정의 인간 공학 심장 조직의 건설 심장 세포 치료의 메커니즘을 연구하는

이 절차의 전반적인 목표는 정의된 세포 조성의 인간 공학적 심장 조직을 생성하는 것입니다. 이 방법은 변동성 및 심장 분화 효율의 제어, 그리고 특정 세포 유형이 심장의 수축 기능에 미치는 영향의 이해를 포함하여 심장 조직 공학 분야의 주요 과제들을 해결할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 최종 결과물이 제어되고 정의된 조성을 갖는 인간 공학적 심장 조직이라는 점입니다.

이 기술의 복제 연구는 심장 질환 치료로 확장될 수 있는데, 이는 정의된 조직이 치료적 중재를 평가할 수 있는 새롭고 생물학적으로 유의미한 바이오메디컬 스크리닝 플랫폼을 제공할 수 있기 때문입니다. 이 방법은 새로운 심장 치료제에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 공학적 심장 조직 시스템을 통해 심장 세포 치료의 기전을 이해하는 데에도 활용될 수 있습니다. 인간 배아줄기세포 유래 심근세포 배양물에서 시작하여, 세포를 PBS로 한 번 세척한 후 0.04% trypsin-EDTA 1 mL를 첨가합니다.

세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 10분 동안 배양합니다. 세포가 배양되는 동안, trypsin 중화 용액 6 mL에 ROCK inhibitor 12 µL를 첨가합니다. 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내 6-well 플레이트의 각 웰에 중화 용액 1 mL를 첨가합니다.

각 웰의 모든 세포를 하나의 15-milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다. 3-milliliter 부피의 PBS로 6개 웰을 모두 세척하고, 이 세척액을 튜브 안의 세포와 합칩니다. 세포를 펠릿화하기 위해 튜브를 4 °C에서 300 ×g로 5분 동안 원심분리합니다.

FACS를 통한 살아있는 세포 분리를 위해 세포를 준비하려면, 얼음 위에서 45 mL의 PBS에 5 mL의 FBS와 50 µL의 ROCK inhibitor를 첨가하여 염색 버퍼를 준비합니다. 펠렛화된 세포에서 상층액을 제거하고 1.2 mL의 염색 버퍼에 세포를 재부유시킵니다. 부유된 세포 200 µL를 얼음 위에 미리 냉각시킨 새로운 50 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 남은 1 mL의 세포 현탁액을 얼음 위에 놓인 새로운 냉각된 50 mL 원심분리관으로 옮기고, 2 µL의 SIRP alpha-PE/Cy7 및 4 µL의 CD90-FITC 항체를 추가합니다. 트랜스퍼 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 부드럽게 섞은 후 튜브를 얼음 위에 둡니다. 음성 대조군과 시료가 담긴 두 개의 50 mL 튜브를 얼음 위 4 °C의 로커 셰이커에서 1시간 동안 배양합니다.

세포를 배양하는 동안, 두 개의 15-milliliter 원심분리관에 각각 3 milliliters의 분화 배지 2를 옮깁니다. 그 다음 3 microliters의 ROCK 억제제를 첨가하고, 이 FACS 수집관들을 사용 전까지 얼음 위에 보관합니다. 이어서, 염색된 세포를 4 °C에서 300 ×g로 5분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다.

그런 다음 ice-cold PBS 10 milliliters로 두 번 세척합니다. DAPI가 포함된 염색 버퍼 1~3 milliliters로 샘플 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 음성 대조군 펠릿에는 DAPI가 없는 염색 버퍼 500 microliters를 추가합니다.

세포 덩어리를 제거하기 위해 두 세포 현탁액을 40-micron 세포 스트레이너로 여과한 후, 얼음 위에 놓인 폴리스티렌 FACS 튜브로 옮깁니다. 즉시 샘플을 세포 분석기로 가져갑니다. 음성 염색 대조군 샘플부터 시작하여 게이팅 파라미터를 설정합니다.

그다음, 샘플 세포를 분석하는 동안 DAPI 음성인 살아있는 세포군을 선택하십시오. 20 PSI에서 FITC 양성 세포군과 PE/Cy7 양성 세포군을 각각 독립적으로 수집하십시오. 텍스트 프로토콜에 명시된 대로 세포를 배양하고 다시 응집시킨 후, 배양 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 배지를 50-milliliter 원심분리 튜브로 옮기십시오.

플레이트를 3 mL의 PBS로 세척하고 세척액을 동일한 50 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그 다음 플레이트에 0.04% trypsin-EDTA 3 mL를 첨가하고 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 5분 후, 현미경을 사용하여 플레이트의 세포 박리 여부를 확인합니다.

모든 세포가 떨어져 나오면, 플레이트에 3 mL의 트립신 중화 용액을 첨가합니다. 부드럽게 혼합한 후 세포를 원래의 50 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 플레이트를 5 mL의 PBS로 세척하고, 이 세척액 또한 튜브에 추가합니다.

상온에서 300 ×g로 5분간 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 제거하고 펠렛을 1 mL의 신생 송아지 혈청(neonatal bovine serum) 또는 NBS 배지에 재부유시킵니다. 그다음, 세포를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

상온에서 300 ×g로 5분 동안 원심 분리하여 세포 펠렛을 형성하고 상층액을 제거합니다. 6개의 공학적 심장 조직 생성을 시작하기 위해, 5 mg/mL 콜라겐 스톡 60.0 µL를 1 M 수산화나트륨 1.5 µL, 10X PBS 9.6 µL, 멸균 초순수 24.9 µL와 함께 혼합하여 3.125 mg/mL로 희석합니다. 이때 콜라겐 혼합물에 기포가 유입되지 않도록 주의하는 것이 매우 중요한데, 기포는 점성이 있는 용액에서 천천히 배출되며 조직 압축 과정 중 조직 형성을 방해할 수 있기 때문입니다.

15mL 튜브의 벽면을 따라 10X MEM과 pH 9의 0.2 normal HEPES를 각각 12.0 µL씩 피펫팅하여 콜라겐 혼합물을 희석합니다. 그런 다음, 기저막 매트릭스를 콜라겐 혼합물에 최종 농도가 0.9 mg/mL가 되도록 첨가하고 부드럽게 섞습니다. 이 최종 조직 혼합물을 얼음 위에 보관하십시오.

다음으로, 조직 혼합물 전체를 세포 펠릿으로 옮기고 텍스트 프로토콜에 명시된 대로 보충 세포를 추가합니다. 세포가 없는 NBS 배지를 사용하여 튜브의 최종 부피가 150 microliters가 되도록 채운 후 부드럽게 섞습니다. 세포 현탁액 25 microliters를 바이오리액터 베이스 플레이트의 6개 웰 각각에 조심스럽게 피펫으로 분주합니다.

침전되었을 수 있는 세포들을 다시 부유시키기 위해 각 웰 사이에서 혼합 과정을 반복합니다. 조직당 일관된 부피와 세포 수를 보장하기 위해 한 번에 하나의 조직만 웰에 피펫팅합니다. 이와 별도로, 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 힘 센서 두 줄을 폴리설폰 프레임의 양측에 밀어 넣어 서로 마주 보는 6쌍의 포스트를 형성합니다.

프레임을 베이스 플레이트 위에 뒤집어 놓아, 포스트 한 쌍이 세포 현탁액이 들어 있는 각 웰에 들어가게 합니다. 그런 다음 바이오리액터를 60mm 디쉬에 넣고, 덮개를 제거한 해당 디쉬를 다시 10cm 디쉬 안에 넣습니다. 10cm 디쉬의 뚜껑을 닫고 바이오리액터 조립체 전체를 조직 배양 인큐베이터로 옮깁니다.

2시간 동안 배양한 후, 바이오리액터 어셈블리를 꺼내고 베이스 플레이트가 잠기도록 NBS 배지 14 milliliters를 추가합니다. 바이오리액터를 세포 배양 인큐베이터로 다시 옮기고 매일 배지의 절반을 교체합니다. 48시간 후, 베이스 플레이트를 한 번에 몇 밀리미터씩 조심스럽게 제거합니다.

그 다음, 조직이 배지를 향하도록 하여 바이오리액터를 되돌려 놓습니다. 베이스 플레이트를 제거할 때 조직이 포스트에서 떨어지면, 조직을 포스트에 조심스럽게 다시 부착하십시오. 인간 배아 줄기세포의 분화는 주로 심근세포와 섬유아세포의 혼합 배양으로 이어지며, 이들은 스스로 클러스터를 형성하고 디쉬 전체에 걸쳐 강하게 박동하는 웹 구조를 형성합니다.

이들 배양물을 FACS sorting으로 분석한 결과, 본 분화 방법을 통해 SIRP alpha 양성 세포가 최소 65% 및 CD90 양성 세포가 10% 포함된 세포군이 형성됨을 확인하였습니다. 베이스 플레이트를 제거한 후, 인간 공학 심장 조직(human engineered cardiac tissues, HECTs)이 바이오리액터 내에서 자가 조립되도록 합니다. 성숙하고 응축된 HECTs는 통합된 힘 감지 포스트를 가시적으로 굴절시키며, 이때 평균 5~15 micronewtons의 힘이 가해집니다.

수축력(Twitch force) 측정은 특정 변수가 이러한 정의된 공학적 조직의 수축력에 어떠한 영향을 미치는지 밝혀줍니다. 본 실험에서 조직에 10%의 인간 중간엽 줄기세포를 보충했을 때, 1Hz 및 2Hz의 페이싱 빈도 모두에서 수축력이 상당히 향상되는 것이 관찰되었습니다. 숙달 후, 분화에는 약 20일, 세포 분리에는 약 5시간, 조직 구축에는 약 3시간이 소요됩니다.

제작 후 적절한 조직 형성을 위해 7일의 시간이 추가로 필요합니다. 이 과정 이후에는 특정 세포 간 상호작용의 영향에 관한 추가 질문에 답하거나 세포 치료의 메커니즘을 결정하기 위해 세포 표지 및 조직 혼합물 보충을 포함한 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 세포 구성이 알려져 있고 제어된 인간 공학적 심장 조직을 만드는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.