정의 인간 공학 심장 조직의 건설 심장 세포 치료의 메커니즘을 연구하는

이 절차의 전반적인 목표는 정의된 세포 구성의 인간 공학 심장 조직을 만드는 것입니다. 이 방법은 가변성 및 심장 분화 효율을 제어하고 특정 세포 유형이 심장 수축 기능에 미치는 영향을 이해하는 것을 포함하여 심장 조직 공학 분야의 주요 과제를 해결할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 최종 결과가 제어되고 정의된 구성의 인간 엔지니어링 심장 조직이라는 것입니다.

이 기술의 복제는 심장 질환 치료로 확장되는데, 그 이유는 정의된 조직이 치료 개입을 평가할 수 있는 새롭고 생물학적으로 관련성이 있는 생체 의학 스크리닝 플랫폼을 제공할 수 있기 때문입니다. 이 방법은 새로운 심장 치료에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 인간 공학 심장 조직 시스템을 사용하여 심장 세포 치료의 메커니즘을 이해할 수도 있습니다. 인간 배아줄기세포 유래 심근세포 배양부터 시작하여 PBS로 세포를 한 번 세척하고 0.04%트립신-EDTA 1ml를 첨가합니다.

섭씨 37도, CO2 5%에서 10분 동안 세포를 배양합니다. 세포가 배양 중일 때 6ml의 트립신 중화 용액에 12마이크로리터의 ROCK 억제제를 첨가합니다. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 6웰 플레이트의 각 웰에 1ml의 중화 용액을 추가합니다.

각 웰의 모든 세포를 단일 15ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 6개의 웰을 모두 3ml 용량의 PBS로 세척하고 이 세척을 튜브의 세포와 결합합니다. 튜브를 섭씨 4도에서 5분 동안 300배 G로 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.

FACS에 의한 살아있는 세포 분류를 위해 세포를 준비하려면 얼음 위의 PBS 45ml에 FBS 5ml와 ROCK 억제제 50마이크로리터를 첨가하여 염색 완충액을 준비합니다. 펠릿화된 세포에서 상층액을 제거하고 1.2ml의 염색 완충액에 재현탁합니다. 200마이크로리터의 부유 세포를 얼음 위의 미리 냉각된 새 50ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 남은 1ml의 세포 현탁액을 얼음 위의 새로운 사전 냉각된 50ml 원심분리기 튜브로 옮기고 2마이크로리터의 SIRP alpha-PE/Cy7과 4마이크로리터의 CD90-FITC 항체를 추가합니다. 세포 현탁액과 전사 피펫을 부드럽게 혼합하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 네거티브 대조군과 샘플을 함유한 두 개의 50ml 튜브를 섭씨 4도의 얼음 위에서 로커 셰이커에 1시간 동안 배양합니다.

세포가 배양하는 동안 3ml의 분화 배지를 2개의 15ml 원심분리 튜브 각각에 전달합니다. 그런 다음 3마이크로리터의 ROCK 억제제를 첨가하고 이 FACS 수집 튜브를 사용하기 전에 얼음에 보관하십시오. 다음으로, 염색된 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 300배 G로 펠릿

그리고 얼음처럼 차가운 PBS 10ml로 두 번 씻으십시오. DAPI가 함유된 1-3ml의 염색 완충액으로 샘플 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. DAPI가 없는 500마이크로리터의 염색 완충액을 음성 대조군 펠릿에 추가합니다.

40미크론 세포 여과기를 통해 두 세포 현탁액을 모두 여과하여 세포 덩어리를 제거한 다음 얼음 위의 폴리스티렌 FACS 튜브로 옮깁니다. 즉시 샘플을 세포 분류기로 가져옵니다. 음성 염색 대조군 샘플부터 시작하여 게이팅 매개변수를 설정합니다.

그런 다음 샘플 셀을 실행하는 동안 DAPI 음성 라이브 셀 모집단을 선택합니다. 20 PSI에서 FITC 양성 및 PE/Cy7 양성 세포 집단을 모두 독립적으로 수집합니다. 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 세포를 배양하고 재응집한 후 인큐베이터에서 세포 배양 플레이트를 제거하고 배지를 50ml 원심분리 튜브로 옮깁니다.

3ml의 PBS로 플레이트를 세척하고 세척물을 동일한 50ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 3ml의 0.04%트립신-EDTA를 플레이트에 넣고 섭씨 37도, 5%CO2에서 배양합니다. 5분 후 현미경을 사용하여 플레이트의 세포 박리를 검사합니다.

모든 세포가 분리되면 플레이트에 3ml의 트립신 중화 용액을 추가합니다. 세포를 부드럽게 혼합하여 원래의 50ml 원심분리기 튜브에 옮깁니다. 5ml의 PBS로 플레이트를 세척하고 이 세척액을 튜브에도 추가합니다.

실온에서 5분 동안 300배 G로 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 제거하고 펠릿을 1ml의 신생아 소 혈청 또는 NBS 배지에 재현탁합니다. 다음으로, 세포를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

세포를 실온에서 300배 G로 5분간 펠렛화하고 상층액을 제거합니다. 6개의 공학적 심장 조직을 생성하기 위해 60.0 마이크로리터의 밀리리터 콜라겐 스톡을 1.5 마이크로리터의 1몰 수산화나트륨, 9.6 마이크로리터의 10X PBS 및 24.9 마이크로리터의 멸균 초순수로 3.125 밀리그램으로 희석합니다. 여기서, 기포가 점성 용액에서 방출되는 속도가 느리고 조직 압축 중에 조직 형성을 방해할 수 있으므로 콜라겐 혼합물에 기포가 유입되지 않도록 하는 것이 중요합니다.

15ml 튜브의 측면을 피펫으로 밀어 pH 9에서 10X MEM과 0.2 일반 힙을 각각 12.0마이크로리터씩 추가하여 콜라겐 혼합물을 희석합니다. 그런 다음 기저막 매트릭스를 콜라겐 혼합물에 최종 농도인 밀리리터당 0.9mg으로 추가하고 부드럽게 혼합합니다. 이 최종 티슈 믹스를 얼음에 보관하십시오.

다음으로, 전체 조직 혼합물을 세포 펠렛으로 옮기고 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 보조 세포를 추가합니다. cell-free NBS 매체로 튜브를 최종 부피 150μl까지 채우고 부드럽게 혼합합니다. 25 마이크로 리터의 세포 현탁액을 생물 반응기베이스 플레이트의 6 개의 웰 각각에 조심스럽게 피펫팅합니다.

각 웰 사이에서 혼합 절차를 반복하여 침전되었을 수 있는 세포를 다시 현탁시킵니다. 한 번에 웰당 하나의 조직만 피펫팅하여 조직당 일관된 부피와 세포 수를 보장합니다. 이와 별도로 두 줄의 폴리디메틸실록산(PDMS) 포스 센서를 폴리설폰 프레임의 양쪽에 밀어 넣어 6쌍의 반대쪽 포스트를 형성합니다.

베이스 플레이트 상단의 프레임을 반전시켜 한 쌍의 포스트가 셀 현탁액을 포함하는 각 웰에 들어가도록 합니다. 그런 다음 생물 반응기를 60mm 접시에 넣고 덮개가 없는 접시를 10cm 접시 안에 넣습니다. 10cm 접시에 뚜껑을 덮고 전체 생물반응기 어셈블리를 조직 배양 인큐베이터로 옮깁니다.

2시간 배양 후 바이오리액터 어셈블리를 제거하고 14ml의 NBS 배지를 추가하여 베이스 플레이트를 덮습니다. 바이오리액터를 세포 배양 인큐베이터로 되돌리고 매일 배지의 절반을 교체합니다. 48시간 후 베이스 플레이트를 한 번에 몇 밀리미터씩 부드럽게 제거합니다.

그런 다음 조직이 아래를 향하도록 생물 반응기를 배지로 되돌립니다. 베이스 플레이트를 제거할 때 티슈가 포스트에서 떨어지면 티슈를 포스트에 부드럽게 다시 부착하십시오. 인간 배아 줄기 세포의 분화는 주로 심근세포와 섬유아세포의 혼합 배양을 초래하며, 이들은 스스로 군집으로 조직화하고 접시 전체에 걸쳐 견고하게 박동하는 거미줄을 형성합니다.

이러한 배양액의 FACS 분류는 이러한 분화 방법을 통해 최소 65%의 SIRP 알파 양성 세포와 10%CD90 양성 세포를 포함하는 집단을 생성하는 것으로 나타났습니다. 베이스 플레이트를 제거한 후 인간 공학 심장 조직(HECT)은 생물반응기 내에서 자가 조립할 수 있습니다. 성숙하고 압축된 HECT는 평균 5-15마이크로뉴턴의 힘으로 통합된 힘 감지 포스트를 눈에 띄게 편향시킵니다.

트위치 힘 측정은 고립된 변수가 이렇게 정의된 엔지니어링 조직에서 수축력을 어떻게 변화시키는지 보여줍니다. 여기서, 조직에 10%의 인간 중간엽 줄기세포가 보충되면 1헤르츠 및 2헤르츠 페이싱 주파수 모두에서 수축력의 상당한 향상이 관찰됩니다. 일단 숙달되면 분화는 약 20일, 세포 분류는 약 5시간, 조직 구축은 약 3시간이 걸립니다.

시공 후 적절한 조직 형성을 위해 7일이 더 필요합니다. 이 절차에 따라, 특정 세포-세포 상호 작용의 영향에 관한 추가 질문에 답하거나 세포 치료의 메커니즘을 결정하기 위해 세포 표지 및 조직 혼합물의 보충을 포함한 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 알려지고 제어되는 세포 구성을 가진 인간 공학 심장 조직을 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.