마우스 기본 모드 네트워크의 종단적이고 다중 모드 전기생리학 기록을 가능하게 하는 대형 재밀봉 가능한 두개골 창을 위한 수술 프로토콜

기본 모드 네트워크(DMN)는 다양한 인지 기능과 우울증과 같은 신경정신과적 장애와 관련된 중요한 대규모 네트워크입니다. 동물 모델에서 DMN의 복잡한 역학을 연구하는 것은 건강 상태와 병리 상태 모두에서 그 기능에 대한 귀중한 통찰을 제공합니다. 하지만 깨어 있는 동안 행동하는 쥐의 여러 심하고 분산된 노드인 DMN으로부터 안정적이고 장기적이며 대규모 전기생리학적 기록을 수행하는 것이 큰 도전이었습니다.

여기서는 에로 카스트렌 연구실에서 개발된 새로운 2단계 수술 프로토콜을 소개합니다. 이 기술은 크고 내구성 있으며 재밀봉 가능한 두개골 창을 만들어 1,000개 이상의 전극 채널에서 동시에 반복적인 종방향 기록을 가능하게 합니다. 이는 표면 수준의 미세전기피질검사(micro-ECoG)와 두 개의 뉴로픽셀 프로브를 결합하여 기본 모드 네트워크에 전례 없는 접근을 가능하게 합니다.

이 영상은 동물 준비와 헤드플레이트 이식부터 만성 두개골 창 생성에 이르기까지 이 견고한 수술 절차를 단계별로 안내하여 네트워크 신경과학 연구를 위한 고품질의 장기 데이터 수집을 보장합니다. 표시된 모든 절차는 핀란드 국가실험위원회의 승인을 받았으며, 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호를 위한 유럽 지침을 준수합니다. 1단계, 동물 준비 및 헤드플레이트 이식.

이 시술을 수행하려면 필요한 모든 수술 재료와 장비를 준비하는 것부터 시작하세요. 마우스를 4% 이소플루란으로 마취시키고, 마취는 1.5%에서 2.5%로 유지하며, 분당 0.5리터의 산소 유량으로 유지합니다. 머리 윗부분의 털을 밀고, 시술 내내 체온을 37도까지 유지하도록 보정된 내부 온도 센서가 장착된 통제된 온열 패드에 동물을 올려놓습니다.

각막 건조를 방지하기 위해 카보머 눈 연고를 바르세요. 쥐를 입체정정 프레임에 고정시켜 두개골이 평평하게 눕히도록 하고, 수술 전 진통제와 피하 주사, 카프로펜, 부프레노르핀, 덱사메타손을 투여합니다. 면도한 부위를 포비돈-요오드 용액으로 소독하고, 두피 피부 아래에 리도카인-에피네프린 용액을 국소 마취제로 주입하세요.

귀 가장자리에 작은 횡절개를 하고 점진적으로 절개를 확대하여 두개골 표면의 윗부분을 완전히 노출시키세요. 노출된 두개골을 아세톤으로 조심스럽게 청소하여 모든 보이는 골막이 제거될 때까지 깨끗이 하여 임플란트의 강한 접착을 보장합니다. 아세톤 세척으로 완전히 해결되지 않은 잔여 골막과 결합 조직 조각을 무딘 원형 메스 칼날로 제거하세요.

입체 정위 장치를 사용해 두개골에 브레그마(bregma)에 대해 4밀리미터 x 7.6밀리미터 크기의 직사각형 영역을 표시하세요. 직사각형은 양쪽 브레그마에서 옆으로 2밀리미터, 앞쪽으로 3밀리미터, 뒤쪽으로 4.6밀리미터 뻗어야 합니다. 다음으로, 오른쪽 반구의 두 개의 두개내 탐침 삽입 부위를 표시하세요.

앞쪽 탐침 부위는 브레그마에서 앞쪽 1.66밀리미터, 외측 1.95밀리미터에, 뒤쪽 2.2밀리미터와 외측 1.9밀리미터에 후쪽 탐침 부위를 표시하세요. 다음으로, 지정된 창문 외 노출된 모든 뼈 표면에 11번 수술용 칼날을 사용해 교차 무늬를 새기고, 약 0.2mm에서 0.4mm 깊이의 얕지만 뚜렷한 홈을 만들어 약 1x1mm 정사각형의 균일한 격자를 만듭니다. 멸균된 30G 바늘을 면봉 끝에 끼우고 바늘을 V자 모양으로 구부려 미세 접착제 어플리케이터를 만듭니다.

시아노아크릴레이트 접착제를 일회용 플라스틱 무게 측정 보트에 분배한 후 도포기를 접착제 저장소에 담가세요. 노출된 뼈와 조각된 모든 표면에 접착제를 발라주고, 각 부위당 한 번의 침착물만 바르면 덮개가 철저하지만 과도하지 않게 하세요. 접착제를 7분간 말리게 한 후 진행하세요.

기준 소켓을 이식할 때는 왼쪽 소뇌 위치보다 드릴 부위를 선택하여 표면 혈관이 보이지 않도록 하세요. 파일럿 홀을 5초에서 10초 연속으로 라운드 스틸 버를 분당 20,000에서 25,000발로 드릴해 구멍이 더 투명해지고 연한 분홍빛이 드러날 때까지 뚫습니다. 금도금 기준 소켓을 파일럿 구멍에 삽입하고, 시아노아크릴레이트 접착제로 고정한 뒤, 자외선 경화 가능한 치과용 시멘트로 접합부를 보강하세요.

LED 경화 펜 조명으로 치과 시멘트를 1분간 치료하세요. 다음으로, 노출된 앞부분 뼈 꼭대기에 소량의 자외선 경화 치과 시멘트를 바르고, 헤드플레이트를 두개골 아래에 놓아 한쪽 가장자리가 기준 소켓 주변에 경화된 치과 시멘트 비계 위에 놓이고, 반대쪽 가장자리는 신선한 앞쪽 시멘트 도브 위에 놓이게 합니다. 헤드플레이트가 중앙에 맞춰져 있고 수평이 맞춰져 있는지 확인하세요.

머리판 바닥 주변에 치과 시멘트를 바르고 새겨진 뼈와 기준 소켓을 원형으로 돌려 미래 두개골 창 주변에 연속적이고 밀폐된 인클로저가 형성될 때까지 구조를 보강합니다. 마지막으로, LED 경화 펜 조명으로 1분간 치아 시멘트를 경화시켰습니다. 시멘트가 완전히 경화되면 쥐가 마취에서 깨어날 시간을 주세요.

1단계가 이제 완료되었습니다. 다음 단계로 넘어가기 전에 최소 48시간 이상 회복할 시간을 주세요. 2단계, 만성 두개골 창 생성.

두 번째 단계는 국소 마취를 제외하면 첫 번째 단계와 동일한 도구와 약물이 필요합니다. 또한, 이 단계에는 멸균된 얇은 PDMS 막, 얼음 위에 보관된 차가운 인공 뇌척수액, 엘라스토머 실리콘 실란트, 맞춤형 3D 프린팅 보호 캡이 필요합니다. 첫 수술 후 최소 48시간 후, 이소플루란으로 다시 마취시키고, 입위 고정 프레임의 온열 패드에 올려놓은 뒤, 리도카인-에피네프린 국소 마취제를 제외한 1단계와 마찬가지로 수술 전 약물을 투여합니다.

1단계에서 표시된 직사각형 윤곽선을 따라 치과 드릴로 뼈를 얇게 만들기 시작하며, 분당 25,000발의 발사를 시작하고, 드릴 장치를 뼈 표면에 대해 90도 각도로 잡고, 직사각형 가장자리를 따라 약간 더 깊게 한두 번 통과시켜 초기 절단 홈을 만듭니다. 두 프로브 삽입 좌표에서 두개골 창 옆 뼈에 얕은 홈을 드릴하고 치아 시멘트를 뚫습니다. 이 홈들은 뼈판을 제거한 후에도 지속적인 시각적 랜드마크 역할을 하며, 이후 전기생리학적 세션에서 두개내 탐침을 재배치하는 데 사용됩니다.

드릴링 기간 내내 얼음처럼 차갑고 멸균된 인공 뇌척수액을 정기적으로 투여하여 기저 피질에 대한 열 손상을 방지하고 출혈을 최소화하세요. 뼈가 얇아질수록 드릴 속도를 점차 분당 20,000발로 줄이세요. 직사각형 가장자리를 따라 계속 드릴을 굴려 외곽 뼈가 약 90% 얇아질 때까지 계속하세요.

두개골을 완전히 뚫지 마세요. 가늘게 굽은 듀라 훅으로 바꿔보세요. 끝을 얇은 뼈 가장자리 밑에 조심스럽게 넣고, 창문 가장자리를 따라 갈고리를 미끄러뜨려 뼈 덮개를 주변 두개골과 그 아래 조직에서 조심스럽게 분리하세요.

성공적으로 분리된 뼈판을 경막 후크로 조심스럽게 뒤쪽에서 앞쪽으로 들어 올려 두개골 표면에서 약 35도 높이로 올립니다. 겸자로 들려온 가장자리를 잡고 부드럽게 좌우로 흔들어 판이 완전히 풀릴 때까지 하세요. 얼음처럼 차가운 ACSF를 반복해서 세척하여 노출된 응고된 혈액을 부드럽게 제거합니다.

출혈이 가라앉으면 경막 표면 바로 아래에 멸균 프리캐스트 PDMS 막 하나를 직접 설치하세요. 적절한 크기로 조절되면 창문을 정확히 덮고 경막에 수동적으로 달라붙어 뇌에 평평하게 붙입니다. 실리콘 실란트를 발라서 두개골 절개술을 밀봉하세요.

치아 시멘트 인클로저와 헤드 플레이트 내부 가장자리 사이의 모든 틈새를 채우고, BDMS 막의 가장자리를 완전히 감싸고 겹치도록 하세요. 녹음 세션 사이에 창문을 보호하기 위해 소량의 시아노아크릴레이트 접착제를 사용해 헤드플레이트에 맞춤형 3D 프린팅 보호 캡을 부착하세요. 쥐는 이제 회복 준비가 되었으며, 이식 부위에 손상을 방지하기 위해 개별 우리로 옮겨야 합니다.

성공적인 수술은 피질에 투명하고 투명한 창을 제공하며, 혈관이 눈에 띄고 염증이나 감염의 징후가 최소화됩니다. 이 선명도는 21일 이상 유지할 수 있어 장기 종단 연구가 가능합니다. 만성 창을 통해 기록된 원시 전기생리학적 신호는 종단 시간 전반에 걸쳐 높은 품질을 유지했습니다.

여기서는 후비장 후반 격자에서 샘플링한 대표성 광대역 마이크로-ECoG 흔적과 동시에 표재 피질 채널에서 채취한 두개내 탐침 국소 필드 전위 흔적을 첫 기록일과 이후 21일 동안 나란히 보여줍니다. 21일차 기록은 동일 동물의 0일차 기록과 비교해 신호 진폭, 스펙트럼 함량, 움직임 및 잡음 아티팩트의 부재를 보이며, PDMS 막과 실리콘 밀봉의 만성적 존재, 반복된 경막 천공이 표면이나 두개내 탐침 신호 품질의 표면 손상을 유발하지 않았음을 확인시켜 줍니다. 이 기법의 주요 검증은 시간에 따라 안정적이고 고품질의 다중 모달 전기생리학적 데이터를 획득하는 것입니다.

재밀봉 가능한 창은 같은 신경 집단에서 몇 주에 걸쳐 반복적으로 탐침을 삽입하여 기록할 수 있게 합니다. 알파 대역에 걸친, 고밀도 두개내 전극 탐침을 따라 채널을 따라 계산된 위상 잠금 값 행렬은 기저선부터 치료 후 21일차 세션까지 안정적인 기능 구조를 보여준다. 이는 동일한 개별 뉴런을 공식적으로 추적하는 대신 동일한 피질 위치로의 재삽입 가능성을 보여줍니다.

비록 소규모 중재 이동이 같은 단위 주장을 배제하지만, 알파 밴드 상호작용의 집계 층류 및 지역 구조는 보존되어 만성 윈도우가 동일한 기능 회로의 종단 샘플링을 가능하게 함을 지지한다. 만성 윈도우가 동일한 심부 구조를 세션 간에 반복 가능한 층상 표적화를 지원하는지 직접 확인하기 위해, 프로브의 LFP 채널에서 전류원 밀도 또는 CSD 맵을 계산했습니다. 자극 유발 CSD 프로필은 예상되는 층상 싱크 소스 신호, 즉 전변연피질과 전방 대상골 영역이 세션 간에 보존됨을 보여줍니다.

두 세션 간의 층류 파워 프로파일 오버레이는 세션 간 매우 유사하며, 피어슨 상관관계수는 0.81입니다. 2차 운동 피질에서 관찰된 차이는 녹화 간 움직임 차이 때문일 가능성이 큽니다. CSD 플로팅은 해부학적 정보를 담고 있기 때문에, 각 프로브가 현재 샘플링하고 있는 뇌 영역을 사후 조직 염색과 무관하게 세션 내 비말기 판독을 제공할 수 있습니다.

표면 미세-ECoG 배치의 세션 간 재현성은 두개내 CSD 수치와 독립적으로 정량화됩니다. 0일차와 21일차에 마이크로 ECoG 그리드에서 계산된 대역 제한 공간 전력 맵을 중첩하고, 두 지도의 픽셀 단위 상관관계는 앞부분과 꼬리 하위 격자에 대해 별도로 계산됩니다. 서브그리드 프로파일 상관관계는 여전히 높으며, 두 세션의 공간 바코드는 배열의 원측과 꼬리 반쪽 모두에서 동일한 피질 전력 핫스팟을 눈에 띄게 동일하게 동일하게 위치시켰습니다.

반투명 격자를 통해 보이는 사인파 정렬 큐와 프로브 삽입 좌표에 새겨진 뼈 홈은 21일 종단 기간 동안 마이크로 ECoG 위치의 밀리미터 단위 재현성을 지원합니다. 기술을 추가로 검증하기 위해, 두개골 수술 약 4주 후 부전 뇌 절편에서 GFAP와 IBA1에 대한 면역조직화학적 염색이 시행되었습니다. GFAP는 뇌손상이나 염증과 같은 반응성 교세포에서 상향 조절되는 성상교세포에 의해 발현됩니다.

반면 IBA1은 미세교세포에서 발현되며, 미세아교세포는 신경염증 과정에서 더 활발합니다. 검증 코호트는 전체 2단계 수술이 시행된 후 수술 후 0일, 21일, 22일에 두개골 창을 세 차례 다시 열어준 동물들로 구성되었습니다. 그러나 이 코호트에서는 미세-ECoG 삽입이나 두개내 탐침 삽입은 이루어지지 않았습니다.

이 창은 전기생리학적 기록 시처럼 세션 사이에 다시 밀봉되었습니다. 따라서 이 코호트는 만성 창문과 반복적인 경막 노출의 염증 기여를 탐침에 의해 유발된 조직 손상과 분리합니다. 수술을 하지 않은 대조군과 수술을 받은 차량군 사이에서 유의한 차이는 관찰되지 않았습니다.

이 대표적인 현미사진들은 창문 바로 아래 부위에 반응성 교세포증이나 미세교세포 활성화의 질적 증거를 보여주지 않습니다. 그러나 탐침 궤도 인접과 탐침 삽입 반구에서 미세교교세포와 성상교세포 활성화가 약간 증가하는 것이 관찰되었는데, 이는 두개내 탐침의 너무 빠른 삽입 속도 때문일 가능성이 높다. 성공적인 수술은 염증을 최소화한 채 피질 위에 투명하고 투명한 창을 만듭니다.

만성 치료 기간이 끝난 후에는 뇌가 부종을 일으킬 수 있습니다. 이는 신중한 모니터링과 필요 시 추가 진통제 투여로 관리할 수 있습니다. 녹화를 위해서는 캡과 실란트를 제거하고, 마이크로 ECoG 그리드와 뉴로픽셀 프로브를 설치한 뒤, 깨어 있는 동물로부터 데이터 수집을 시작하면 됩니다.

요약하자면, 이 2단계 수술 프로토콜은 쥐에서 크고 만성적인 두개골 창을 만드는 신뢰할 수 있고 매우 효과적인 방법을 제공합니다. 이 절차의 주요 장점은 경막에 대한 손상이 최소화되고 넓은 노출을 제공한다는 점으로, 이는 표면 마이크로 ECoG 그리드와 여러 개의 심부 뇌 신경소 탐침을 동시에 배치하는 데 매우 중요합니다. 이 방법은 DMN 및 기타 대규모 회로에서 네트워크 전반의 전기생리학적 역학에 대한 전례 없는 종단 연구를 가능하게 합니다.

이는 복잡한 행동의 신경 기초와 뇌 질환의 병태생리에 대한 더 깊은 연구의 문을 열어주며, 궁극적으로 새로운 치료법 개발에 도움을 줍니다.