Osteoclast Afleiding van Mouse Bone Marrow

Samenvatting

Osteoclasten zijn de voornaamste botresorberende cellen in het lichaam. Het vermogen om osteoclasten te isoleren in grote aantallen heeft tot aanzienlijke vooruitgang in het inzicht van osteoclast biologie. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het isoleren, kweken en kwantificeren van osteoclasten in vitro.

Samenvatting

Osteoclasten zijn zeer gespecialiseerde cellen die zijn afgeleid van de monocyt / macrofagen van het beenmerg. Hun unieke capaciteit om zowel de organische als anorganische matrices bot resorberen betekent dat zij een belangrijke rol in de regulering skelet remodeling. Samen osteoblasten en osteoclasten zijn verantwoordelijk voor het dynamisch koppelen proces dat zowel botresorptie en botvorming gezamenlijk optreden om het normale skelet in gezondheid en ziekte handhaven omvat.

Als belangrijkste botresorberende cellen in het lichaam, kunnen veranderingen in osteoclastdifferentiatie of functie leiden tot ingrijpende effecten in het lichaam. Ziekten geassocieerd met veranderde functie van osteoclasten kan in ernst variëren van dodelijke neonatale ziekte gevolg van het niet een merg ruimte hematopoiese vormen om vaker waargenomen aandoeningen zoals osteoporose, waarbij overmatige osteoclastische botresorptie predisponeert vorming breken. ent "> Het vermogen om osteoclasten te isoleren in hoge aantallen in vitro is toegestaan ​​aanzienlijke vooruitgang in het inzicht van de botombouw cyclus en is de weg voor de ontdekking van nieuwe therapeutische strategieën die deze ziekten te bestrijden verhard.

Hier beschrijven we een protocol voor het isoleren en kweken osteoclasten uit muizen beenmerg dat grote aantallen osteoclasten oplevert.

Inleiding

Botremodellering is dynamisch en het gaat om de koppeling van botvorming met botresorptie ^1. Dit strak gereguleerd proces is verantwoordelijk voor het skelet tijdens normale homeostase, en in reactie op letsel en ziekte.

Osteoclasten zijn uniek, meerkernige cellen die in staat zijn resorbeerbare zowel de organische als anorganische matrices van bot. Osteoclasten zijn afgeleid van de monocyt / macrofagen van het beenmerg ^2-5. Afwijkingen in de functie of vorming van osteoclasten kan resulteren in verschillende klinische aandoeningen, waaronder gemeenschappelijke aandoeningen zoals osteoporose.

Het vermogen om osteoclasten in vitro genereren is toegestaan ​​aanzienlijke vooruitgang in ons begrip van botbiologie ^6. Daardoor worden nieuwe opkomende therapeutische middelen aan osteoclasten ziekten die verantwoordelijk zijn voor aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit behandelen ⁷ . Homeostatische onderhoud van de botmassa en kracht vereist de gezamenlijke actie van botvormende osteoblasten en-botresorberende osteoclasten ^8,9. Bothomeostase gewijzigd wordt een aantal ziekten, waaronder postmenopauzale osteoporose, waarbij verhoogde osteoclastische activiteit leidt tot pathogene verlies van botmassa en dichtheid ^10. Met toenemende beschikbaarheid van transgene muismodellen voor humane ziekten, is er meer gelegenheid om de rol van de osteoclasten ontcijferen menselijke botziekte ^11-13.

Talrijke protocollen voor osteoclasten kweektechnieken verschijnen in de literatuur vele variaties beschreven ^9,12,14. Xing en collega's beschrijven soortgelijke methodologie de hieronder beschreven in de beschrijving van osteoclastogenic assays van murine beenmergcellen protocol. Echter de beenmergcellen na lang bot oogst vrij, Xing et al. Spoel de mergholte met α-MEM compleet medium^14. Catalfamo onderzoekt het effect van hyperglycemie op de functie van osteoclasten en beschrijft een werkwijze waarbij alle cellen gemobiliseerd beenmerg spoelen worden gedurende 24 uur, waarna de niet-hechtende cellen verwijderd ^12, een techniek die ook door Boyle et al . ⁹ De eerder gepubliceerde protocollen vereisen het gebruik van spoelen van het beenmerg, een vervelende praktijk, die ook introduceert het risico van een naald prikt en verlies van waardevolle beenmerg, als een beide uiteinden van het bot moet snijden. Het protocol, dat we beschrijven implementeert het gebruik van een mortier en stamper om osteoclasten te isoleren, die vergelijkbaar is met de werkwijze beschreven door macrofaag isolatie Weischenfeldt et al. ¹⁵

Onze ervaring is echter dat osteoclast isolatie en in vitro kweek met eerder gepubliceerde technieken leidt tot variabele resultaten inzake osteoclast productie, vaak resulterendin een onvermogen te cultiveren osteoclasten. Daarom hebben we een protocol waarmee de consequente scheiding van muis beenmerg grote aantallen meerkernige osteoclasten in vitro produceren met een geschatte opbrengst van 70-80% van de cellen aanvankelijk vormen macrofagen uitgeplaat en vervolgens osteoclasten ontwikkeld in aanwezigheid van osteoclasten inductie media.

Protocol

OPMERKING: ethische verklaring: Al het onderzoek waarbij gewervelde dieren werd uitgevoerd conform de protocollen door de Stanford administratieve Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) goedgekeurd.

1. Voorbereiding

1. Laat 10 ml commercieel verkrijgbaar dichtheidsgradiënt celscheiding media (die polysucrose diatrizoaat en natrium bevat, aangepast aan een dichtheid van 1.077 g / ml) tot KT te komen in een 50 ml conische buis.
2. Bereid stroomcytometrie (FACS) buffer met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en 2% foetaal kalfsserum (FCS). Neem een ​​50 ml aliquot en deze hoeveelheid bij KT gebruik behouden tijdens de dichtheidsgradiënt celscheiding media stap.
3. Neem een ​​emmer ijs klaar om geïsoleerde weefsels en cellen in tijdens de isolatie procedure te handhaven.

2. Bereid Cultuur Media

1. Bereid basale media: MEM (minimaal essentieel medium), zonder fenolrood (500 ml), glutamaat (1x), FCS (10x), 10.000 eenheden / ml penicillin (1x).
2. Filter basale media met een 0,22 urn filter.
3. Bereid beenmerg macrofagen inductie media:
   1. Breng 50 ml van de basale media bereid in stap 2.1.
   2. Voeg prostaglandine E2 (PGE2, heer 352,465 g / mol) bij 10 ^-7 M uiteindelijke concentratie.
   3. Add macrofaag-kolonie stimulerende factor (M-CSF) en 10 ng / ml.
   4. Laat de uiteindelijke oplossing van het beenmerg macrofaag stimulerende media niet filteren.
4. Bereiden van osteoclasten inductie media:
   1. Breng 50 ml van de basale media bereid in stap 2.1.
   2. Voeg prostaglandine E2 (PGE2, heer 352,465 g / mol) bij 10 ^-7 M uiteindelijke concentratie
   3. Add macrofaag-kolonie stimulerende factor (M-CSF) en 10 ng / ml.
   4. RANKL voeg bij 10 ng / ml.
   5. Laat de uiteindelijke oplossing van osteoclasten inductie media niet filteren.

3. Bone Marrow Isolatie

1. Euthanaseren een C57BL / 6 muiswaarbij kooldioxide inhalatie methode, gevolgd door cervicale dislocatie.
   OPMERKING: Knaagdieren moeten worden gedood door gekwalificeerd personeel met de juiste techniek, apparatuur en middelen.
2. Positie en zet de muis op een dissectie bord en spuit met 70% alcohol.
3. Ontleden scheen-, tibiae, opperarmbeenderen en wervelkolom.
   1. Begin met de muis in rugligging. Een insnijding verticaal langs de onderste ledematen en beginnen ontleden langs de lengte van het dijbeen en scheenbeen van delen zacht weefsel bijlagen. Tenslotte ontwrichten botten van de knie en het heupgewricht aan botten volledig te bevrijden van het skelet.
   2. Overgaan tot een incisie langs de lengte van de bovenste ledematen aan de humerus te isoleren. Ontwrichten het opperarmbeen op de schouder en elleboog gewrichten door het ontleden van zacht weefsel capsulaire attachment.
   3. Tot slot zet de muis over, zodat de muis ligt gevoelig. Voeg een incisie langs de lengte van de wervelkolom, in de middellijn. Let op de paravertebrale softweefsel aan elke zijde van de wervelkolom en incisielaken langs de benige rand van de wervelkolom, ontleden door de paravertebrale zachte weefselmassa. Met behulp van een schaar, maken een horizontale snede over de rug aan de basis van de hals, en aan het einde van de ruggengraat, net proximaal van de staart inbrengen bevrijdt de ruggengraat van zacht weefsel beslag.
4. Zodra de botten worden geoogst, bewaar ze in FACS buffer op ijs.
5. Gebruik tissue om spieren en zacht weefsel te verwijderen van de botten.
6. Leg de schoongemaakte botten in een vijzel met 3 ml FACS buffer.
7. Plet de botten voorzichtig in de vijzel.
8. Zuig uit de met bloed bevlekte vloeistof en de overdracht in een 50 ml conische buis door het passeren van de oplossing door een 70 micrometer cel zeef.
9. Voeg 5 ml FACS buffer op de gemalen bot en verpletteren verder. Nogmaals, verwijder de vloeistof met behulp van een pipet en overgebracht in de 50 ml conische buis door middel van een 70 micrometer zeef.
10. Typisch plet de botten twice drie maal in vers FACS buffer, met een vijzel en stamper, telkens toevoegen van een verdere 5 ml vers FACS buffer, totdat de vloeistof vlekken rood.
11. Centrifugeer het beenmerg oplossing bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om een ​​celpellet verkregen.

4. Gradient Scheiding van beenmergcellen

1. Zuig het supernatant en resuspendeer in 10 ml FACS buffer (gehandhaafd op RT).
2. Neem de 50 ml conische buis met 10 ml van commercieel verkrijgbaar dichtheidsgradiënt cel scheidingsmedium (RT).
3. Laag het beenmerg oplossing op de dichtheidsgradiënt celscheiding media. Doe dit langzaam met behulp van een elektrische pipet. Hoek de pipetpunt tegen het binnenoppervlak nabij de top van de conische buis en kantel de conische buis tot ongeveer 30 °. Een langzame snelheid op de pipet zachtjes verdrijven het beenmerg oplossing om niet de dichtheidsgradiënt celscheiding media verstoren.
   OPMERKING: Uiteindelijk zal erzijn een duidelijke afbakening tussen de twee oplossingen (mobiele oplossing en dichtheidsgradiënt- celscheiding media oplossing).
4. Met behulp van een centrifuge RT, centrifugeer de dichtheidsgradiënt celscheiding media en celoplossing evenwichtige centrifuge bij 200 xg gedurende 15 min. Bovendien, verwijdert versnelling en vertraging van de centrifuge om de adequate fasescheiding met de dichtheidsgradiënt celscheiding media gradiënt.
5. Na centrifugatie zuigen uit de troebele middelste laag die de beenmergcellen van belang bevat.
6. Transfer deze cellen in een nieuwe conische buis. Voeg 20 ml van aanvullende FACS buffer (op ijs gehouden) om de cellen te wassen.
7. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om een ​​celpellet verkregen.
8. Resuspendeer de uiteindelijke celpellet in 1 ml van macrofaag stimulerend media om voor celtelling met een hemocytometer.

5. Celtelling

1. Neem 10 pi van de celoplossing en meng10 pi trypan blauw. Belasting 10 ul van de verkregen mengsel op een hemocytometer en het verkrijgen van de celtelling per ml oplossing.

6. celkweek

1. Plaats 2 ml van macrofaag stimulerende media in elk putje van een 24-well plaat.
2. Voeg 200.000 cellen in elk putje.
   OPMERKING: In onze ervaring, cel-plating dichtheid is een van de meest cruciale vereisten voor een adequate in vitro kweken van osteoclasten.
3. Schud voorzichtig de plaat en plaats in een reguliere incubator bij 37 ° C.
4. Laat de media niet veranderen voor 3 dagen.
5. Na 3 dagen in macrofaag stimulerende media, veranderen de media om osteoclasten media.
6. Hierna verandert de media dagelijks gedurende 5-7 dagen, op welk moment, moeten grote, meerkernige osteoclasten zichtbaar op de cultuur plaat zijn.

7. kleuring met Tartraat Resistente Acid fosfatase (TRAP)

1. Na 5-7 dagen in vitro cultuur, zuigen de media uit de cultuur ook.
2. Was de putjes voorzichtig met 1x PBS drie keer.
3. Fixeer de cellen door toevoeging van 4% paraformaldehyde oplossing en laat gedurende 1 uur bij 4 ° C.
4. Gedurende deze tijd, bereid de TRAP vlek (dat commercieel verkrijgbaar) door voorverwarmen tot 37 ° C.
5. Na 1 uur in paraformaldehyde, zuigen off paraformaldehyde en was voorzichtig 3 keer met 1x PBS.
6. Voeg 1 ml voorverwarmde TRAP vlek in elk putje van de plaat wordt gekleurd.
7. Plaats de plaat in een incubator bij 37 ° C gedurende 1 uur, afgeschermd van licht.
8. Na 1 uur, zuigen uit de TRAP vlek.
9. Was de putjes 3 keer met voorverwarmde gedemineraliseerd water.
10. Tegenkleuring het goed met Gill's Hematoxylin (LET) voor 1-2 min.
11. Afbeelding osteoclasten behulp helderveld microscopie.
12. Was putjes met gedeïoniseerd water totdat voldoende kleurintensiteit van de vlek wordt bereikt, gewoonlijk als kernen verschijnen blue.

8. Osteoclast Resorptie Assay

1. Gebruik een los verkrijgbare 24-well polystyreen cultuur schotel die vooraf bekleed met bot substraat of een anorganische kristallijne calciumfosfaat coating.
2. Plaats 2 ml van macrofaag stimulerende media in elk putje.
3. Voeg 200.000 vers geïsoleerde beenmerg aan het eind van stap 2 aan elk putje cellen.
4. Schud voorzichtig de plaat voorafgaand aan het plaatsen in een incubator bij 37 ° C gedurende 3 dagen.
5. Op dag 3, veranderen de media om de differentiatie van osteoclasten media.
6. Voer dagelijks media verandert met de differentiatie van osteoclasten media gedurende 5-7 dagen.

9. Het kwantificeren van Osteoclast Resorptie Activity

1. Na 5-7 dagen in vitro kweek in osteoclastdifferentiatie media op gemineraliseerde substraat, analyseren de gemineraliseerde oppervlak, zoals hieronder beschreven, het vermogen van osteoclasten te vormen resorpti beoordelenop de installaties, een indicator van de osteoclastenactiviteit.
2. Zuig media uit de resorptie testplaat en voeg 100 ul van 10% bleekwater oplossing in elk putje.
3. Incubeer de cellen met 10% bleekmiddel oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
4. Was de putjes 3 keer met gedestilleerd water.
5. Aspireren uit het resterende water en schud het overtollige water uit de plaat en laat aan de lucht drogen voor 3-5 uur.
6. Tegenkleuring de plaat met een in de handel verkrijgbaar Von Kossa kleuring kit zodat voor eenvoudiger visualisatie van de niet-geresorbeerd substraat.
7. Gebruik heldere veld microscopie om beelden van representatieve delen van het geresorbeerde oppervlak nemen.
8. Met beeldanalyse software berekent het percentage van het oppervlak geresorbeerd om voor kwantificering van osteoclastische resorptie activiteit.

Resultaten

Het doel van deze methode gemakkelijk isoleren grote aantallen osteoclasten in vitro, typisch in een week. Succesvolle isolatie van grote aantallen osteoclasten werd bevestigd met behulp tartraat-resistent zuur fosfatase kleuring (Figuur 1A). Grote osteoclasten worden gevisualiseerd als grote paarse cellen met meerdere kernen (typisch ≥ 3 kernen). Met dit protocol, is het gebruikelijk om osteoclasten isoleren met maar liefst 30 kernen per osteoclast (Figuur 1B).

Discussie

Een mogelijkheid om eenvoudig te isoleren en te kweken grote aantallen osteoclasten in vitro is verantwoordelijk voor het helpen om het begrip van botbiologie en osteoclasten gemedieerde ziekten vooruit geweest. Het was de identificatie van RANKL die leiden tot deze, wanneer het onlangs geïdentificeerd als de belangrijkste regulator van osteoclastvorming, differentiatie en overleving ^16-18.

Het is onze ervaring dat het in vitro kweken van osteoclasten uit beenmer...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
MEM, geen glutamine, geen fenol rood	Gibco	51200-038
M-CSF, recombinante muis	Gibco	PMC2044
Recombinant Muis TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli geëxprimeerd)	R&D Systems	462-TEC-010
Prostaglandine E2	Sigma-Aldrich
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit	Sigma-Aldrich	387A
Osteoassay botenresorptie platen, 24 wel platen	Corning Life Sciences	3987