Methodenartikel

Verkalking van vasculaire gladde spiercellen en Imaging van Aorta verkalking en Ontsteking

20K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54017

⸱

31 mei 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anesthesia Center for Critical Care Research of the Department of Anesthesia, Critical Care, and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Cardiovascular Research Center and Cardiology Division of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 3Cardiovascular Division, Brigham and Women's Hospital, 4Harvard Medical School, 5Department of Anesthesiology, Uniklinik RWTH Aachen, RWTH Aachen University, 6Center for Immunology and Inflammatory Diseases and the Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Vasculaire calcificatie is een belangrijke voorspeller van en bijdrager aan hart- en vaatziekten bij mensen. Dit protocol beschrijft methoden voor het induceren van calcificatie van gekweekte primaire vasculaire gladde spiercellen en voor het kwantificeren van calcificatie en macrofagenlast in dierlijke aorta's met behulp van near-infrared fluorescentiebeeldvorming.

Samenvatting

Hart- en vaatziekten zijn de belangrijkste oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in de wereld. Atherosclerotische plaques, bestaande uit lipide-geladen macrofagen en verkalking, ontwikkelen zich in de kransslagaders, aortaklep, aorta en perifere geleider-slagaders en zijn kenmerkend voor hart- en vaatziekten. Bij mensen maakt beeldvorming met behulp van computertomografie de kwantificering van vasculaire verkalking mogelijk; de aanwezigheid van vasculaire verkalking is een sterke voorspeller van toekomstige cardiovasculaire gebeurtenissen. De ontwikkeling van nieuwe therapieën bij hart- en vaatziekten is cruciaal afhankelijk van het verbeteren van ons begrip van de onderliggende moleculaire mechanismen van atherosclerose. Het uitbreiden van onze kennis van atherosclerotische mechanismen is afhankelijk van muis- en cel-gebaseerde modellen. Hier wordt een methode beschreven voor het beeldvormen van aorta-verkalking en macrofaag-infiltratie met behulp van twee spectraal verschillende nabij-infrarode fluorescentiebeeldvormingssondes. Nabij-infrarode fluorescentiebeeldvorming maakt de ex vivo kwantificering van verkalking en macrofaag-accumulatie in de gehele aorta mogelijk en kan worden gebruikt om ons begrip van de mechanistische relatie tussen ontsteking en verkalking bij atherosclerose te verbeteren. Daarnaast wordt een methode beschreven voor het isoleren en kweken van vasculaire gladde spiercellen van de aorta van dieren en een protocol voor het induceren van verkalking in gekweekte gladde spiercellen van muizen-aorta's of van menselijke kransslagaders. Deze in vitro methode van modellering van vasculaire verkalking kan worden gebruikt om de signaalroutes te identificeren en te karakteriseren die waarschijnlijk belangrijk zijn voor de ontwikkeling van vaatziekten, in de hoop nieuwe doelen voor therapie te ontdekken.

Inleiding

Hart- en vaatziekten zijn de belangrijkste oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in de wereld, waaronder de Verenigde Staten, waar het goed is voor meer dan 780.000 doden per jaar. 1 Coronaire verkalking en aorta verkalking zijn kenmerken van atherosclerose en dienen als sterke voorspellers van cardiovasculaire gebeurtenissen. 2- 4 Twee belangrijke types van vasculaire calcificatie zijn gemeld bij volwassenen: intima verkalking, geassocieerd met atherosclerose, en mediale (ook bekend als Monckeberg) verkalking, geassocieerd met chronische nierziekte en diabetes 5 intima verkalking optreedt in de setting van lipide-accumulatie en macrofagen. infiltratie in de vaatwand. 5,6 mediale wand verkalking optreedt onafhankelijk van intimale verkalking, lokaliseert elastine vezels of gladde spiercellen en is niet geassocieerd met lipide afzetting of macrofaag infiltratie. 5,7,8 Studies over de moleculaire mechanismen vanvasculaire calcificatie hebben vertrouwd op basis van cellen en dierlijke modelsystemen. Knaagdier modellen voor atherocalcific ziekte zijn deficiënte muizen in beide apolipoproteïne E (ApoE) 9,10 of low-density lipoprotein receptor (LDLR) 11 gevoed een vetrijk dieet, terwijl de modellen voor de mediale verkalking onder andere muizen met matrix Gla proteïne (MGP) deficiëntie 12 of ratten die uremie ontwikkelen op bijna totale nefrectomie (de 5 / 6e nefrectomie model) of door blootstelling aan een hoge-adenine dieet. 13

Hier wordt het model van mediale vasculaire calcificatie geassocieerd met MGP deficiëntie gericht op. MGP is een extracellulair eiwit dat aderverkalking remt. 12 Mutaties in het MGP gen geïdentificeerd in Keutel syndroom, een zeldzame menselijke ziekte gekenmerkt door diffuse kraakbeen verkalking naast brachytelephalangy, gehoorverlies, en perifere pulmonale stenose. 14-18 Hoewel niet vaak waargenomen, 19concentrische verkalking van meerdere slagaders is beschreven in Keutel syndroom. 20 Common polymorfismen in de humane MGP-gen worden geassocieerd met een verhoogd risico op coronaire calcificaties, 21-23 terwijl hogere niveaus van circulerende uncarboxylated, biologisch inactief MGP cardiovasculaire mortaliteit voorspellen. 24 In tegenstelling tot mensen met Keutel syndroom, MGP-deficiënte muizen ontwikkelen ernstige vasculaire fenotype bestonden uit spontane wijdverbreide aderverkalking vanaf twee weken oud en sterven 6-8 weken na de geboorte door aortaruptuur. 12

Unlike ApoE - / - en LDLR - / - muizen gevoed een vetrijk dieet, dat intimale vasculaire calcificatie met geassocieerde macrofaag geïnduceerde inflammatie ontwikkelen, MGP - / -. Muizen ontwikkelen mediale vasculaire calcificatie in afwezigheid van macrofaag infiltratie 11,25 Hoewel deze bevindingen suggereren verschillende onderliggende stimuli voor intimal en mediale verkalking, er overlap in de signalering mechanismen die beide vormen van calcificatie. 26 meerdere signaleringsroutes geïdentificeerd die bijdragen tot vasculaire calcificatie inclusief inflammatoire mediatoren zoals tumor necrosis factor-α en IL-1 en pro-osteogene factoren bemiddelen zoals Notch, Wnt, en bot morfogenetisch eiwit (BMP) signalering. 27,28 Deze signaalroutes verhogen expressie van de transcriptiefactoren runt-gerelateerde transcriptiefactor 2 (Runx2) en osterix, die op hun beurt expressie van bot-gerelateerde eiwitten verhogen ( bijv., osteocalcine, sclerostine en alkalische fosfatase) in de vasculatuur die calcificatie bemiddelen 28-30 Wij en anderen hebben aangetoond dat de vasculaire calcificatie waargenomen in ApoE - / - en LDLR - / - muizen gevoed een vetrijk dieet en de spontane vasculaire calcificatie waargenomen in MGP - / - muizen zijn allemaal afhankelijk van het bot morfogenetische proteïne (BMP) signaling, en het is deze route die gericht hier. 11,25,31 BMPs potente osteogene factoren die nodig zijn voor botvorming en is bekend dat verhoogde expressie vertonen in menselijke atherosclerose. 32-34 In vitro studies hebben BMP signaaltransductie betrokken bij het ​​reguleren de expressie van osteogene factoren zoals Runx2. 35-37 Overexpressie van het ligand BMP, BMP-2, versnelt de ontwikkeling van vasculaire calcificatie in ApoE-deficiënte muizen die een vetrijke dieet. 38 Bovendien is het gebruik van specifieke remmers zoals BMP signalering als LDN-193189 (LDN) 39,40 en / of ALK3-Fc voorkomt de ontwikkeling van vasculaire calcificatie bij beide LDLR - / - muizen gevoed een vetrijk dieet en MGP-deficiënte muizen 11,25.

Vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) spelen een cruciale rol in de ontwikkeling van vasculaire calcificatie. 30,41,42 De mediale vasculaire calcificatie die ontstaat in MGP-deficiënte muizen karakmerkt door een transdifferentiatie van VSMC een osteogene fenotype. Verlies van MGP resulteert in verminderde expressie van VSMC markers waaronder myocardin en alfa gladde spieren actine, met een daarmee gepaard gaande stijging van de osteogene merkers zoals Runx2 en osteopontine. Deze veranderingen samen met de ontwikkeling van vasculaire calcificatie. 25,43,44

Aorta calcificatie en ontsteking bij muizen worden kenmerkend bepaald met gebruikmaking histochemische technieken zoals alkalische fosfatase activiteit vroege calcificatie en osteogene activiteit, von Kossa en alizarine rood kleuring voor late calcificatie en immunohistochemische protocollen die macrofaag eiwit markers (bijv. Targeten, CD68, F4 / 80, Mac-1, MAC-2, MAC-3). 9,45 echter deze standaard beeldvormende technieken vereisen verwerking van de aorta weefsel in doorsneden, die tijdrovend en onvolmaakte door steekproefvertekening en zijn beperkt in hun vermogen om ontsteking en calcificat kwantificerenion in de gehele aorta. Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het visualiseren en kwantificeren gehele aorta en middelgrote aderverkalking en macrofaag accumulatie gebruikmaking nabij infrarood fluorescentie (NIR) moleculaire beeldvorming ex vivo. Ook wordt een werkwijze voor het oogsten en het kweken van primaire aorta VSMC's van muizen en induceren van de verkalking van murine en menselijke VSMC's in vitro om de moleculaire mechanismen van vasculaire calcificatie bepalen. Deze technieken de onderzoeker zowel in vivo en in vitro methoden voor het bestuderen atherocalcific ziekte.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle studies met muizen werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health. Huisvesting en alle procedures waarin muizen in deze studie beschreven, werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Commissies van Massachusetts General Hospital (Subcommissie onderzoek Animal Care). Alle procedures werden uitgevoerd met zorg om het lijden te minimaliseren.

1. Bereiding van reagentia

  1. Near-Infrared Fluorescentie beeldvorming van Whole aorta
    Opmerking:. A-bisfosfonaat verkregen, nabij-infrarood fluorescente imaging probe kan worden gebruikt om osteogene activiteit in de vasculatuur markeren door te binden aan hydroxyapatiet 46,47 A-cathepsine geactiveerde fluorescente beeldvorming probe kan als een marker voor macrofaag proteolytische activiteit en elastolytische dienen de vasculatuur. 9 Om de gelijktijdige overdracht van zowel fluorescerende probes mogelijk, is het belangrijksondes die spectraal verschillend zijn gebruikt. De notatie calcium NIR wordt gebruikt om de verkalking specifieke nabij-infrarood fluorescente imaging probe en cathepsine NIR de cathepsine activiteit specifieke nabij infrarood fluorescerende afbeeldingssonde geven geven.
    1. Bereid de oplossingen van calcium NIR en cathepsine NIR. Volgens protocollen van de fabrikant, voeg 1,2 ml van 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aan de injectieflacon met 24 nmol calcium NIR of cathepsine NIR en schud voorzichtig.
      Opmerking: Volgens de fabrikant, eenmaal opgelost in PBS, calcium NIR en cathepsine NIR oplossingen stabiel gedurende 14 dagen bij bewaring in het donker bij 2-8 ° C.
  2. Isolatie en verkalking van Muizen Aorta VSMCs
    1. Aorta Spijsvertering Oplossing:
      1. Bereid een verse oplossing (~ 3-5 ml per aorta geoogst) met Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) met 175 U / ml type 2 collagenase en 1,25 U / ml elastase. Steriliseer de oplossing wet een 0,22 urn vacuüm aangedreven filtersysteem en houden van de oplossing op ijs tot gebruik.
    2. Cell Media:
      1. Supplement 500 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum, 100 eenheden / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine. Verwarm de media tot 37 ° C vóór gebruik.
    3. Verkalking Media:
      1. Verkalking Media A (NaPhos; gebruikt in muizen cellijnen):
        1. Supplement 100-500 ml DMEM (volume indien nodig) met 10% foetaal runderserum, 2 mM natriumfosfaat, 100 eenheden / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine. Verwarm de media tot 37 ° C vóór gebruik.

          OF
      2. Verkalking Media B (βGP / Asc / DEX; gebruikt in zowel de muis of menselijke cellijnen):
        1. Supplement 100-500 ml DMEM (volume indien nodig) met 10% foetaal runderserum, 10 mM β-glycerofosfaat dinatrium, 50 ug / ml L-ascorbinezuur, 10nM dexamethason, 100 eenheden / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine. Verwarm de media tot 37 ° C vóór gebruik.

2. Staart Vein Injection

  1. Vóór injectie in de staartader, verwarm de muizen onder een milde warmtelamp gedurende 5 min.
  2. Restrain de muis in een buis knaagdier houder. Ontsmet de staart met een alcoholdoekje.
  3. Maken gebruik van een 30 G naald voor injectie in de staartader. Staartaders zijdelings gelegen.
    1. Breng een zachte hoeveelheid voorwaartse druk op de spuit als de naald wordt voortbewogen in de staart. De ader wordt geopend zodra de weerstand tegen injectie niet meer aanwezig.
    2. Injecteer een volume van 100 pi calcium NIR en / of 100 pl cathepsine NIR constante hoeveelheid. Aan het einde van de injectie, na een 5 seconden pauze, trekken de naald.
  4. Oogst de aorta (zie paragraaf 3) 3-24 uur na de injectie.

3. Mouse Dissection

  1. Euthanaseren muis met 200 mg / kg intraperitoneaal pentobarbital injectie.
  2. Leg het dier in rugligging op de dissectie board en te stabiliseren door taping elke poot aan de raad. Met behulp van een dissectiemicroscoop en kleine scharen, maak een middellijn incisie uitstrekt vanaf de onderbuik naar de bovenste thorax.
  3. Trek de huid met een tang en verwijder het buikvlies, het openbaren van de buikorganen. Verwijder de gastro-intestinale organen, het verzorgen van de aorta niet te doorsnijden.
  4. Voeg een laterale incisie in de voorste diafragma en blijven de incisie in de buik. Gebruik dissectie scharen, laat de ribbenkast door snijden door de zijkanten van de ribben en het verwijderen van het zachte weefsel hechtende de superieure deel van het borstbeen. Verwijder de ribbenkast, het openbaren van de longen.
  5. Laat het hart op zijn plaats in eerste instantie (om hulp bij het identificeren en het ontleden van de proximale aorta) en verwijder voorzichtig de longen. Verwijder de thymus, luchtpijp en slokdarm met zorg, ensuring dat de aorta intact blijft.
  6. Het gebruik van rechte fijne tang en micro-ontleden schaar, verwijder het zachte weefsel rondom de aorta van de darmbeenvertakking aan de aortaboog, het betalen van zorgvuldige aandacht bij het ​​verwijderen van de peri-aorta vet (figuur 1A). Verwijder het achtergebleven vet en weke delen rondom de grote takken van de aortaboog (dwz brachiocephalicus, halsslagader en subclavian slagaders, figuur 1B).
    Opmerking: Het is belangrijk om het vet uit de aorta verwijderen omdat vet het achtergrondsignaal kan verhogen bij het uitvoeren fluorescentiebeeldvorming.
  7. Verwijder het hart uit de borstholte, voorzichtig los te maken van de proximale aorta, en gooi. Doorsnijden de distale aorta naar de iliacale bifurcatie. Met behulp van een insuline naald injecteren normale fysiologische zoutoplossing in de aorta van de aortaboog te wassen resterende bloedcellen. Maak de aorta, samen met de aortaboog schepen, volledig te verwijderenuit het lichaam.
  8. Plaats de aorta in fysiologische zoutoplossing op ijs tot klaar voor beeldvorming.

4. Aorta Imaging

  1. Afbeelding aorta ex vivo direct na de oogst van nabij-infrarood fluorescentie reflectie beeldvorming. 25
    1. Stel de fluorescentie imager op het juiste multichannel golflengten fluorescentiesignaal intensiteiten kwantificeren van de aorta's van calcium NIR en cathepsine NIR-geïnjecteerde muizen zoals eerder beschreven. 25 Volgens de fabrikant, kan calcium NIR worden opgewekt door ~ 650-678 nm licht met een maximale emissie in de ~ 680-700 nm bereik. Cathepsine NIR kan worden opgewekt door ~ 745-750 nm licht met een maximale emissie bij ~ 770 nm.

5. Isolatie van primaire muizen Aorta vasculaire gladde spiercellen

  1. De stappen 3,1-3,7 zoals hierboven beschreven.
  2. Plaats aorta in koude HBSS tot dissecties voltooid. snijd zorgvuldig weg elke remaining periaortic vet en zacht weefsel, waardoor alleen de aorta.
  3. Onder een steriele weefselkweek kap, overdracht van de aorta naar de aorta Digestion Solution in 35 mm x 10 mm weefselkweek gerechten. Plaats in een incubator bij 37 ° C gedurende 30 minuten onder zacht intermitterende schommelen. Na de vertering, de aorta vertonen een uitgerekt of gerafeld uiterlijk.
  4. Met de dissectie microscoop en een steriel pincet, verwijder de buitenste adventitia laag van de aorta terwijl de mediale laag intact. Een techniek voor het verwijderen van de adventitia om afpellen van de buitenste laag van de aorta aan één einde en verwijderen uit de onderliggende mediale laag als een sok opnieuw kan worden gepeld en verwijderd.
  5. Zodra de adventitia laag is verwijderd, plaats de resterende aorta in een nieuwe weefselkweekplaat met celkweekmedia en bewaar bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 2-4 uur.
  6. Onder een steriele motorkap en met steriele 3 mm micro-dissectie schaar, knip de aorta in 1-2 mm breedringen.
  7. Plaats deze ringen in een nieuwe weefselkweekplaat met aorta verteringsoplossing en incubeer bij 37 ° C onder zacht intermitterende schommelen van 120 min. Pipetteer de oplossing op en neer meerdere keren tijdens de incubatie van cellen te resuspenderen.
  8. Voeg 5 ml warm celkweek media om de vertering oplossing en transfer naar een 15 ml conische buis.
  9. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 200 x g.
  10. Zuig het medium en resuspendeer cellen in het gewenste volume celkweekmedia (bijvoorbeeld 5 ml).
  11. Plaat de totale hoeveelheid geïsoleerde cellen uit elke aorta in een 25 cm 2 celkweek kolf en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2. Propageren cellen onder toepassing van standaardtechnieken, zoals eerder beschreven. 25,48 Tijdens de eerste 7-10 dagen incuberen de opslaglocatie 72-96 uur. Als de cellen te benaderen samenvloeiing, aanvullen media vaker (elke 48 uur).
    Opmerking: Het kan vele weken duren om een ​​voldoende qua groeienntity cellen.
  12. Eenmaal confluent passage cellen met trypsine dat wordt verwarmd tot 37 ° C.
    1. Voeg 0,5-1,0 ml trypsine aan elke cultuur kolf en incubeer gedurende 3-5 min; Tik zachtjes tegen de kolf elke 30-60 sec behoefte om cellen los van het oppervlak.
    2. Zodra de cellen los van de bodem van de kolf, voeg 10 ml celmedium de cellen in trypsine. Centrifugeer de cellen bij 200 g gedurende 5 min. Zuig het medium en trypsine uit de cel pellet. Resuspendeer de cellen in de gewenste hoeveelheid verse celmedium (bijvoorbeeld 5-10 ml) en naar een nieuwe kolf (enkele cellen overgebracht naar een kamer dia).
  13. Bij de eerste passage van cellen, bevestigt de gladde spier cellijn met standaard technieken immunocytochemie, zoals eerder beschreven 49 onder gebruikmaking van een antilichaam gericht tegen α-gladde spier actine.

6. inducerende verkalking van Gekweekte gladde spierenCellen

  1. Plaat cellen verkregen van 5.12 in een 6-wells formaat. Opmerking: Beginnend met 1 x 10 5 cellen / putje in een totaal volume van 2,0 ml celmedium per well aanbevolen.
  2. Sta cellen groeien in calcificatie Media A of B ten minste 7 dagen in een 6-well plaat formaat. Incubeer cellen bij 37 ° C met 5% CO2.
  3. Verander cel media om de 48 uur.

7. Het beoordelen van VSMC calcificatie Met behulp van de von Kossa Staining Method

Opmerking:. De von Kossa werkwijze voor het meten extracellulaire matrix verkalking van weefsels of gekweekte cellen is gebaseerd op de vervanging van fosfaat gebonden calciumionen zilverionen 50 In aanwezigheid van licht en organische verbindingen, worden de zilverionen gereduceerd en gevisualiseerd als metallisch zilver. Eventueel niet-omgezet zilver wordt verwijderd door behandeling met natriumthiosulfaat 50 Het protocol voor von Kossa kleuring is als volgt.:

  1. Aspireren media van cel culture platen.
  2. Fix cellen door ze in 1 ml 10% formaline bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
  3. Verwijder de formaline en was de gefixeerde cellen met gedestilleerd water gedurende 5 minuten.
  4. Incubeer cellen in 1 ml van 5% zilvernitraatoplossing onder 60-100 W lamp voor 1-2 uur.
  5. Zuig het zilvernitraatoplossing en was met gedestilleerd water gedurende 5 minuten.
  6. Verwijderen gereageerde zilver door het plaatsen van de cellen in 1 ml van 5% natriumthiosulfaat (w / v) oplossing in gedestilleerd water gedurende 5 minuten.
  7. Spoel de cellen met gedestilleerd water gedurende 5 minuten. Herhaal wast 3x. De von Kossa vlek is klaar voor de beeldvorming met standaard omgekeerde lichtmicroscoop.
  8. Optionele stap: tegenkleuring met 1 ml kernechtrood gedurende 5 min. Hierna gebruikt driemaal wassen met gedestilleerd water (5 min elk).

OF

8. Het beoordelen van VSMC verkalking met nabij-infrarood Fluorescent Imaging

Noot: Net als het vermogenom verkalking te identificeren binnen muis aorta, calcium NIR gemakkelijk bindt calcific minerale afgezet door gekweekte cellen. Met behulp van deze techniek, fluorescentie microscopie en plaat lezers met een lange golflengte filters kunt beeld- en kwantificeren in vitro verkalking, respectievelijk. De lange emissiegolflengte van de calcium NIR voorziet in de gelijktijdige gebruik van lagere golflengte emitterende fluoroforen aan andere functies detecteren. Het protocol voor calcium NIR kleuring is als volgt:

  1. Zoals beschreven in paragraaf 1.1.1, voeg 1,2 ml 1x PBS om de flacon met 24 nmol van calcium NIR.
  2. Verdun de calcium NIR voorraad 1: 100 in de juiste verkalking of de controle media.
  3. Zuig cel media uit kweekplaten en te vervangen door de calcium NIR-bevattende kweekmedium.
  4. Incubeer de kweekplaten met calcium NIR media overnacht bij 37 ° C.
  5. Zuig de media uit de putjes en spoel de putten eenmaal met PBS.
    Opmerking: Op dit punt,de oorspronkelijke kweekmedium kan worden toegevoegd aan de putjes en de cellen kunnen rechtstreeks worden afgebeeld. Anders gaat u naar de onderstaande stappen.
  6. Fix cellen door ze in 1 ml 10% formaline bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
  7. Verwijder de formaline en was de gefixeerde cellen met gedestilleerd water gedurende 5 minuten. Herhaal wast 3x.
  8. Optionele stap:. Voer immunofluorescentiekleuring of andere counterstains voor eiwitten van belang 8,9
  9. Afbeelding of op te sporen calcium NIR vlek met behulp van passende fluorescentie golflengten (bijvoorbeeld, kan calcium NIR worden opgewekt door 650-678 nm licht) en emissie filters (~ 680-700 nm).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Aorta verkalking in MGP - / - en wild-type muizen werd gemeten met behulp van beeldvorming van calcium NIR fluorescentie. Geen calcium NIR signaal werd gedetecteerd in de aorta's van wild-type muizen, waaruit blijkt dat zij calcificatie (figuur 2). Een sterk calcium NIR signaal werd gedetecteerd in de aorta van MGP-deficiënte muizen, wat overeenkomt met geavanceerde vasculaire calcificatie. Weefselcoupes van aorta's van wild-type en MGP - / -

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Aderverkalking is een belangrijke risicofactor voor hart- en vaatziekten bij mensen en kunnen direct bijdragen aan de pathogenese van cardiovasculaire gebeurtenissen. 1,5,52 intima calciumafzetting in de dunne vezelige doppen van atherosclerose is voorgesteld om lokale biomechanische belasting bevorderen en zorgen plaquebreuk. 53,54 Mediale calcificatie effecten klinische resultaten door het verhogen van arteriële stijfheid, die cardiale hypertrofie kunnen veroorzaken en beïnvloeden de hartfunctie....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Massachusetts General Hospital heeft octrooien aangevraagd met betrekking tot kleine molecuulremmers van BMP type I receptoren en de toepassing van ALK3-Fc voor de behandeling van atherosclerose en vasculaire calcificatie, en MD, PBY, KDB en RM kunnen recht hebben op royalty's.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Sarnoff Cardiovascular Research Foundation (MFB en TET), het Howard Hughes Medical Institute (TM), de Ladue Memorial Fellowship Award van Harvard Medical School (DKR), het START-Programma van de Faculteit Geneeskunde aan de RWTH Aachen (MD), de German Research Foundation (DE 1685/1-1, MD), het National Eye Institute (R01EY022746, ESB), de Leducq Foundation (Multidisciplinary Program to Elucidate the Role of Bone Morphogenetic Protein Signaling in the Pathogenesis of Pulmonary and Systemic Vascular Diseases, PBY, KDB en DBB), het National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (R01AR057374, PBY), het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK082971, KDB en DBB), de American Heart Association Fellow-to-Faculty Award #11FTF7290032 (RM), en het National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL114805 en R01HL109506, EA; K08HL111210, RM).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 ml conische buisFalcon352096
30 G naaldBD305106
Alpha gladde spieractine antilichaamSigmaSAB2500963
KamerschuifblokNunc Lab-Tek154461
Collageenase, Type 2 WorthingtonLS004176
DexamethasonSigmaD4902
Dulbecco's Gemodificeerd ArendsduinmediumLife Technologies11965-084
Dulbecco's Fosfaatgebufferde Saline, zonder calciumGibco14190-144
ElastaseSigmaE1250
Foetaal bovien serumGibco16000-044
Fulgenstang, fijn puntRobozRS-4972
Fulgenstang, volledige curve gekarteldRobozRS-5138
Formaline (10%)Electron Microscopy Sciences15740
Hank's Evenwichtige Zout OplossingGibco14025-092
Menselijke coronaire slagader gladde spiercellenPromoCellC-12511
Insulinespuit met naaldTerumoSS30M2913
L-ascorbinezuurSigmaA-7506
Micro-dissectieveertang (13 mm)RobozRS-5676
Micro-dissectieveertang (3 mm)RobozRS-5610
NIR, cathepsine (ProSense-750EX)Perkin ElmerNEV10001EX
NIR, osteogeen (OsteoSense-680EX)Perkin ElmerNEV10020EX
Normale zoutoplossingHospira0409-4888-10
Nucleair fast roodSigma-AldrichN3020
Odyssey Imaging SystemLi-CorOdyssey 3.0
Penicilline/StreptomycineCorning30-001-CI
Zilvernitraat (5%)Ricca Chemical Company6828-16
Natriumfosfaat dibasisch heptahydraatSigma-AldrichS-9390
NatriumthiosulfaatSigmaS-1648
ß-glycerofosfaat dinatriumzout hydraatSigmaG9422
Weefselkweekfles, 25 cm2Falcon353108
Weefselkweekplaat (35 mm x 10 mm)Falcon353001
Weefselkweekplaat, zes-welFalcon353046
TrypsineCorning25-053-CI
Buis voor knaagdierenKent ScientificRSTR551
Vacuumgedreven filtratiesysteemMilliporeSCGP00525

Referenties

  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
  2. Wilson, P. W., et al. Abdominal aortic calcific deposits are an important predictor of vascular morbidity and mortality. Circulation. 103 (11), 1529-1534 (2001).
  3. Budoff, M. J., et al. Assessment of coronary artery disease by cardiac computed tomography: a scientific statement from the American Heart Association on Committee on Cardiovascular Imaging and Intervention, Council on Cardiovascular Radiology and Intervention, and Committee on Cardiac Imaging, Council on Clinical Cardiology. Circulation. 114 (16), 1761-1791 (2006).
  4. Greenland, P., LaBree, L., Azen, S. P., Doherty, T. M., Detrano, R. C. Coronary artery calcium score combined with Framingham score for risk prediction in asymptomatic individuals. Jama. 291 (2), 210-215 (2004).
  5. Otsuka, F., Sakakura, K., Yahagi, K., Joner, M., Virmani, R. Has our understanding of calcification in human coronary atherosclerosis progressed? Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 724-736 (2014).
  6. Virmani, R., Burke, A. P., Farb, A., Kolodgie, F. D. Pathology of the vulnerable plaque. J Am Coll Cardiol. 47 (8 Suppl), C13-C18 (2006).
  7. Amann, K. Media calcification and intima calcification are distinct entities in chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (6), 1599-1605 (2008).
  8. Aikawa, E., et al. Arterial and aortic valve calcification abolished by elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation. 119 (13), 1785-1794 (2009).
  9. Aikawa, E., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116 (24), 2841-2850 (2007).
  10. Qiao, J. H., et al. Pathology of atheromatous lesions in inbred and genetically engineered mice. Genetic determination of arterial calcification. Arterioscler Thromb. 14 (9), 1480-1497 (1994).
  11. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 613-622 (2012).
  12. Luo, G., et al. Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein. Nature. 386 (6620), 78-81 (1997).
  13. Shobeiri, N., Adams, M. A., Holden, R. M. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. Am J Nephrol. 31 (6), 471-481 (2010).
  14. Keutel, J., Jorgensen, G., Gabriel, P. [A new autosomal-recessive hereditary syndrome. Multiple peripheral pulmonary stenosis, brachytelephalangia, inner-ear deafness, ossification or calcification of cartilages]. Dtsch Med Wochenschr. 96 (43), 1676-1681 (1971).
  15. Munroe, P. B., et al. Mutations in the gene encoding the human matrix Gla protein cause Keutel syndrome. Nat Genet. 21 (1), 142-144 (1999).
  16. Cormode, E. J., Dawson, M., Lowry, R. B. Keutel syndrome: clinical report and literature review. Am J Med Genet. 24 (2), 289-294 (1986).
  17. Fryns, J. P., van Fleteren, A., Mattelaer, P., van den Berghe, H. Calcification of cartilages, brachytelephalangy and peripheral pulmonary stenosis. Confirmation of the Keutel syndrome. Eur J Pediatr. 142 (3), 201-203 (1984).
  18. Ozdemir, N., et al. Tracheobronchial calcification associated with Keutel syndrome. Turk J Pediatr. 48 (4), 357-361 (2006).
  19. Cranenburg, E. C., et al. Circulating matrix gamma-carboxyglutamate protein (MGP) species are refractory to vitamin K treatment in a new case of Keutel syndrome. J Thromb Haemost. 9 (6), 1225-1235 (2011).
  20. Meier, M., Weng, L. P., Alexandrakis, E., Ruschoff, J., Goeckenjan, G. Tracheobronchial stenosis in Keutel syndrome. Eur Respir J. 17 (3), 566-569 (2001).
  21. Wang, Y., et al. Common genetic variants of MGP are associated with calcification on the arterial wall but not with calcification present in the atherosclerotic plaques. Circ Cardiovasc Genet. 6 (3), 271-278 (2013).
  22. Cassidy-Bushrow, A. E., et al. Matrix gla protein gene polymorphism is associated with increased coronary artery calcification progression. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (3), 645-651 (2013).
  23. Crosier, M. D., et al. Matrix Gla protein polymorphisms are associated with coronary artery calcification in men. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 55 (1), 59-65 (2009).
  24. Liu, Y. P., et al. Inactive matrix Gla protein is causally related to adverse health outcomes: a Mendelian randomization study in a Flemish population. Hypertension. 65 (2), 463-470 (2015).
  25. Malhotra, R., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signal transduction prevents the medial vascular calcification associated with matrix Gla protein deficiency. PLoS One. 10 (1), e0117098(2015).
  26. Demer, L. L., Tintut, Y. Inflammatory, metabolic, and genetic mechanisms of vascular calcification. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 715-723 (2014).
  27. Rusanescu, G., Weissleder, R., Aikawa, E. Notch signaling in cardiovascular disease and calcification. Curr Cardiol Rev. 4 (3), 148-156 (2008).
  28. Leopold, J. A. Vascular calcification: Mechanisms of vascular smooth muscle cell calcification. Trends Cardiovasc Med. 25 (4), 267-274 (2015).
  29. Bostrom, K. I., Rajamannan, N. M., Towler, D. A. The regulation of valvular and vascular sclerosis by osteogenic morphogens. Circ Res. 109 (5), 564-577 (2011).
  30. Hruska, K. A., Mathew, S., Saab, G. Bone morphogenetic proteins in vascular calcification. Circ Res. 97 (2), 105-114 (2005).
  31. Yao, Y., et al. Inhibition of bone morphogenetic proteins protects against atherosclerosis and vascular calcification. Circ Res. 107 (4), 485-494 (2010).
  32. Bostrom, K., et al. Bone morphogenetic protein expression in human atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 91 (4), 1800-1809 (1993).
  33. Bragdon, B., et al. Bone morphogenetic proteins: a critical review. Cell Signal. 23 (4), 609-620 (2011).
  34. Cai, J., Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Lett. 586 (14), 1993-2002 (2012).
  35. Lee, K. S., et al. Runx2 is a common target of transforming growth factor beta1 and bone morphogenetic protein 2, and cooperation between Runx2 and Smad5 induces osteoblast-specific gene expression in the pluripotent mesenchymal precursor cell line C2C12. Mol Cell Biol. 20 (23), 8783-8792 (2000).
  36. Matsubara, T., et al. BMP2 regulates Osterix through Msx2 and Runx2 during osteoblast differentiation. J Biol Chem. 283 (43), 29119-29125 (2008).
  37. Li, X., Yang, H. Y., Giachelli, C. M. BMP-2 promotes phosphate uptake, phenotypic modulation, and calcification of human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 199 (2), 271-277 (2008).
  38. Nakagawa, Y., et al. Paracrine osteogenic signals via bone morphogenetic protein-2 accelerate the atherosclerotic intimal calcification in vivo. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30 (10), 1908-1915 (2010).
  39. Cuny, G. D., et al. Structure-activity relationship study of bone morphogenetic protein (BMP) signaling inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 18 (15), 4388-4392 (2008).
  40. Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic ossification. Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).
  41. Schurgers, L. J., Uitto, J., Reutelingsperger, C. P. Vitamin K-dependent carboxylation of matrix Gla-protein: a crucial switch to control ectopic mineralization. Trends Mol Med. 19 (4), 217-226 (2013).
  42. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circ Res. 104 (6), 733-741 (2009).
  43. Speer, M. Y., Li, X., Hiremath, P. G., Giachelli, C. M. Runx2/Cbfa1 but not loss of myocardin, is required for smooth muscle cell lineage reprogramming toward osteochondrogenesis. J Cell Biochem. 110 (4), 935-947 (2010).
  44. Steitz, S. A., et al. Smooth muscle cell phenotypic transition associated with calcification: upregulation of Cbfa1 and downregulation of smooth muscle lineage markers. Circ Res. 89 (12), 1147-1154 (2001).
  45. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney Int. 67 (6), 2488-2493 (2005).
  46. Zaheer, A., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of osteoblastic activity. Nat Biotechnol. 19 (12), 1148-1154 (2001).
  47. Aikawa, E., et al. Multimodality molecular imaging identifies proteolytic and osteogenic activities in early aortic valve disease. Circulation. 115 (3), 377-386 (2007).
  48. Lee, K. J., Czech, L., Waypa, G. B., Farrow, K. N. Isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice. J Vis Exp. (80), e50889(2013).
  49. Tang, Y., Herr, G., Johnson, W., Resnik, E., Aho, J. Induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition. J Vis Exp. (78), (2013).
  50. Puchtler, H., Meloan, S. N. Demonstration of phosphates in calcium deposits: a modification of von Kossa's reaction. Histochemistry. 56 (3-4), 177-185 (1978).
  51. Krahn, K. N., Bouten, C. V., van Tuijl, S., van Zandvoort, M. A., Merkx, M. Fluorescently labeled collagen binding proteins allow specific visualization of collagen in tissues and live cell culture. Anal Biochem. 350 (2), 177-185 (2006).
  52. Johnson, R. C., Leopold, J. A., Loscalzo, J. Vascular calcification: pathobiological mechanisms and clinical implications. Circ Res. 99 (10), 1044-1059 (2006).
  53. Vengrenyuk, Y., et al. A hypothesis for vulnerable plaque rupture due to stress-induced debonding around cellular microcalcifications in thin fibrous caps. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14678-14683 (2006).
  54. Maldonado, N., et al. A mechanistic analysis of the role of microcalcifications in atherosclerotic plaque stability: potential implications for plaque rupture. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303 (5), H619-H628 (2012).
  55. Toussaint, N. D., Kerr, P. G. Vascular calcification and arterial stiffness in chronic kidney disease: implications and management. Nephrology (Carlton). 12 (5), 500-509 (2007).
  56. Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans. J Nucl Med Technol. 39 (4), 264-270 (2011).
  57. Smith, J. G., et al. Association of low-density lipoprotein cholesterol-related genetic variants with aortic valve calcium and incident aortic stenosis. Jama. 312 (17), 1764-1771 (2014).
  58. Thanassoulis, G., et al. Genetic associations with valvular calcification and aortic stenosis. N Engl J Med. 368 (6), 503-512 (2013).
  59. Otto, C. M., Kuusisto, J., Reichenbach, D. D., Gown, A. M., O'Brien, K. D. Characterization of the early lesion of 'degenerative' valvular aortic stenosis. Histological and immunohistochemical studies. Circulation. 90 (2), 844-853 (1994).
  60. New, S. E., Aikawa, E. Molecular imaging insights into early inflammatory stages of arterial and aortic valve calcification. Circ Res. 108 (11), 1381-1391 (2011).
  61. Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (7), 1017-1024 (2009).
  62. Stern, P. H. Antiresorptive agents and osteoclast apoptosis. J Cell Biochem. 101 (5), 1087-1096 (2007).
  63. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23 (4), 185-188 (2001).
  64. Chamley-Campbell, J., Campbell, G. R., Ross, R. The smooth muscle cell in culture. Physiol Rev. 59 (1), 1-61 (1979).
  65. Trion, A., Schutte-Bart, C., Bax, W. H., Jukema, J. W., van der Laarse, A. Modulation of calcification of vascular smooth muscle cells in culture by calcium antagonists, statins, and their combination. Mol Cell Biochem. 308 (1-2), 25-33 (2008).
  66. Mori, K., Shioi, A., Jono, S., Nishizawa, Y., Morii, H. Dexamethasone enhances In vitro vascular calcification by promoting osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19 (9), 2112-2118 (1999).
  67. Thyberg, J. Differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells in culture. Int Rev Cytol. 169, 183-265 (1996).
  68. Dinardo, C. L., et al. Vascular smooth muscle cells exhibit a progressive loss of rigidity with serial culture passaging. Biorheology. 49 (5-6), 365-373 (2012).
  69. Metz, R. P., Patterson, J. L., Wilson, E. Vascular smooth muscle cells: isolation, culture, and characterization. Methods Mol Biol. 843, 169-176 (2012).
  70. Proudfoot, D., Shanahan, C. Human vascular smooth muscle cell culture. Methods Mol Biol. 806, 251-263 (2012).
  71. Hruska, K. A. Vascular smooth muscle cells in the pathogenesis of vascular calcification. Circ Res. 104 (6), 710-711 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Beeldvorming van aortacalcalcificatienabij infrarood fluorescentiebeeldvorminggladde spiercellen van de muis aortainductie met calcificatiemediumVon Kossa kleuringstaartveneinjectieaorta digestieoplossingbeoordeling van macrofaaginfiltratieImageJ kwantificering

Gerelateerde artikelen