Biomoleculaire Detectie gebruik de interferometrische reflectie Imaging Sensor (IRIS)

Samenvatting

Kwantitatieve, high-throughput, real-time, en label-free biomoleculaire detectie (DNA, eiwitten, enz.) op SiO ₂ Oppervlakken kunnen worden bereikt met behulp van een eenvoudige interferometrische techniek die is gebaseerd op LED-verlichting, minimale optische componenten, en een camera. De Interferometrische reflectie Imaging Sensor (IRIS) is goedkoop, eenvoudig te gebruiken, en vatbaar voor formats microarray.

Samenvatting

De gevoelige meting van biomoleculaire interacties heeft het gebruik op vele terreinen en branches zoals de fundamentele biologie en microbiologie, milieu / landbouw / bescherming tegen biologische dreigingen monitoring, nanobiotechnologie, en nog veel meer. Voor diagnostische toepassingen, monitoring (het detecteren van) de aanwezigheid, afwezigheid, of abnormale expressie van gerichte proteomics of genomische biomarkers gevonden in patiënten monsters kunnen worden gebruikt om de behandeling benaderingen of therapie werkzaamheid vast te stellen. In het onderzoek arena, informatie over de moleculaire affiniteiten en specifieke kenmerken zijn nuttig voor het volledig karakteriseren van de systemen in onderzoek.

Veel van de huidige systemen gebruikt om moleculaire concentraties of affiniteiten vast te stellen afhankelijk van het gebruik van labels. Voorbeelden van deze systemen zijn immunoassays, zoals het enzym-linked immunosorbent assay (ELISA), polymerase chain reaction (PCR) technieken, gelelektroforese testen, en massaspectrometrie (MS). Over het algemeen zijn deze labels zijn fluorescerende, radiologische of colorimetrische in de natuur en zijn direct of indirect aan de moleculaire doelwit van belang. Hoewel het gebruik van labels is algemeen aanvaard en heeft een aantal voordelen, zijn er nadelen die de ontwikkeling van nieuwe label-free methoden zijn stimulerend voor het meten van deze interacties. Deze nadelen zijn praktische facetten zoals verhoogde test kosten, reagens levensduur en bruikbaarheid, opslag en bezorgdheid over de veiligheid, verspilde tijd en moeite in de etikettering, en de variabiliteit tussen de verschillende reagentia te wijten aan de etikettering processen of labels zelf. Over een wetenschappelijk onderzoek basis, kan het gebruik van deze labels introduceren ook problemen, zoals problemen met effecten op eiwit-functionaliteit /-structuur door de aanwezigheid van de aangesloten labels en het onvermogen om rechtstreeks te meten van de interacties in real time.

Hier wordt gepresenteerd is het gebruik van een nieuw label-free optische biosensor die vatbaar is voor studies microarray, de zogenoemde Interferometrische reflectie Imaging Sensor (IRIS), voor het opsporen van eiwitten, DNA, antigene materiaal, hele pathogenen (virionen) en andere biologisch materiaal. Het IRIS-systeem is aangetoond dat een hoge gevoeligheid, precisie en reproduceerbaarheid hebben voor verschillende biomoleculaire interacties [1-3]. Voordelen zijn onder andere multiplex imaging capaciteit, real-time en eindpunt meetmogelijkheden, en andere high-throughput attributen zoals verminderde reagensverbruik en een vermindering van de test tijden. Daarnaast is de IRIS-platform is eenvoudig te gebruiken, vereist goedkope apparatuur, en maakt gebruik van silicium gebaseerde vaste-fase-assay componenten waardoor zij aansluit bij veel hedendaagse oppervlakte chemie benaderingen.

Hier presenteren we het gebruik van het IRIS-systeem van de voorbereiding van de sonde arrays voor incubatie en de meting van het doel de binding aan de analyse van de resultaten in een eindpunt formaat. Het model systeem zal de vangst van de beoogde antilichamen die specifiek zijn voor humaan serumalbumine (HSA) op de HSA-spotted substraten worden.

Protocol

1. Voorbereiding van de ondergrond

1. Coat gelaagde silicium-SiO ₂ substraten met self-adsorberende copoly (DMA-NAS-KAARTEN):
   1. Copolymeer synthese, chemische structuur, en coating proces zijn gepubliceerd in: G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, LE Depero. Karakterisering van een polymeer Geadsorbeerd Coating voor DNA Microarray Glass dia's. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-1358.
   2. Kortom, voor te bereiden polymeeroplossing door het toevoegen van 100 mg van polymeer tot 5 ml gedeïoniseerd (DI) water en voeg 5 ml van 40% verzadigd ammoniumsulfaat ((NH ₄₎ 2SO _4)-oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 0,92 M. te bereiken
   3. Dompel chips in oplossing gedurende 30 minuten op een shaker en daarna grondig afspoelen met DI-water. Droog ze grondig met Argon / N ₂ gas.
   4. Bak frites bij 80 ° C gedurende 15 minuten.
2. Store polymeer gecoate substraten / chips in een droge omgeving (vacuüm exsiccator) voor maximaal 3 maanden tot probe spotten procedure.

2. Voorbereiding van de Probe Array: antilichamen, antigenen, ss / dsDNA, RNA, enz.

1. Verdunnen sonde (s) aan de juiste concentratie in de gewenste buffer. Deze stap kan aanzienlijk worden variëren, maar een typisch experiment maakt gebruik van antigeen of IgG bij een concentratie van 0,5 mg / ml (bereik van 0,1 -1 mg / ml) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij pH ≈ 7,4.
2. Plaats oplossingen in een 96 - of 384-wells plaat (of standaard bron plaat voor de spotter gebruikt)
3. Setup spotten parameters voor de gewenste gekleurde array: bepalen van de juiste parameters voor het spotten van de oppervlakte en oplossingen worden gebruikt (dwell tijden, naderingssnelheden, etc.). Bepaal het aantal herhalingen van elke conditie per grid, de grid lay-out, het aantal repliceren netten, en de gewenste spotten locatie op de chip. Plaats substraten en de bron plaat op de juiste locaties, controleer dan of afval en aanbod flessen klaar voor zijn, en beginnen met afdrukken uit te voeren.
4. Na het spotten is afgewerkt plaats substraten in een vochtige omgeving 's nachts (4-18 uur) om immobilisatie en uitschakelen proces door te gaan.
5. Was ondergronden: plaats ze in de volgende oplossingen voor drie minuten voor drie afzonderlijke wasbeurten: PBS met 0,1% Tween (PBST), PBS, en tenslotte gedeïoniseerd (DI) water. Afhankelijk van het type van het experiment (nat vs droog), droog de chip met Argon gas en te beginnen incubatie of plaats de chip in een stromingskamer en te monteren.
6. Deactiveer de resterende NHS groepen aan copolymeer oppervlak door onderdompeling van de chips in een 50 mM oplossing van ethanolamine met de pH ingesteld op 7,4 gedurende 30 minuten tijdens een shaker plaat. Een primaire amine-bevattende verbinding, zoals hydroxylamine of Tris kan ook worden gebruikt, zolang de bereide oplossing is veilig te gebruiken met eiwitten. Spoel de deactivering oplossing met behulp van PBS dan DI-water.
7. Optionele stap (afhankelijk van de oppervlakte chemie wordt gebruikt): Block oppervlak met behulp van een oplossing van BSA, caseïne, of gerehydrateerd melk gedurende 30 minuten. Voor de huidige polymere oppervlakte chemie die we gebruiken, doen we niet uitvoeren van deze stap als het polymeerskelet daden om te voorkomen dat niet-specifieke eiwit binding.

3. Data Acquisition en Incubatiecentrum Procedure: Endpoint formaat

1. Maak een oplossing van het doelwit van belang in de gewenste buffer. Hier zal het een oplossing van de juiste concentratie van anti-BSA in PBS (ex: maak 1-10 ml van een 10 ng / mL oplossing van Anti-BSA in PBS). Zorg er ook voor om een ​​equivalente hoeveelheid buffer (zonder doel) hebben voor de negatieve controle incubatie.
2. Neem een ​​silicium spiegel scan voor het normaliseren van alle verzamelde gegevens vervolgens.
3. Scan de voorbereide probe array met het IRIS-systeem voorafgaand aan de incubatie stap om de eerste optische hoogte (massa) op elke plek te bepalen. Dit zal zorgen voor een goede analyse van veranderingen in de massa aan de oppervlakte, dat wil zeggen het niveau van de binding, na de incubatie. Hier zal een paar parameters worden aangepast voor het huidige experiment, zoals de belichtingstijd, gezichtsveld, die gedijt scherpstellen, etc.
4. Dompel chip (s) in bereide oplossing voor 1 uur op een shaker plaat. De incubatietijd kan variëren aanzienlijk afhankelijk van het niveau van agitatie, de concentratie van de doelstelling wordt gedetecteerd, het transport eigenschappen van de stroming kamer (als een real-time detectie mode wordt gebruikt), de affiniteiten van de target-probe paar, enz. .
5. Na de incubatie, herhaal dan de procedure was zoals beschreven in stap 2.5)
6. Scan van dezelfde probe array met het IRIS-systeem en het verkrijgen van post-incubatie beelden voor pre-incubatie vergelijking.
7. Herhaal dit proces voor de verschillende incubatie stappen, indien nodig, bijvoorbeeld in een sandwich-test format waarbij een secundair antilichaam wordt gebruikt.

4. Data Analysis

1. Passen de verzamelde beelden voor elk IRIS scan (volgorde van de intensiteit beelden), met behulp van de lab-ontwikkelde software om proDuce een beeld van de sonde array met optische dikte informatie. Een snelle kwalitatieve analyse van de binding kan worden uitgevoerd door het aftrekken van (aangetekende) post-en pre-incubatie beelden. Bindend zal verschijnen als een verandering in de intensiteit op die plekken waar de massa veranderingen waargenomen. Voor de kwantitatieve analyse, bepalen de massa dichtheden van elke plek ten opzichte van de achtergrond door het gemiddelde optische dikte informatie voor elke pixel in een plek en een ring buiten de plek en het maken van een directe vergelijking van deze twee gebieden.

5. Representatieve resultaten:

Figuur 1 toont een voorbeeld schema van de gelaagde Si-SiO ₂ IRIS substraat gespot met een vertegenwoordiger van antilichaam array. Elk antilichaam ensemble is gespot in repliceren met specificiteit voor een ander epitoop gericht is op verschillende eiwitten. Twee verschillende gehele virussen en een viraal eiwit worden vertegenwoordigd als voorbeeld doelen. Negatieve controle antilichamen zijn afhankelijk van de test en kan niet-specifieke en / of virus-specifiek zijn.

Figuur 2 toont de binding van humaan serumalbumine (HSA)-specifieke antilichamen tegen een reeks van gevlekte HSA en konijnen-IgG (controle) vlekken. Zoals hier te zien, na montage en bepaling van de optische diktes voor de pre-en post-incubatie beelden, kan een verschil afbeelding voor de binding array gecreëerd om de kwalitatieve evaluatie van binding. Kwantitatieve analyse blijkt dat een 2,05 en 0,13 nanometer betekenen optische hoogte verandering werd waargenomen voor de HSA en het konijn IgG plekken respectievelijk, voor een anti-HSA incubatie concentratie van 500 ng / mL.

Figuur 3 toont een IRIS-meting van Fur eiwitbinding afhankelijkheid van eiwit concentratie en dsDNA oligomeer lengte. De bovenste grafiek toont absolute optische hoogtemetingen voor de eerste geïmmobiliseerd oligomeer sonde hoogtes en post-incubatie Fur bindend. Toenemende concentraties van Fur (50, 100, 200 nM) resulteerde in een verhoogde binding aan DNA-sondes. De lengte van de oligomeren heeft ook invloed op Fur binding met een langere sequenties resulteert in meer bindend. Hier, error bars geven een standaarddeviatie van het gemiddelde. De onderste grafiek toont berekend Fur eiwit dimeer binding per dsDNA streng. Dimeer binding werd significant verhoogd bij een Fur eiwit concentratie van 200 nM wijst op een hoog niveau van niet-specifieke binding.

Figuur 1. Schematische voorstelling van een voorbeeld probe-array die gewoonlijk worden gebruikt in een experiment om specifieke virussen en virale componenten op te sporen in een multiplexed mode met het IRIS-systeem.

Figuur 2. Post-incubatie verschil de afbeelding voor een binding van humaan serum albumine-specifieke antilichamen tegen gespot HSA verzameld met dit label-free-systeem bij een concentratie van 500 ng / mL. Het biomateriaal massadichtheid voor elke plek wordt bepaald door het gemiddelde optische dikte van informatie binnen een plek en vervolgens deze te vergelijken met het gemiddelde van een ring rond de plek die de achtergrond.

Figuur 3. Perceel van bindende gegevens voor Fur eiwit interacties met gevlekte double-stranded oligomeren met een bekende consensus sequentie op basis van oligomeer lengte, de locatie van de consensus sequentie binnen het oligomeer en Fur eiwitconcentratie. Informatie over de absolute hoeveelheid van de Fur-eiwit gebonden aan elke gespot volgorde (top) kan worden gebruikt om het aantal Fur dimeren gebonden aan elk type van oligomeer (onder) te schatten.

Discussie

De IRIS-platform is een eenvoudige en snelle systeem te gebruiken voor het verzamelen van high-throughput binding data in een microarray formaat. Door het covalent immobiliseren verschillende functionele eiwit of DNA-probes op een oppervlak, target antigenen / biomarkers / etc. kunnen worden vastgelegd van de oplossing, net als in een immunoassay. Meting van deze interacties tussen probe omstandigheden in een eindpunt of real-time formaat met het IRIS-systeem zorgt voor zeer gevoelige en kwantitatieve informatie te worden verzameld voor elke interactie. De vertegenwoordiger experiment hier beschreven is slechts een voorbeeld van de types van interacties die kunnen worden bestudeerd met deze techniek. Detectie van transcriptiefactoren, virale antigenen, en hele virussen is eerder aangetoond en vertegenwoordigt slechts een paar voorbeelden van de soorten analyses die de IRIS gemakkelijk aankan.

Materialen

1. Silicium wafers met 500 nm van thermisch gegroeid siliciumdioxide, Silicon Valley Microelectronics, custom order
2. Ammoniumsulfaat poeder, Sigma-Aldrich cat. # A5132
3. Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 10X klaar te concentreren, Fisher Scientific kat. # BP665-1
4. Antilichaam tegen humaan serumalbumine (Anti-HSA), Sigma-Aldrich cat. # A0433
5. Humaan serumalbumine (HSA), Sigma-Aldrich cat. # A9511
6. Argon of stikstofgas (ultra-hoge zuiverheid), Airgas cat. # AR UHP300 of # NI UHP300
7. Petrischalen, 60 mm x 15 mm, Fisher Scientific kat. # 0875713A
8. Scienceware ® vacuüm exsiccator, Sigma-Aldrich cat. # Z119016
9. Reactievaatjes, Fisher Scientific kat. # 05-408-120
10. 96-well platen, een laag cel-binding, Nalgene Nunc International kat. # 145399
11. BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer, Bio-Rad
12. Tween-20, Sigma-Aldrich # P1379
13. Ethanolamine, Sigma-Aldrich # 398136
14. Hydroxylamine, Thermo Scientific kat. # 26103
15. Multi-purpose rotator, Thermo Scientific (Barnstead International), model # 2314, cat. # 2314Q
16. Retiga 2000R camera, QImaging kat. # 01-RET-2000R-FM-12
17. AcuLED verlichting bron, PerkinElmer, custom order
18. Optische componenten (lenzen, doelstellingen, openingen, rails, palen, enz.), Thorlabs