병든 쥐 망막에서 미세아교세포 역학과 시냅스와의 상호작용에 대한 실시간 영상 및 특성 분석

우리 연구실 연구 범위는 발달 중 시냅스 재형성에서 녹내장과 미세아세포의 기저 메커니즘을 연구하는 것입니다. 현재 실험적 과제는 미세아교세포가 망막 신경절 세포 시냅스를 적극적으로 분해하는지, 아니면 단순히 수동적으로 잔해를 제거하는 것인지에 관한 것입니다. 먼저 쥐 망막을 필터 페이퍼 위에 위치시키고 실험실 닦아서 말리세요.

망막을 MatTek 페트리 접시 위에 뒤집어 놓으세요. 망막을 금속 구슬이나 링으로 무게를 씌우세요. 그 다음 인공 뇌척수액 3방울에서 5방울을 추가합니다.

샘플을 회전 디스크 공초점 현미경 아래에 놓고 설정을 조정해 망막을 미리 관찰하세요. Z축을 따라 10에서 20마이크로미터 깊이의 스텝 사이즈를 사용하여 이미지를 수집합니다. 프레임 간 시간 간격을 20초에서 30초 사이로 유지하여 신뢰할 수 있는 셀 추적을 가능하게 합니다.

미세교세포의 표면 렌더링을 수행하려면 파일 변환기 소프트웨어를 사용해 타임랩스 파일을 IMS 형식으로 변환하세요. 이전에 획득한 이미지 특성을 바탕으로 복셀 크기를 입력합니다. 분석 소프트웨어 영역에서 관찰 폴더를 클릭하여 변환된 파일을 열고 이미지가 3D 뷰인지 확인하세요.

개별 미세아교세포를 감지하려면 객체 툴바에서 '새로운 표면 추가' 아이콘을 클릭하세요. 관심 영역만 세그먼트를 선택하고, 시간에 따른 표면 추적, 표면 분류, 객체-객체 통계 분석 알고리즘 설정에서 확인하세요. 그 다음, 파란색 재생 버튼을 눌러 진행하세요.

표면 렌더링 채널을 선택하세요. 선택적으로 표면 생성을 부드럽게 하고 표면 디테일을 입력하기 위해 smooth를 활성화할 수 있습니다. 임계값 설정에서는 셀 감지를 위해 머신러닝 세분화를 선택하세요.

학습 데이터 아래에서 배경과 전경 페인트브러시 도구를 사용하세요. 원하는 붓을 선택하고 Shift 버튼과 왼쪽 클릭을 사용해 붓질을 그려보세요. 보간이 켜져 있는지 확인한 후 train과 predict를 선택하세요.

가운데 노란색 포인터를 사용해 Z축을 가로지르세요. X, Y, Z 평면과 몇 가지 시간대에 걸쳐 여러 획을 그려보세요. 각 항목마다 세 번에서 다섯 번의 짧은 스트로크를 사용하며, 반복적으로 조정하여 정확한 표면을 완성하세요.

노란색 사각형을 사용해 훈련 디스플레이와 실제 생성된 표면을 번갈아 전환해 최종 점검을 하세요. 또한 시간 경과를 통해 표면이 세포 형태와 일치하는지 확인하세요. 완료 후에는 분리 객체를 해제하세요.

복셀 히스토그램 임계값을 조정하여 기본 표면에 속하지 않는 작은 연결 되지 않은 객체를 제거하세요. 그 다음, 가위 도구를 사용해 표면을 수동으로 편집해 불필요한 객체나 절단 가장자리를 제거하세요. 원한다면 객체에 허용되는 간격의 임계값을 설정하고 이동 셀에 맞는 추적 알고리즘을 선택하세요.

필터로 메인 표면과 연관되지 않은 객체를 추적하세요. 작업이 끝나면, 이동 셀 디스플레이를 투명 프로필로 설정하여 다음 단계를 위한 펀크타를 시각화하세요. 개별 PSD95 펀크타를 감지하려면 오브젝트 툴바의 파란색 표면 아이콘을 클릭하세요.

그 후 시간에 따라 추적 지점을 선택하고, 위치를 분류하며, 객체-객체 통계를 입력한 후 재생 버튼을 누르세요. 시냅스 마커의 소스 채널을 선택하세요. 슬라이서와 다른 채널을 끄고 PSD95만 시각화하세요.

컨트롤 버튼과 포인터 선택 도구를 사용해 펀크타의 XY 직경을 추정하세요. 프레임 전반에 걸쳐 지속되는 밝은 포인트 몇 개를 골라서 배경 감산을 끄세요. 다음으로, 스팟 품질에 따라 필터를 추가하세요.

모든 시간대에서 정확한 PSD95 펀크타를 포함하도록 히스토그램을 조정하세요. 편집을 통해 오탐 부분을 제거하세요. 큐브와 원 커서 사이를 전환해 한두 프레임만 지속되는 부분을 삭제하세요.

원한다면 허용되는 간격의 임계값을 설정하고 시냅스 스점에 대한 추적 알고리즘을 선택하세요. 실제 펀크타와 연관되지 않은 트랙을 히스토그램 임계값을 사용해 작은 오브젝트 트랙을 제외합니다. 표면까지의 최단 거리를 사용하여 분류를 정의합니다.

0마이크로미터 미만의 펀크타처럼 삼켜져 있고, 표면에서 0에서 0.5마이크로미터 사이로 접촉하며, 0.5 마이크로미터 이상으로 접촉하지 않은 상태입니다. 위의 분류를 사용하여 이벤트에 라벨을 할당하세요. 표면과 반점이 미세아교세포와 눈점(puncta)을 적절히 나타내면, 통계 탭 아래 모든 통계를 내보내세요.

미세교세포는 레이저 유도 안구 고혈압 후 대조군에 비해 돌기 변위 길이가 증가하는 모습을 보였다. 미세아교세포 속도는 레이저 처리된 눈에서 대조군보다 유의하게 높았습니다. 레이저 치료 후 미세아교세포와 PSD95 눈점 간 접촉 사건 수가 증가했습니다.

타임랩스 기록 결과, 레이저 처리된 망막은 대조군 망막에 비해 미소아교세포 운동성이 더 높고 PSD95 눈점과의 상호작용이 증가함을 보였습니다. 우리의 중요한 발견은 마우스에서 일시적인 안압 상승 후 미세아교세포 수, 복잡성, 운동성 및 시냅스 공동위치가 증가한다는 것을 보여주었습니다. 저희 프로토콜은 체외 영상을 제공하여 백내장 및 각막 불투명도를 방지하여 더 빠른 실험과 전반적인 처리량 향상을 가능하게 합니다.

우리의 연구 결과는 형질전환 형광선을 이용한 미세아세포-뉴런 상호작용, 세포 소통 및 역학 시각화와 고해상도 타임랩스 영상을 가능하게 하여 연구를 진전시킵니다.