전체 마운트 조직 이미징을 사용한 장 점액의 3차원 정량화

저희 연구는 점막 조직에 미생물이 주입하는 메커니즘에 초점을 맞추며, 점액이 이러한 상호작용을 조절하는 데 중요한 역할을 한다는 점을 강조합니다. 전통적인 2D 점액 정량화는 공간적·부피적 세부사항을 놓치고 있습니다. 우리 프로토콜은 기존 방법에서 간과된 분자 개입에 의한 구조 및 분포 변화를 밝혀내는 정확한 3D 분석을 가능하게 합니다.

이 프로토콜은 호르몬 영상과 3D 정량화를 결합하여, 다양한 실험 조건과 분자 개입에 적용 가능한 장내 점액 구조의 견고하고 재현성 있는 측정값을 제공하며, 기존 2D 평가를 넘어선다. 먼저, 마취된 6주에서 8주 된 쥐를 온열 패드 위에 올려 체온을 유지하세요. 쥐의 피부 표면을 알코올로 소독하고, 마취를 유지하면서 왼쪽 하복부를 절개하여 맹장을 노출시킵니다.

이제 회장이나 근위 결장을 확인해 보세요. 장 루프를 멸균 거즈에 올려놓으세요. 멸균 PBS로 세척하고 양쪽 끝을 동맥 클램프로 고정하여 3cm 길이의 폐쇄 루프를 만듭니다.

마취 하에 결찰된 장 루프에 멸균 PBS 또는 카르바모일콜린 염화시약을 최대 200마이크로리터 이하로 주입합니다. 30분 치료 후, 안락사된 동물의 장 루프를 수확하세요. 겸자를 사용해 장 루프를 잡고 살짝 살며시 PBS로 헹구세요.

장 루프를 세로로 잘라내고, 잘라내지 않은 작은 부분만 남기고 멸균된 PBS로 다시 조직을 헹구세요. 6cm 접시에서 조직을 납작하게 펴고 나머지 부분을 잘라냅니다. 구리선 세그먼트를 사용해 아가로스 베이스에 고정하세요.

이제 4% 파라포름알데히드 용액 10밀리리터를 접시에 넣어 조직을 12시간에서 24시간 동안 고정시킵니다. 배양 후에는 파라포름알데히드 용액을 제거하고 PBS로 조직을 최소 세 번 세척하여 잔여 파라포름알데히드를 제거합니다. 다음으로, 조직을 PBS에 0.4% Triton X-100과 3%BSA를 보충한 차단 버퍼 10밀리리터에 담근 후 섭씨 4도에서 12시간에서 24시간 동안 보관합니다.

차단 버퍼를 제거하세요. 밀 배아 응집력과 팔로이딘이 포함된 염료액으로 조직을 염색하세요. PBS 처리된 소장 및 대장 조직에서는 WGA 양성 점액이 주로 상피 표면의 고블릿 세포 내에 국한되었습니다.

카르바모일콜린 클로라이드 치료 후 장내강 내 WGA 양성 점액의 양이 소장과 대장 모두에서 눈에 띄게 증가했으나, 점액은 연속된 층을 형성하지 않고 산발적으로 퍼져 있었습니다. 카르바모일콜린 염화물 처리 후 소장과 대장 모두에서 WGA 양성 점액의 고블릿 세포 부피가 유의하게 감소하여 활성 분비를 나타냈다. PBS 처리 조직 내 모든 고블릿 세포 점액 부피는 1,000 입방마이크로미터 미만이었습니다.

WGA 양성 항목은 1,000 입방마이크로미터를 초과하는 물질이 내강 내 분비된 점액으로 분류되었습니다. 카르바모일콜린 클로라이드 처리는 소장 및 대장 조직 모두에서 분비된 점액의 총 부피를 약 5배에서 20배 증가시켰습니다.