 모델 시스템을 제공할 수 있습니다.

정의 인간 공학 심장 조직의 건설 심장 세포 치료의 메커니즘을 연구하는

이 프로토콜은 생체 재료를 사용하지 않고 심장 ​​조직의 3D bioprinting을 설명합니다. 3D bioprinted 심장 패치는 구성 요소 spheroids의 기계적 통합을 나타내며 심장 조직 재생 및 심장병의 3D 모델로서 매우 유망합니다.

3D Bioprinting을 이용한 Spheroids의 기계적 통합을 보여주는 심장 조직의 생성

우리 어디 보조 세포 유형 수 더 시드할 수이 microfibrous 구조 vascularized 조직 및 organoids를 생성 하는 틈새 공간으로 microfibrous 혈관 침대 엔지니어링에 대 한 미세 bioprinting 전략에 따라 일반화 된 프로토콜을 제공 합니다.

공학에 대 한 미세 Bioprinting 나가도록 조직 및 Organoids

이 프로토콜 만족 구조적 무결성 및 동기 박동 동작 3 차원 비 계 없는 심장 조직을 만들 순 형 기반 방법을 설명 합니다.

비 계-무료 3 차원 심장 조직 창조의 그물 형 기반 방법

여기 선물이 심장 생리학을 모방 하는 전기 및 기계적 자극을 사용 하 여 셀 인구를 교육 하기 위한 프로토콜. 이 전기 자극 치료 세포의 cardiomyogenic 잠재력을 강화 하 고 더 세포 치료, 질병 모델링 및 의약품 심사를 위한 유망한 전략 이다.

셀의 Cardiomyogenic 잠재력 향상을 동시 전기 및 기계적 자극

본 프로토콜은 인간 유도만능 줄기 세포에서 유래한 심혈관 세포를 포함하는 메쉬 모양의 엔지니어링 된 심장 조직을 생성하여 심장 질환에 대한 세포 이식 요법의 조사를 허용합니다.

생체 내 심근 수리를 위한 인간 iPS 세포에서 파생된 메쉬 모양의 조작된 심장 조직의 준비

여기서, 우리는 미리 분화된 인간 유도만능 줄기 세포 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포로 구성된 3D 자가 조립 심장 미세 조직 배열을 생성하는 사용하기 쉬운 방법론을 기술합니다. 심장 미세 조직을 생성하는 기술을 요구하는 이 사용자 친화적이고 낮은 세포는 질병 모델링 및 약물 개발의 초기 단계를 위해 구현될 수 있습니다.

인간 iPSC 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포를 사용하여 3D 심장 미세 조직 배열의 제조

이 프로토콜의 목표는 심장 조직 공학, 약물 스크리닝 및 질병 모델링을 위해 심장 섬유아세포(CFs)와 공동 배양된 줄기 세포 유래 심근세포(CFs)로 구성된 고도로 정렬된 인간 심장 조직의 3차원(3D) 미세유체 모델의 개발을 설명하고 시연하는 것이다.

미세 유체 플랫폼 내에서 3D 조직 된 인간 심장 조직 개발

빛을 사용하여 심장 세포와 조직을 제어하면 비접촉 자극이 가능하여 세포의 자연 상태와 기능을 보존할 수 있으므로 기본 연구와 치료 응용 분야 모두에 유용한 접근 방식이 됩니다.

비유전적 광학 자극을 통한 Ca2+ 전파를 연구하기 위한 심장 미세생리학적 시스템

용융 전기방사 쓰기(MEW), 폴리카프로락톤(PCL) 스캐폴드 및 피브린 하이드로겔을 hiPSC 유래 심근세포 및 섬유아세포와 결합한 3D 심근 조직을 생성하기 위해 재현 가능한 방법이 제시됩니다. 이 기술은 스캐폴드 아키텍처를 정밀하게 제어하며 전임상 약물 테스트 및 심장 질환 모델링에 적용할 수 있습니다.

폴리카프로락톤 골격 및 hiPSC 유래 심장 세포의 용융 전기방사 쓰기를 사용한 3D 인간 심근 조직 생성

배우세요 마이크로콘택트 프린팅을 이용한 정렬 기능 심근 조직 생성 방법입니다. 배아줄기세포 유래 심장 전구세포를 분리하여 PDMS 기판에 배양함으로써 심장 재생의학 연구에 활용할 수 있습니다.

Microcontact 인쇄를 통해 정렬 기능 심근 조직의 생성

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