Testen op genetisch gemodificeerde voedingsmiddelen

1. Extractie van DNA uit voedselmonsters

1. Voeg 500 µL aangeschafte PCR-matrix toe aan elk van de 2 schroefdopbuisjes met een overdrachtpipet of 200-1.000 µL instelbare volume micropipet. Pipetteer op en neer met de pipet tussen elke hoeveelheid om de PCR-matrix gelijkmatig te mengen.
2. Label een schroefdopbuisje "niet-GMO" en de andere "test".
3. Weeg 0,5 g gecertificeerd niet-GMO voedsel af en doe het in de mortel.
4. Voeg 2,5 mL gedistilleerd water toe en maal met stamper gedurende 2 min om een pap te vormen.
5. Voeg nog eens 2,5 mL gedistilleerd water toe en maal verder met stamper tot de pap glad genoeg is om te pipetten.
6. Pipet 50 µL gemalen pap naar het schroefdopbuisje dat 500 µL PCR-premix bevat en gelabeld is als "niet-GMO" met behulp van de 50-µL markering op een geschaalde pipet. Doe de dop weer op het buisje.
7. Herhaal stappen 1.3-1.6 om het testvoedselmonster voor te bereiden.
8. Pipet 50 µL gemalen testvoedselpap naar het schroefdopbuisje gelabeld als "test". Doe de dop weer op het buisje.
9. Vortex de niet-GMO voedsel- en testvoedsel-PCR-buisjes gedurende 1 min en plaats de buisjes in een waterbad van 95 °C gedurende 5 min. Als er geen vortex beschikbaar is, knop het buisje meerdere keren om te mengen voordat het in het waterbad wordt geplaatst.
10. Plaats de buisjes in een centrifuge gedurende 5 min. Er moet zich een vaste pellet aan de onderkant van het buisje vormen. Als er zich na 5 min geen pellet heeft gevormd, centrifugeert u opnieuw gedurende 2 min intervallen totdat een pellet zich vormt.
11. Buisjes kunnen onmiddellijk worden gebruikt voor PCR of worden bewaard in een koelkast gedurende maximaal 1 week.

2. Instellen van PCR-reacties

1. Nummereer PCR-buisjes 1-6 en initialiseer ze. De nummers moeten overeenkomen met de volgende buisjesinhoud die in Tabel 1 is vermeld.
2. Plaats elk gelabeld PCR-buisje in een microtubehouder met de doppen open.
3. Gebruik voor elke toevoeging een verse tip en voeg 20 µL van de primer aan die in Tabel 1 is aangegeven toe aan elk PCR-buisje. Doe de doppen op de buisjes.
4. Gebruik voor elk buisje een verse tip en voeg 20 µL van het DNA-monster aan dat in Tabel 1 is aangegeven toe aan elk PCR-buisje, en zorg ervoor dat u alleen uit het supernatant pipetteert en de vaste pellet aan de onderkant van de buisjes vermijdt.
5. Nadat elk DNA-monster in het overeenkomstige PCR-buisje is gepipetteerd, gebruik de pipet om DNA en primer te mengen door voorzichtig op en neer te pipetten; doe de doppen weer op de buisjes.
6. Plaats PCR-buisjes in een thermische cycler en programmeer de cycler voor:
   Initiële denaturatie: 1 cyclus bij 94 °C gedurende 2 min.
   Amplificatie: 40 cycli bij 94 °C gedurende 1 min (denaturatie), 59 °C gedurende 1 min (annealing) en 72 °C gedurende 2 min (extensie).
   Einduitbreiding: 1 cyclus bij 72 °C gedurende 10 min.
   Houd: 4 °C onbeperkt.

3. Bereiding van 3% agarosegel

1. Plak met lab- of afdektape de open uiteinden van de gelbak stevig af. Zorg ervoor dat de tape aan de randen van de bak is afgesloten om te voorkomen dat gesmolten agarose eruit lekt.
2. Weeg 3 g agarose af in een 250-mL of groter Erlenmeyer-kolf.
3. Voeg 100 mL 1x TAE-buffer toe (aangeschaft of bereid uit concentraat).
4. Verwarm met behulp van een magnetische hot plate met een roerbare de beker totdat de agarose volledig is opgelost in de buffer en de oplossing kookt en helder wordt. Als alternatief kan een magnetron worden gebruikt door de beker in de oven te plaatsen en gedurende 30 s intervallen te verwarmen, met behulp van een roerstaaf om elke 10 s te mengen, en dit herhalen totdat het mengsel kookt en helder wordt.
5. Keer een 50-mL Erlenmeyer-kolf om in de opening van de 250-mL kolf om als reflux te fungeren, waardoor voorkomen wordt dat agarose-oplossing verdampt.
6. Laat de agarose-oplossing afkoelen tot 60 °C en giet 30-50 mL in elke getapete gelbak.
7. Plaats een gelkam in de eerste paar sleuven om gelwelven te creëren.
8. Laat de gel volledig afkoelen voordat u de tape en kam verwijdert. De gel zal stollen en van helder naar troebel veranderen wanneer het klaar is, ongeveer 10-20 min.

4. Elektroforese van PCR-producten

1. Plaats een voorgemaakte 3% agarosegel op een gelbak of gebruik een gelbak die is gebruikt om een gegoten 3% agarosegel te gieten.
2. Schuif de gelbak in de elektroforesekamer met de welvingen het dichtst bij het kathode (zwarte) uiteinde.
3. Pour 1x TAE-buffer in de kamer, genoeg om 2 mm buffer boven de bovenkant van de gelbak te hebben.
4. Haal PCR-buisjes uit de thermische cycler en plaats ze in een microtubehouder.
5. Gebruik voor elke toevoeging een verse pipettip en voeg 10 µ