Osteoclast Afleiding van Mouse Bone Marrow

Summary

Osteoclasten zijn de voornaamste botresorberende cellen in het lichaam. Het vermogen om osteoclasten te isoleren in grote aantallen heeft tot aanzienlijke vooruitgang in het inzicht van osteoclast biologie. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het isoleren, kweken en kwantificeren van osteoclasten in vitro.

Abstract

Osteoclasten zijn zeer gespecialiseerde cellen die zijn afgeleid van de monocyt / macrofagen van het beenmerg. Hun unieke capaciteit om zowel de organische als anorganische matrices bot resorberen betekent dat zij een belangrijke rol in de regulering skelet remodeling. Samen osteoblasten en osteoclasten zijn verantwoordelijk voor het dynamisch koppelen proces dat zowel botresorptie en botvorming gezamenlijk optreden om het normale skelet in gezondheid en ziekte handhaven omvat.

Als belangrijkste botresorberende cellen in het lichaam, kunnen veranderingen in osteoclastdifferentiatie of functie leiden tot ingrijpende effecten in het lichaam. Ziekten geassocieerd met veranderde functie van osteoclasten kan in ernst variëren van dodelijke neonatale ziekte gevolg van het niet een merg ruimte hematopoiese vormen om vaker waargenomen aandoeningen zoals osteoporose, waarbij overmatige osteoclastische botresorptie predisponeert vorming breken. ent "> Het vermogen om osteoclasten te isoleren in hoge aantallen in vitro is toegestaan ​​aanzienlijke vooruitgang in het inzicht van de botombouw cyclus en is de weg voor de ontdekking van nieuwe therapeutische strategieën die deze ziekten te bestrijden verhard.

Hier beschrijven we een protocol voor het isoleren en kweken osteoclasten uit muizen beenmerg dat grote aantallen osteoclasten oplevert.

Introduction

Botremodellering is dynamisch en het gaat om de koppeling van botvorming met botresorptie ^1. Dit strak gereguleerd proces is verantwoordelijk voor het skelet tijdens normale homeostase, en in reactie op letsel en ziekte.

Osteoclasten zijn uniek, meerkernige cellen die in staat zijn resorbeerbare zowel de organische als anorganische matrices van bot. Osteoclasten zijn afgeleid van de monocyt / macrofagen van het beenmerg ^2-5. Afwijkingen in de functie of vorming van osteoclasten kan resulteren in verschillende klinische aandoeningen, waaronder gemeenschappelijke aandoeningen zoals osteoporose.

Protocol

OPMERKING: ethische verklaring: Al het onderzoek waarbij gewervelde dieren werd uitgevoerd conform de protocollen door de Stanford administratieve Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) goedgekeurd.

1. Voorbereiding

1. Laat 10 ml commercieel verkrijgbaar dichtheidsgradiënt celscheiding media (die polysucrose diatrizoaat en natrium bevat, aangepast aan een dichtheid van 1.077 g / ml) tot KT te komen in een 50 ml conische buis.
2. Bereid stroomcytometrie (FACS) buffer met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en 2% foetaal kalfsserum (FCS). Neem een ​​50 ml aliquot en deze hoeveelheid bij KT gebruik behouden tijdens de dichtheidsgradiënt cel....

Results

Het doel van deze methode gemakkelijk isoleren grote aantallen osteoclasten in vitro, typisch in een week. Succesvolle isolatie van grote aantallen osteoclasten werd bevestigd met behulp tartraat-resistent zuur fosfatase kleuring (Figuur 1A). Grote osteoclasten worden gevisualiseerd als grote paarse cellen met meerdere kernen (typisch ≥ 3 kernen). Met dit protocol, is het gebruikelijk om osteoclasten isoleren met maar liefst 30 kernen per osteoclast (Figuur 1B).

Discussion

Een mogelijkheid om eenvoudig te isoleren en te kweken grote aantallen osteoclasten in vitro is verantwoordelijk voor het helpen om het begrip van botbiologie en osteoclasten gemedieerde ziekten vooruit geweest. Het was de identificatie van RANKL die leiden tot deze, wanneer het onlangs geïdentificeerd als de belangrijkste regulator van osteoclastvorming, differentiatie en overleving ^16-18.

Het is onze ervaring dat het in vitro kweken van osteoclasten uit beenmer.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM, no glutamine, no phenol red	Gibco	51200-038
M-CSF, recombinant mouse	Gibco	PMC2044
Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed)	R&D Systems	462-TEC-010
Prostaglandin E2	Sigma-Aldrich
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit	Sigma-Aldrich	387A
Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates	Corning Life Sciences	3987