Generatie van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed Met behulp van de STEMCCA lentivirale vector

Andreia Gianotti Sommer; Sarah S. Rozelle; Spencer Sullivan; Jason A. Mills; Seon-Mi Park; Brenden W. Smith; Amulya M. Iyer; Deborah L. French; Darrell N. Kotton; Paul Gadue; George J. Murphy; Gustavo Mostoslavsky

doi:10.3791/4327

Methodenartikel

Generatie van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed Met behulp van de STEMCCA lentivirale vector

26.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/4327

⸱

31 oktober 2012

Andreia Gianotti Sommer¹ , Sarah S. Rozelle¹ , Spencer Sullivan² , Jason A. Mills³ , Seon-Mi Park¹ , Brenden W. Smith¹ , Amulya M. Iyer¹ , Deborah L. French³ , Darrell N. Kotton¹ , Paul Gadue³ , George J. Murphy¹ , Gustavo Mostoslavsky¹

¹Center for Regenerative Medicine (CReM), Boston University School of Medicine, ²Department of Hematology, Children's Hospital of Philadelphia, ³Center for Cellular and Molecular Therapeutics, Children's Hospital of Philadelphia

In dit artikel

Samenvatting

Hier laten we een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van menselijke iPSCs 3-4 ml van perifeer bloed met een lentivirale vector herprogrammering. Herprogrammering van direct beschikbare bloedcellen belooft om het gebruik van IPSC technologie te versnellen door het toegankelijk voor een breder onderzoeksgemeenschap.

Samenvatting

Door ectopische expressie van vier transcriptiefactoren, Oct4, Klf4, SOX2 en cMyc kunnen menselijke somatische cellen worden omgezet pluripotent toestand genereren zogenaamde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) ^1-4. Patiënt-specifieke iPSCs missen de ethische bezwaren die embryonale stamcellen (SER's) omringen en mogelijk zou afstoting te omzeilen. Zo zijn iPSCs veel aandacht voor de ziekte modelstudies de screening van farmacologische verbindingen en regeneratieve therapieën ^5.

We hebben aangetoond dat de generatie van transgene-vrije menselijke iPSCs van patiënten met verschillende longaandoeningen met een enkele accijnsproducten polycistronisch lentivirale Stem Cell Cassette (STEMCCA) dat codeert voor het Yamanaka factoren ^6. Deze iPSC lijnen werden gegenereerd uit huidfibroblasten, de meest voorkomende celtype gebruikt voor het herprogrammeren. Normaal verkrijgen fibroblasten heeft een huid biopsie punch gevolgd door expansie van de cels in de cultuur voor een paar passages. Belangrijker is dat een aantal groepen rapporteerden de herprogrammering van humane perifere bloedcellen in iPSCs ^7-9. In een studie werd een induceerbare Tet versie van de vector gebruikt STEMCCA ^9, welk de bloedcellen gelijktijdig geïnfecteerd met een constitutief actieve lentivirus codeert omgekeerde tetracycline transactivator. In tegenstelling tot fibroblasten, kunnen perifere bloedcellen worden verzameld via minimaal invasieve procedures, wat veel ongemak en pijn van de patiënt. Een eenvoudige en effectieve protocol voor het herprogrammeren van bloedcellen met behulp van een constitutieve enkele accijnsgoederen vector kan versnellen van de toepassing van IPSC-technologie door het toegankelijk voor een breder onderzoeksgemeenschap. Bovendien herprogrammering van perifere bloedcellen maakt het genereren van iPSCs van individuen waarin huidbiopsies worden vermeden (dwz. Afwijkende littekens) of door reeds bestaande aandoeningen preventing toegang tot stansbiopsieën.

Hier laten we zien een protocol voor het genereren van menselijke iPSCs van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) met een floxed-accijnsgoederen lentivirale vector constitutief tot expressie de 4 factoren. Vers verzameld of ontdooide PBMC's worden uitgebreid voor 9 dagen, zoals beschreven ^10,11 in medium bevattende ascorbinezuur, SCF, IGF-1, IL-3 en EPO alvorens getransduceerd met de STEMCCA lentivirus. Cellen worden vervolgens uitgeplaat op MEFs en ESC-achtige kolonies te visualiseren twee weken na infectie. Tenslotte worden geselecteerde klonen uitgebreid en getest op de expressie van markers pluripotentie de SSEA-4, Tra-1-60 en Tra-1-81. Dit protocol is eenvoudige, robuuste en zeer consistent, een betrouwbare methode voor het genereren van menselijke iPSCs uit gemakkelijk toegankelijke 4 ml bloed.

Protocol

1. Isolatie en expansie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMCs)

DAG 0

Trek 4 ml van perifeer bloed in een BD Vacutainer CPT Cell Voorbereiding Buis met natriumcitraat. Inverteer de buis 8 tot 10 keer en centrifugeer bij 1800 g gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Idealiter zou deze stap gedaan worden binnen 2 uur na afname.
Verzamel de mononucleaire cellen (MC's) door pipetteren de buffy coat (cellaag tussen gel barrière en plasma) in een steriele 15 ml conische centrifugebuis. Breng totale volume op 10 ml met steriel fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), invertsuiker herhaaldelijk en centrifugeer bij 300 xg gedurende 15 minuten.
Resuspendeer de cellen in 10 ml steriel PBS en voer cellen. Breng 1 tot 2x10 ⁶ cellen in een steriele 15 ml conische centrifugebuis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten.
Resuspendeer de cellen in 2 ml expansie medium (EM) (QBSF-60 Stem Cell medium dat 50 ug / ml Ascorbic Acid, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL-3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml IGF-1, 1 uM dexamethason en 100 ug / ml primocin of 1% Pen / Strep) en overbrengen in een putje van een 12-well plaat. Incubeer de cellen in een 37 ° C, _5% CO2 incubator.
Centrifugeer overige cellen bij 300 x g gedurende 10 min en vries ~ 2x10 ⁶ cellen / flacon in FBS bevattende 10% DMSO.
Het protocol die ingevroren PBMCs starten ontdooien 1 injectieflacon cellen in 10 ml van QBSF medium en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten. Resuspendeer de cellen in 2 ml EM en overgedragen naar een putje van een 12-well plaat. Incubeer de cellen in een 37 ° C, _5% CO2 incubator.

Dag 3 en dag 6

Breng de cellen naar een steriele 15 ml conische buis en eenmaal wassen en met 1 ml van QBSF-60 Stem Cell Medium voor hechtende cellen te verzamelen.
Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 10 minuten.
Resuspendeer de cellen in 2 ml EM en goed naar een van een 12-Well plaat. Incubeer de cellen in een 37 ° C, _5% CO2 incubator.

2. Transductie van PBMCs met STEMCCA Lentivirus

DAG 9

Breng de cellen naar een steriele 15 ml conische buis en eenmaal wassen en met 1 ml van QBSF-60 Stem Cell Medium voor hechtende cellen te verzamelen.
Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 10 minuten.
Resuspendeer de cellen in 1 ml vers EM met 5 pg / ml polybreen en STEMCCA lentivirus (MOI = 1 tot 10) en overbrenging naar een putje van een 12-well plaat. (Het protocol beschrijft de productie van lentivirale deeltjes is te vinden op http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/ )
Draai de plaat bij 2250 rpm bij 25 ° C gedurende 90 minuten.
Na het centrifugeren, voeg een extra 1 ml vers EM met 5 pg / ml polybreen voor een totaal van 2 ml medium en incubeer de plaat in een 37 ° C,_5% CO2 incubator.

DAG 10

Breng de cellen naar een steriele 15 ml conische buis en eenmaal wassen en met 1 ml van QBSF-60 Stem Cell Medium voor hechtende cellen te verzamelen.
Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 10 minuten.
Resuspendeer de cellen in 2 ml EM en overbrengen in een well van een 12-well plaat. Incubeer de cellen in een 37 ° C, _5% CO2 incubator.

3. Plating getransduceerde cellen op MEF

DAG 11

Coat de putjes van een 6-wells plaat met 0,1% gelatine en plaat geïnactiveerd muis embryonale fibroblasten (MEF) op 2x10 ⁵ cellen / putje in MEF medium (IMDM dat 10% FBS, 1% niet-essentiële aminozuren, 100 pM β- mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 100 ug / ml primocin of 1% Pen / Strep). Bereid 3 wells per infectie.

DAG 12

Breng de cellen naar een steriele 15 ml conische buis en eenmaal wassen en met 1 ml van QBSF-60 Stem Cell Medium voor hechtende cellen te verzamelen.
Resuspendeer de cellen in 3 ml van MEF medium dat 10 ng / ml bFGF en ascorbinezuur en groeifactoren in dezelfde concentraties als gebruikt in EM medium (50 ug / ml ascorbinezuur, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL -3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml IGF-1, 1 uM dexamethason).
Plaat 1 ml cellen per putje van een 6-wells plaat met MEFs. Voeg 1,5 ml van MEF media met bFGF, ascorbinezuur en groeifactoren voor een totaal van 2,5 ml medium / putje.
Draai de plaat bij 500 rpm bij 25 ° C gedurende 30 minuten. Incubeer de plaat in een 37 ° C, _5% CO2 incubator.

DAG 14

Feed cellen om de dag met 2,5 ml van MEF medium dat 10 ng / ml bFGF en 50 ug / ml ascorbinezuur (geen groeifactoren). Zuig en gooi drijvende cellen met elke feed.
Voeg extra MEFs als nodig (meestal een keer per week).

p "> ~ DAG 20

Zodra kleine kolonies verschijnen, voer cellen dagelijks met 2 ml van menselijke embryonale stamcellen (hESC) medium (DMEM/F12 dat 20% Knockout Serum vervanging, 1% niet-essentiële aminozuren, 100 uM β-mercapto-ethanol, 2 mM L-glutamine , 100 ug / ml primocin of 1% Pen / Strep en 10 ng / ml bFGF).

4. Picking en uitbreiding van IPSC Clones

~ DAG 30 tot 40

Extra elke kolonie in afzonderlijke putjes van een 12-well plaat vooraf geënt met geïnactiveerd MEFs die 1 ml / putje hESC medium plus 10 pM Stemolecule Y27632 (ROCK inhibitor).
Dagelijks voeden cellen daarna met 1 ml van hESC medium (geen ROCK inhibitor).

5. Immunofluorescentiekleuring voor Pluripotentie Markers

Kleuring werd uitgevoerd met de kit "ES Cell Marker Sample Kit" van Millipore en volgens protocollen van de fabrikant.

6. Excisie van Integnominaal STEMCCA Vector

Excisie van herprogrammering cassette wordt bereikt met behulp van een Cre-IRES-Puro expressie vector na transfectie en kortstondige puromycineselectie als beschreven ^6.