July 11th, 2025
여기에서는 정제된 단백질로부터 준2차원(2D) 얽힘, 가교 및 액정 액틴 어셈블리를 준비하는 방법을 제시합니다.
본 연구는 연질 생물학적 물질에 초점을 맞추고 형태와 조직을 조절하는 근본적인 물리적 메커니즘과 생물학적 세포에서 영감을 받은 물질을 탐구하는 것을 목표로 합니다.
생물학적 및 시험관 내 모델 시스템은 본질적으로 많은 함정이 있는 복잡하며 샘플 전처리는 재현성에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 이러한 시스템의 재현성을 향상시키도록 설계되었습니다.
이러한 결과는 물리적 힘과 생체 재료의 메커니즘을 감지, 특성화하고 기능을 이해하는 길을 열어줍니다. 이것은 다양한 생체 고분자 및 소기관에 일반화될 수 있습니다.
[해설자] 시작하려면 마이크로 원심분리기 튜브에 5마이크로리터의 10XF 완충액을 추가하여 로드할 샘플을 준비하고 나머지 구성 요소를 추가한 후 최종 샘플 부피가 50마이크로리터가 되도록 탈이온화 증류수를 추가합니다. 25% 베타-메르캅토에탄올 1마이크로리터, 포도당 225밀리그램 1마이크로리터, 포도당 산화효소 혼합물 1마이크로리터 및 밀리리터당 촉매 85,000단위를 용액에 피펫팅합니다. 그런 다음 25밀리몰 ATP 1마이크로리터와 2% 10마이크로리터, 15센티푸아즈 메틸셀룰로오스를 넣고 피펫팅으로 완전히 혼합합니다. 액틴 중합을 시작하려면 표지되지 않은 액틴과 표지된 액틴을 혼합하고 액틴 혼합물을 준비된 F 완충액에 첨가합니다. 적절한 혼합을 보장하기 위해 용액을 위아래로 피펫팅합니다. 액틴을 마이크로 원심분리기 튜브에서 실온에서 중합하도록 둡니다. 다음으로, 플로우 셀을 준비하려면 현미경 슬라이드의 너비를 가로질러 서로 평행하게 두 개의 양면 테이프를 배치하여 플로우 셀 채널의 경계를 형성합니다. 커버 슬립을 테이프 채널 위에 배치하여 현미경 슬라이드에 수직이 되도록 합니다. 양면 테이프와 접촉하는 커버 슬립 부분을 눌러 밀봉이 잘 되고 에어 포켓을 제거합니다. 면도날을 사용하여 현미경 슬라이드에서 여분의 테이프를 잘라내고 유일하게 보이는 테이프가 샘플 채널 내에 있도록 슬립을 덮습니다. 두 개의 대패 샘플을 위한 실린더 샘플 챔버를 준비하려면 먼저 커버 슬립을 에탄올, 물 및 에탄올로 헹굽니다. 여과된 공기로 건조시키십시오. 5분 에폭시를 얇게 도포하여 유리 복제 실린더를 커버 슬립에 부착합니다. 투명 또는 밝은 색상의 마이크로 원심분리기 튜브에 3.5마이크로리터의 오일 계면활성제 용액을 첨가합니다. 혼합하지 않고 5마이크로리터의 액틴 용액을 오일 계면활성제 층 상단에 피펫팅합니다. 튜브를 닫습니다. 마이크로 원심분리기 튜브의 상단을 잡고 하단 가장자리를 튕겨 눈에 보이는 에멀젼으로 초기 거품을 형성하고 균일한 마이크로 에멀젼이 형성될 때까지 계속 튕깁니다. 플로우 셀을 로드하기 전에 소량의 5분 에폭시를 혼합합니다. 플로우 셀을 로드하려면 1-3마이크로리터의 오일 계면활성제 용액을 플로우 셀의 샘플 채널에 피펫팅하여 채널을 적시는 작은 플러그를 만듭니다. 샘플을 추가하기 전에 플로우 셀을 기울여 오일 계면활성제 메니스커스가 후퇴하여 형성되는 에어 갭을 제거합니다. 즉시 샘플 용액 에멀젼 현탁액을 플로우 셀 입구에 피펫팅하여 채널을 채웁니다. 플로우 셀 채널의 각 측면을 5분 에폭시로 밀봉합니다. 비에멀젼 샘플용 실린더 샘플 챔버를 로드하려면 5마이크로리터의 오일 계면활성제 용액을 유리 실린더 챔버 바닥에 피펫팅합니다. 커버 슬립을 기울이고 천천히 회전시켜 표면과 하부 실린더를 계면활성제 용액으로 코팅합니다. 피펫을 사용하여 과도한 오일 계면활성제 용액을 제거하여 오일의 완전한 증발을 방지하면서 얇은 층을 얻습니다. 즉시 샘플 용액을 챔버에 추가합니다. 증발과 흐름을 방지하기 위해 작은 폴리테트라플루오로에틸렌 또는 PTFE 테이프로 챔버를 덮습니다. 샘플을 현미경 스테이지에 장착합니다. 고해상도 이미징을 위해 충분히 높은 수치 조리개를 보장하기 위해 오일 또는 물 침지와 함께 20x, 40x, 60x 또는 100x 대물렌즈를 사용하여 액틴의 타임랩스 이미징을 시작합니다. 샘플 챔버에서 중합하는 경우 약 30분 동안 또는 눈에 띄는 필라멘트 연장 또는 움직임이 없을 때까지 중합을 허용하십시오. 샘플에 가교제를 추가한 다음 총 부피의 약 절반을 샘플에 천천히 피펫팅하여 미리 중합된 필라멘트로 미오신을 추가합니다. 마지막으로 타임랩스 이미징을 시작합니다. 얽힌 액틴 네트워크의 대표적인 공초점 형광 이미지가 여기에 나와 있습니다. 얽힌 액틴 네트워크는 표면 전체에 균일하게 분포되어 있습니다. 이 이미지의 밝은 점은 필라멘트 겹침을 나타내는 반면, 어두운 영역은 최소한의 액틴 존재를 나타냅니다. 열 변동은 국부적인 강도 변화와 액틴 필라멘트의 눈에 띄는 굴곡으로 이어집니다. 미오신 II의 첨가는 액틴 네트워크의 구부러짐과 재구성을 유발하여 오랜 시간 동안 미오신 점점의 눈에 띄는 축적을 유발합니다. 네트워크 수축은 미오신 농도와 ATP 농도에 따라 달라집니다. 가교 액틴 네트워크에서 미오신 유도 수축은 얽힌 네트워크에 비해 더 긴 길이 척도에 걸쳐 조정된 운동으로 이어집니다.
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이 연구는 부드러운 생물학적 물질에 초점을 두고 있으며, 형태와 구조를 조절하는 물리적 메커니즘을 탐구하는 것을 목표로 합니다. 이 연구는 정제된 단백질로부터 준-2차원(2D) 얽힘, 교차 연결 및 액정 아틴 집합체를 준비하는 방법을 제시합니다.
Reconstituted actin-based assemblies provide a controllable platform for dissecting the physical mechanisms underlying cellular contractility and deformation, which are central to cytoskeletal target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The ability to tune contractility and deformation modes in vitro enables predictive evaluation of cytoskeletal modulators and supports translational continuity from discovery to preclinical model development. These assemblies offer a reproducible system for quantitative analysis of force generation and shape regulation relevant to biopharma R&D portfolios.
These actin-based assemblies integrate into the discovery continuum from early mechanistic studies through assay development and preclinical validation, supporting both target validation and predictive analytics for cytoskeletal drug discovery.