Name: Een Lectin HPLC-methode voor het selectief-geglycosyleerde Peptiden Enrich van complexe biologische monsters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-01T21:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 23 s
Description: Leer een lectine HPLC-methode voor het verrijken van geglycosyleerde peptiden uit menselijk plasma. Deze techniek combineert lectine-affiniteitschromatografie met massaspectrometrie voor biomarkeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Clinical Proteoom Technologies for Cancer initiatief, 5U24CA126477-04.

1) Bereid lectine-geconjugeerd POROS columns <ol><li> Zet een masker tegen de inademing van POROS-AL kralen te beschermen tijdens het stappen 1,1 tot 1,2. Weeg de gewenste hoeveelheid POROS kralen (100 mg beads/300 ul uiteindelijk volume) en overbrengen in een schone eppendorfbuisje. </li><li> Was kralen met toevoeging van 1 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Pellet kralen door centrifugeren in een microcentrifuge op maximale snelheid voor 3 minuten. Verwijder supernatant en herhaal de wassen. </li><li> Weeg de gewenste hoeveelheid van ongeconjugeerde lectine (1 - 4 mg / 200 pi kralen) en over te dragen aan een schoon eppendorfbuisje. Voeg PBS om een ​​5 formulier - 20 mg / ml oplossing. Reserve 25 ul van deze oplossing. </li><li> Breng de resterende lectine oplossing voor de POROS kralen. Voeg natriumcyaanboorhydride tot een uiteindelijke concentratie van 50 mM. Plaats de buis op een rocker en reageren &#39;s nachts bij kamertemperatuur. (Let op:. Natriumcyaanboorhydride is giftig en moet behandeld in een zuurkast worden Besmet afval moet worden afgevoerd.) </li><li> Pellet de POROS parels zoals in stap 1.2. Verwijder supernatant en opslaan als de post-conjugatie oplossing. </li><li> Was kralen met een mL Afschrikken Buffer (1 M Tris-Cl, pH 7,4). Pellet parels zoals in stap 1.2 en veilig te ontdoen van supernatant. </li><li> Blokkeer de resterende reactieve plaatsen op het POROS kralen met 1 mL Afschrikken Buffer. Voeg natriumcyaanboorhydride tot een uiteindelijke concentratie van 50 mM. Plaats de buis op een rocker en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. </li><li> Pellet parels zoals in stap 1.2 en gooi supernatant. </li><li> Was kralen met 1 mL 1 M NaCl. Pellet kralen en gooi supernatant. Herhaal dit vier keer voor een totaal van vijf wasbeurten. De kralen zijn nu klaar om in te pakken. </li><li> Voor het bepalen van de hoeveelheid eiwit dat was geconjugeerd aan de POROS kralen, voert u een eiwitconcentratie test op de pre-en post-geconjugeerde geconjugeerd lectine oplossingen. Het verschil in concentratie is de hoeveelheid eiwit dat was geconjugeerd aan de kralen. De hoeveelheid eiwit geconjugeerde per kraal volume is gelijk aan de concentratie van lectine op de kralen. Target lectine concentraties tussen twee 20 mg / ml. </li></ol> 2) Verpakken van de lectine-geconjugeerde POROS kralen in een kolom PEEK <ol><li> Monteer de verpakking systeem (beschrijving volgt) en de ondersteuning van het op een metalen ring staan. De verpakking bestaat uit, van onder naar boven, druk restrictor, eind kolom koppeling 1, frit, kolom (2 x 50 mm), einde kolom koppeling 2, kolom connector, end kolom koppelstuk 3, kolom (4,5 x 50 mm), end kolom koppeling 4 en eindstuk. De bovenste kolom dient als reservoir voor het verpakkingsmateriaal. </li><li> Resuspendeer de POROS kralen in de gewenste volume van de buffer A (10 mM Tris-buffer, pH 7,4, 150 mM natriumchloride, 10 mM calciumchloride, 10 mM magnesiumchloride). Als verpakking een kolom (~ 200 pi bed volume), opnieuw in suspensie in 400 ul buffer A. </li><li> Overdracht geconjugeerde POROS kralen in de bovenste kolom (reservoir). Voeg Buffer A om het reservoir totdat de buffer bereikt de top van de kolom. Plaats voorzichtig het eindstuk op de bovenkant van de kolom, in een poging om luchtbellen te voorkomen in de kolom. Sluit het eindstuk van de bovenste kolom met de HPLC-systeem. </li><li> Verpak de kolom door stroomt Buffer A tot en met het systeem. Begin met een debiet van 0,5 ml / min. Verhoog het debiet van 0,5 ml / min iedere minuut totdat hetzij 4 ml / min of de maximale druk (3000 psi) is bereikt. Ga verder op de maximaal mogelijke debiet tot ten minste 35 ml buffer A zijn gepasseerd door de kolom. </li><li> Schakel de pompen en laat de druk op de kolom te laten dalen tot &lt;20 psi. </li><li> Voorzichtig, te demonteren de verpakking, te beginnen vanaf de top. Als het einde kolom koppeling 2 wordt bereikt, voorzichtig te verwijderen. Sommige verpakt materiaal moet worden extruderen van de top van de kolom. Met een scheermesje of een soortgelijke scherpe rand, veeg voorzichtig het extruderen kralen, waardoor een kraal oppervlak dat zelfs met de bovenkant van de kolom. Oefen geen druk uit op de kralen terwijl je dit doet. </li><li> Maak de gepakte kolom van de ring staan. Plaats een nieuwe frit in een nieuw einde koppeling en draai de gepakte kolom naar dit verbinden met de frit / einde koppeling op de open (voorheen boven) kolom eindigen. </li><li> Passend etiket van de kolom. Het is nu klaar voor gebruik. Wanneer niet in gebruik is, kan de kolom worden opgeslagen in PBS met 0,02% natriumazide bij 4 ° C gedurende maximaal 6 maanden. </li></ol> 3) Programmeer de HPLC-methode <ol><li> De details van het programmeren van uw HPLC is afhankelijk van de specifieke kenmerken van de software van de fabrikant. We maken gebruik van een Michrom Paradigm MG4 HPLC. Op deze machine, worden methoden gebouwd en geopend onder het &quot;Setup&quot; tab aan de bovenkant van het scherm. Programma de volgende methode: <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Tijd </td><td> Debiet (pl / min) </td><td> % A </td><td> % B </td></tr><tr><td> 00:00 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 09:00 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 09:01 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13:50 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13:51 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 19:50 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> Buffer A: 10 mM Tris-buffer, pH 7,4, 150 mM natriumchloride, 10 mM calciumchloride, 10 mM magnesiumchloride Buffer B: 0,5 M azijnzuur De UV-detector moet worden geprogrammeerd bij 280 nm lezen van 00:00 tot 19:50. De y-as moet worden aangepast aan de lage absorptie niveaus, bijvoorbeeld, 0 te sporen. - 50 AU. </li><li> Als een autosampler beschikbaar is, het programma de volgende schema voor fractie collectie. Anders, verzamel de fracties met de hand, zoals aangegeven bij het uitvoeren van chromatografie. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Fractie </td><td> Vertraging voor collectie van monsterinjectie </td><td> Duur van de collectie (min) </td></tr><tr><td> Flow-through </td><td> 2.8 </td><td> 4.1 </td></tr><tr><td> Gebonden </td><td> 9 </td><td> 2.6 </td></tr></tbody></table></li></ol> 4) Bereid monsters voor HPLC <ol><li> Voorafgaand aan het gebruik in dit protocol, moet het menselijk plasma worden uitgeput van de 14 meest voorkomende eiwitten met behulp van een MARS kolom (Agilent, Santa Clara, CA). Verarmd plasma, humaan lactoferrine en gist invertase dient individueel te worden trypsine-verteerd en ontzout zoals eerder beschreven: 1. </li><li> Ter voorbereiding van de lectine-specifieke lactoferrine standaard, uit te voeren chromatografie op 50 ug trypsine-verteerd lactoferrine op ofwel de AAL of de SNA kolom met behulp van de methode in deel 3. De gebonden fractie bevat lectine-specifieke lactoferrine glycopeptiden. Neutraliseer de monsters zoals in deel 4.4, en ontzouten als in deel 6. Resuspendeer het monster in 1 ml buffer A. De resulterende monster is klaar voor gebruik. </li><li> Drie experimentele repliceert zal worden uitgevoerd. Ter voorbereiding steekproef voor drie duplo, voeg 3 pmol van trypsine-verteerd invertase en 1 ul van lectine-specifieke lactoferrine (hetzij AAL-LAC of SNA-LAC) op 30 ul MARS-leeg is, trypsine-verteerd, plasma-equivalenten (PE). Een PE is gedefinieerd als het volume van de non-processed/intact/original plasma, waaruit een bepaalde hoeveelheid verwerkte plasma (MARS-verarmd en trypsine verteerd) werd afgeleid. Voeg Buffer A om het monster tot een eindvolume van 330 ul te bereiken. </li><li> Voeg neutralisatie buffer (1 M Tris pH 8,0), de sample flesjes die zal verzamelen eluaat. Het aantal en volume van de flacons waarmee u werkt zal afhangen van de beperkingen van uw autosampler. Voor de Paradigm MG4, een flacon verzamelt de doorstroming en twee verzamel het eluaat. Het is ongeveer 1,5 ml Tris-buffer aan 1 ml eluaat te neutraliseren. Target geneutraliseerd pH is 7,0-8,0; test test uiteindelijke pH met een pH-indicator papier. </li></ol> 5) Voer de chromatografie <ol><li> Alle blanco en monster loopt die volgen zal gebruik maken van de methode beschreven in deel 1. De kolom en buffers op kamertemperatuur zijn tijdens het gebruik. Kolommen worden bewaard bij 4 ° C, terwijl de buffers worden bewaard bij kamertemperatuur. </li><li> Bevestig ofwel de AAL of het SNA lectine kolom met de HPLC-systeem en voer twee blanco methodes (het injecteren van alleen Buffer A). Zorg ervoor dat het lectine kolom komt overeen met het lectine-specifieke lactoferrine (deel 2). </li><li> Gaschromatograaf de drie plasma-monsters, het injecteren van een blanco tussen elke geïnjecteerd monster, voor een totaal van 7 HPLC loopt. Fracties van blank loopt niet te worden verzameld. </li></ol> 6) ontzouten ingezamelde fracties Voor elke fractie gebruik maken van een 1 mL Waters Oasis HLB SPE cartridge als volgt: <ol><li> Bevestig het aantal benodigde cartridges voor vacuum spruitstuk. </li><li> Nat elke cartridge met 1 ml 80% ACN in 1% mierezuur (vacuümmeter op manifold moeten lezen 5-20 lnHg). </li><li> Evenwicht cartridges met 1,5 ml 0,1% mierezuur (vacuümmeter op manifold moeten lezen 5-20 lnHg) </li><li> Belasting gehele volume van een monster op een cartridge (Vacuümmeter op spruitstuk moeten lezen 2 -. 2,5 lnHg, en het debiet mag niet meer dan 1 ml / min) </li><li> Was cartridges met 3 x 1 ml 0,1% mierezuur (Vacuümmeter op spruitstuk moeten lezen 5-20 lnHg) </li><li> Elueer peptiden / glycopeptiden in gelabelde Eppendorf buisjes met 1 x 1 ml 80% acetonitril in 0,1% mierenzuur. (Vacuümmeter op spruitstuk moeten lezen 2 tot 2,5 lnHg, en het debiet mag niet meer dan 1 ml / min.) Een enkele collectie buis moet worden gebruikt voor elke cartridge. </li><li> Neutraliseren eluaat door het toevoegen van 60 pi 0,5 M ammoniumbicarbonaat aan elke collectie buis. Target neutralized pH-waarde is, is 7,0-8,0; testen uiteindelijke pH met een pH-indicator papier. </li><li> Concentreer geëlueerd peptiden / glycopeptiden tot ~ 50 uL door ze op een vacuüm centrifuge (bijvoorbeeld een Thermo Savant SpeedVac) voor ~ 2 uur @ 35 ° C. </li></ol> 7) PNGase F-vergisting <ol><li> Monster pH te zijn dat de tussen de 7,0 tot 8,0. Indien nodig, voeg 50 mM ammoniumbicarbonaat om de pH te verhogen. Als eindmonster volume is&gt; 100 pl, speedvac monster zo tussen 50-100 pl. </li><li> Voeg 0,5 pl (250 U) glycerol-vrij PNGase F aan elk monster buisje en incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht. </li></ol> 8) Zip Tip monsters <ol><li> Te beginnen met PNGase F-verteerde monsters, ZipTip ieder als volgt. </li><li> Nat ZipTip met 10 ul 100% acetonitril, gevolgd door 10 pi 80% acetonitril, 0,1% mierenzuur. </li><li> Evenwicht ZipTip met 20 ul 0,1% mierenzuur. </li><li> Laad het monster op de ZipTip door pipetteren op en neer door de ZipTip matrix 10 keer. </li><li> Was de ZipTip door pipetteren 10 pi 0,1% mierenzuur, 5 keer. </li><li> Elueer het monster in een schone eppendorfbuisje met 10 ul 80% acetonitril, 0,1% mierenzuur. </li><li> Herhaal de elutie en voeg de tweede 10 pi in dezelfde buis. </li><li> Speedvac de monsters tot een volume van &lt;2 pi. </li><li> Resuspendeer monsters in 20 ui 0,1% mierenzuur. Monsters zijn nu klaar voor analyse door LC-MS/MS. </li></ol> 9) representatieve resultaten: De POROS vervoeging levert meestal op-kraal lectine concentraties in de range van 2 - 20 mg / ml. Dit is optimaal voor affiniteitschromatografie. Lectine chromatografie van trypsine-verteerd MARS-uitgeput menselijk plasma verrijkt meestal glycopeptiden in de gebonden fractie. Omdat de glycopeptiden zijn PNGase voorafgaand aan de LC-MS/MS F-behandeld, worden ze aangeduid als peptiden met de N-gekoppelde consensus sequentie, NXS / T (waarbij X een residu, maar proline), waarin de asparagine is omgebouwd tot een asparaginezuur door de werking van PNGase F. peptiden met deze kenmerken worden beschouwd deglycosylated peptiden (of &quot;deglycopeptides&quot;). Gemiddeld de doorstroom (FT) fractie van AAL-of SNA chromatografie bevat 2-4% deglycopeptides, terwijl 30-50% van de peptiden teruggevonden in de gebonden fractie zijn deglycopeptides. Typisch, met behulp van een QStar Elite, zal 1000-1300 peptiden worden geïdentificeerd in de FT fractie, en 200-400 peptiden zullen worden geïdentificeerd in de gebonden fractie. Twee of meer afzonderlijke Invertase deglycopeptides moet worden waargenomen in de FT fractie en twee of meer verschillende lactoferrine deglycopeptides in de gebonden fractie (tabel 1). <img src="/files/ftp_upload/1398/1398table.jpg" alt="Tabel 1" /> Tabel 1.

<ol><li>Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((multiplexed+assays+for+low+abundance+proteins+in+plasma+by+targeted+mass+spectrometry+and+stable+isotope+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 2212-2229 (2007).</li>
</ol>

Dit protocol biedt een snelle methode voor het isoleren en het identificeren van glycopeptiden in een glycan-specifieke wijze. Zoals glycosylering varieert uitvoerig binnen een organisme, in het bijzonder tijdens de ontwikkeling en pathogenese, kan deze techniek worden toegepast op een breed scala van vraagstukken aan te pakken. In het bijzonder zijn we met behulp van de methode om selectief te verrijken glycopeptiden die zijn met kanker-geassocieerde epitopen gewijzigd als een eerste stap op weg naar de ontdekking van biomarkers.

<table><tbody><tr><td>Menselijk plasma</td><td></td><td></td><td>Zelf geproduceerd</td></tr><tr><td>Menselijk lactoferrine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0520</td><td>Trypsine-digestie vóór gebruik</td></tr><tr><td>Gist-invertase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0408</td><td>Trypsine-digestie vóór gebruik</td></tr><tr><td>Oass HLB SPE-cartridges</td><td>Waters</td><td>WAT094225</td><td>1 cc volume</td></tr><tr><td>ZipTip-pipetpunten</td><td>Fisher Scientific</td><td>ZTC1 8M0 96</td><td>Millipore, C18 voor 10 ml pipet</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td>99%</td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6141</td><td>99%</td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>96%</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>98%</td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242853</td><td>99.7%</td></tr><tr><td>pH-indicatiepapier</td><td>Fisher Scientific</td><td>M95903</td><td>Bereik 0-14</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998</td><td>99.9%</td></tr><tr><td>Mierenzuur</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>28905</td><td>99%</td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing</td><td>Invitrogen</td><td>14190-136</td><td>Zonder calcium en magnesium</td></tr><tr><td>Natriumazide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71289</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>New England Biolabs</td><td>P0705L</td><td>Glycerinevrij</td></tr><tr><td>Vacuümfilterkolfen</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGVU05RE</td><td>0.2 mm poriën</td></tr><tr><td>POROS-AL beads</td><td>Applied Biosystems</td><td>1-6028-02</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aleuria aurantia&lt;/em&gt; lectine</td><td>Vector Laboratories</td><td>L-1390</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sambucus nigra&lt;/em&gt; agglutinine</td><td>Vector Laboratories</td><td>L-1300</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcyanoborohydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296945</td><td>5.0 M oplossing</td></tr></tbody></table>

een lectin hplc-methode voor het selectief-geglycosyleerde peptiden enrich van complexe biologische monsters

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycanen zijn een belangrijke klasse van post-translationele modificaties. Meestal te vinden op uitgescheiden en extracellulaire moleculen, structuren glycaan het signaal van de interne status van de cel. Glycanen op tumorcellen hebben de neiging om overvloedige siaalzuur en fucose groepen hebben. Wij stellen dat deze kanker-geassocieerde glycan varianten worden benut voor biomarker ontwikkeling gericht op de diagnose van een vroeg stadium van de ziekte. Daarom ontwikkelden we een massaspectrometrie-gebaseerde workflow die affiniteit chromatografie op matrices gevormd uit lectines, eiwitten die specifieke glycaan structuren te binden opgenomen. De lectinen Sambucus nigra (SNA) en Aleuria aurantia (AAL), dat siaalzuur en fucose binden, respectievelijk, werden covalent gekoppeld aan POROS kralen (Applied Biosystems) en verpakt in PEEK kolommen voor hoge druk vloeistofchromatografie (HPLC). In het kort werd plasma uitgeput van de veertien meest voorkomende eiwitten met behulp van een multiple affiniteit verwijdering van het systeem (MARS-14; Agilent). Verarmd plasma werd trypsine-verteerd en gescheiden in doorstroming en gebonden fracties door SNA of AAL HPLC. De fracties werden behandeld met PNGaseF naar N-gekoppelde glycanen te verwijderen, en geanalyseerd door LC-MS/MS op een QStar Elite. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van Mascot software. Het experimentele ontwerp opgenomen positieve controles-gefucosyleerde en sialylated humaan lactoferrine glycopeptiden-en negatieve controles hoog mannose glycopeptiden van Saccharomyces cerevisiae-die werden gebruikt om de specificiteit van lectine vast te leggen te controleren. Belangrijkste kenmerken van deze workflow zijn de reproduceerbaarheid afgeleid van de HPLC-formaat, de positieve identificatie van de gevangen genomen en PNGaseF behandeld glycopeptiden van hun gedeamideerde Asn-Xxx-Ser/Thr motieven, en de kwaliteit beoordelen met behulp van glycoproteïne normen. Protocol optimalisatie ook het bepalen van de juiste verhouding van uitgangsmateriaal tot en met kolom capaciteit, het identificeren van de meest efficiënte afvang en elutiebuffers, en het toezicht op de PNGaseF-behandeling om volledige deglycosylatie te verzekeren. Toekomstige richtingen omvatten het gebruik van deze workflow aan massaspectrometrie-gebaseerde ontdekking van experimenten uit te voeren op plasma van borstkanker patiënten en controle individuen.

Lectine-geconjugeerde POROS kralen werden gebruikt voor HPLC. Glycopeptide normen dienden als positieve en negatieve controles. MARS-14 leeg is, werd trypsine-verteerd menselijk plasma gechromatografeerd en flow-through (FT) en gebonden fracties verzameld voor ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptiden werden verrijkt in de gebonden fractie ten opzichte van FT.

Een Lectin HPLC-methode voor het selectief-geglycosyleerde Peptiden Enrich van complexe biologische monsters

Glycanen vormen een belangrijke klasse van post-translationele modificaties. Glycanstructuren komen doorgaans voor op gesecreteerde en extracellulaire moleculen en signaleren de ...

Deze procedure isoleert specifiek geglycosyleerde glycopeptiden uit menselijk plasma. Plasma wordt verteerd met trypsine om een mengsel van peptiden en glycopeptide-standaarden te verkrijgen. Positieve en negatieve controles voor lectinechromatografie worden aan het plasma toegevoegd.Het monster wordt onderworpen aan lectine-affiniteitschromatografie op basis van hogedrukvloeistofchromatografie. De gebruikte lectines binden respectievelijk fucose en sialinezuur; peptiden en irrelevante glycopeptiden elueren uit de kolom in de flow-through fractie. Azijnzuur wordt gebruikt om de gebonden fractie uit de kolom te elueren.Dit is verrijkt voor specifiek gemodificeerde glycopeptiden. Hallo, ik ben Penny Drake van het laboratorium van Susan Fisher van de afdeling Verloskunde, Gynaecologie en Reproductiewetenschappen en de San Lamore massaspectrometrie-kernfaciliteit aan de University of California San Francisco. En ik ben Eric Johansen, eveneens van de Sandler Moore massaspectrometrie-kernfaciliteit en het Fisher Lab.Vandaag tonen we u een procedure voor het uitvoeren van lectinechromatografie om glycopeptiden uit menselijk plasma en andere complexe mengsels te verrijken. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium als een algemeen instrument met talrijke toepassingen. Zo speelt het een belangrijke rol in onze workflow voor de ontdekking van biomarkers voor borstkanker.Laten we beginnen. Draag bij aanvang van deze procedure een masker om inademing van de kraaltjes te voorkomen. Weeg vervolgens 100 milligram porro-kraaltjes af en breng deze over in een schone eppendorf-buis.Voor het vullen van één kolom zijn ongeveer 300 µL kralen nodig. Weeg daarnaast niet-geconjugeerd lectine af en breng dit over naar een schone eppendorfbuis. De lectines SNA en A A L worden gebruikt.Voeg PBS toe aan het lectine om een oplossing van 5 tot 20 mg/mL te vormen. Reserveer 25 µL van deze vooraf geconjugeerde oplossing. Was vervolgens de porros-beads door 1 mL PBS toe te voegen en deze in een microcentrifuge op maximale snelheid te centrifugeren.Verwijder gedurende drie minuten het supernatant en herhaal de wasstap. Werk nu in de zuurkast en breng de resterende lectine-oplossing over naar de gewassen porro speeds. Voeg vervolgens natriumcyanoborohydride toe tot een eindconcentratie van 50 millimolar.Let op dat natriumboorhydride toxisch is en dat afval op de juiste wijze moet worden afgevoerd. Sluit de buis stevig af met Parafilm en plaats deze op een rocker om gedurende de nacht bij kamertemperatuur te laten reageren. Na de overnachtse binding van de lectine aan de porridge-beads, worden de porridge-beads opnieuw gecentrifugeerd om een pellet te vormen. Verwijder het supernatant en bewaar dit als post-conjugatieloop om de resterende reactieve plaatsen op de beads te blokkeren.Was eerst de kralen door te centrifugeren met één milliliter quenchbuffer, bestaande uit één molar CL bij pH 7.4. Voeg vervolgens één milliliter quenchbuffer en natriumborohydride toe tot een eindconcentratie van 50 millimolar. Plaats de buis op een schudplaat en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur.Het stoppen van de reactie is nu voltooid. Centrifugeer de beads, zoals eerder beschreven.Verwijder het supernatant en was de beads vijf keer met telkens één milliliter één molar natriumchloride, waarbij het supernatant telkens wordt weggegooid. Voer een eiwitconcentratie-assay uit op de lectine-oplossingen vóór en na conjugatie en gebruik het verschil om de hoeveelheid eiwit te bepalen die aan de porridge-beads is geconjugeerd. De doelconcentraties van lectine liggen tussen de 2 en 20 milligram per milliliter, berekend als de hoeveelheid geconjugeerd eiwit per bead-volume.De geconjugeerde porro-kraaltjes zijn nu klaar om in een kolom te worden gepakt. Om de kraaltjes in een kolom te pakken, stelt u het pakkingsysteem samen, dat bestaat uit twee kolommen die worden ondersteund door een metalen ringstatief. De bovenste kolom dient als reservoir voor het pakmateriaal.Het vul- of pakksysteem bestaat van onder naar boven uit een drukbegrenzer, kolomkoppeling één voor de doelkolom, kolomkoppeling twee, kolomconnector, kolomkoppeling drie, de reservoirkolom, kolomkoppeling vier en een eindfitting. Resuspendeer vervolgens de 300 microliters porro speeds in 600.Microliters buffer A Voor het vullen van één kolom worden de beads overgebracht naar het bovenste reservoir van de kolom. Voeg buffer A toe tot het de bovenkant van de kolom bereikt. Plaats voorzichtig de eindbevestiging op de bovenkant van de kolom.Voorkom luchtbellen in de kolom. Verbind de eindfitting van de bovenste kolom met het HPLC-systeem. Pak de kolom door buffer A of PBS door het systeem te laten stromen.Begin met een stroomsnelheid van 0,5 milliliters per minuut. Verhoog de stroomsnelheid elke minuut met 0,5 milliliters per minuut totdat vier milliliters per minuut of de maximale druk is bereikt. Ga door met de maximaal mogelijke stroomsnelheid totdat er ten minste 35 milliliters buffer door de kolom is gestroomd.Schakel na voltooiing de pompen uit en laat de druk op de kolom dalen tot onder de 20 PSI. Nu de kolom is gepakt, kan het pakkingsysteem voorzichtig worden gedemonteerd, beginnend aan de bovenzijde. Verwijder de tweede kolomkoppeling aan het uiteinde zorgvuldig zodra u deze bereikt.Veeg met een scheermesje voorzichtig het opgevulde materiaal weg dat uit de bovenkant van de kolom steekt. Oefen hierbij geen druk uit op de korrels. Neem de gevulde kolom los van de ringstatief.Plaats een nieuwe frit in een nieuwe eindkoppeling en keer de gevulde kolom om om deze te verbinden met de FR plus eindkoppeling aan het open uiteinde van de kolom. De kolom is nu gereed voor de HPLC-run. Wanneer de kolom niet in gebruik is, kan deze tot zes maanden worden bewaard in PBS met 0,5% natriumazide bij vier graden Celsius.De details voor het programmeren van uw HPLC variëren afhankelijk van uw configuratie en de specificaties van de software van de fabrikant. In dit voorbeeld maken we gebruik van een microme paradigm MG four HPLC op dit apparaat. Methoden worden opgesteld en benaderd via het tabblad 'setup' bovenaan het schermprogramma.De getoonde methode wordt ook in detail beschreven in het bijbehorende geschreven protocol. Indien er een programma voor een autosampler wordt gebruikt, dient men eveneens het geschreven protocol te volgen. Gebruik buffer A zoals voorheen en buffer B voor het uitvoeren van de HPLC, en houd zowel de buffers als de kolommen op kamertemperatuur.Programmeer de UV-detector om bij 280 nanometer te meten van 0 tot 19 minuten en 50 seconden. Stel de Y-as zo in dat lage absorptieniveaus in het bereik van 0 tot 50 absorptie-eenheden worden gedetecteerd. Bereid vervolgens de monsters voor.De testmonsters zijn afgeleid van menselijk plasma dat is ontdaan van de 14 meest abundante eiwitten met behulp van een Mars-kolom. De ontdaande plasmamonsters en twee standaarden, menselijk lactoferrine en gist-invertase, worden elk afzonderlijk met trypsine verteerd en ontzout zoals eerder beschreven.Om de monsters te neutraliseren, dient de neutralisatiebuffer klaar te staan in de monsterbuisjes waarin de EIT wordt opgevangen. Voor het paradigma MG four wordt één buisje gebruikt voor de doorstroom en drie buisjes voor het eluaat. Er is ongeveer 1,5 milliliter buffer nodig om één milliliter EIT te neutraliseren. De gewenste geneutraliseerde pH is 7,0 tot 8,0.Controleer de uiteindelijke pH met pH-indicatorpapier. Ontzout de monsters zoals later in dit protocol beschreven. Suspendeer het monster vervolgens opnieuw in één milliliter buffer A voor optimale resultaten.Voer drie experimentele replica's uit zodat gegevens kunnen worden vergeleken en gecombineerd. Om monsters voor drie replica's voor te bereiden, voegt u drie picaMols trypsine-verteerde invertase en één microliter HPLC-gepurificeerde lactoferrine-specifieke lectine toe aan 30 microliters trypsine-gedepleteerd plasmaprop equivalents of pe. Dit komt neer op ongeveer 50 micrograms plasmaproteïne per replica. Voeg buffer A toe aan het monster tot een eindvolume van 330 microliters, oftewel 110 microliters per experimentele replica, gebruikmakend van ofwel de AAL- of de SNA-lectinekolom. Voer eerst twee blanco methoden uit door uitsluitend buffer A te injecteren. Zorg ervoor dat de lectinekolom overeenstemt met de lactoferrine-specifieke lectine die als standaard is gebruikt en eerder is gechromatografeerd.De drie plasmaproeven worden geïnjecteerd met tussen elke injectie een blanco, wat neerkomt op in totaal zeven HPLC-runs. Fracties van de blanco-runs hoeven niet te worden verzameld. Zorg er opnieuw voor dat de monsters worden geneutraliseerd door neutralisatiebuffer toe te voegen aan de monsterbuisjes waarin het eluaat na ontzilting en P-N-G-A-F-digestie wordt opgevangen; de monsters zijn dan gereed voor massaspectrometrische analyse.Gebruik voor elke HPLC-fractie van de lactoferrine-standaard en de experimentele monsters één Waters Oasis HLB SPE-cartridge voor ontzilting. Begin met het bevestigen van het benodigde aantal cartridges aan een vacuümmanifold. Bevochtig elke cartridge met 1 mL 80% acetonitril in 1% mierenzuur.De vacuümmeter op het collectormaneuver moet een waarde tussen 5 en 20 inches Hg aangeven. Equilibreer de cartridges met 1,5 milliliters 0,1% mierenzuur. De vacuümmeter op het collectormaneuver moet opnieuw een waarde tussen 5 en 20 inches Hg aangeven.Laad het volledige volume van één monster op één cartridge. De vacuümmeter op het manifold moet nu een waarde van 2 tot 2,5 inch aangeven. De stroomsnelheid mag één milliliter per minuut niet overschrijden.Was de cartridges drie keer met één milliliter 0,1% mierenzuur, waarbij voor elke cartridge een aparte gelabelde opvangbuis wordt gebruikt. Elueer de glycopeptiden met één milliliter 80% acetonitril in 0,1% mierenzuur en neutraliseer het eluaat door 60 µL 0,5 M ammoniumbicarbonaat aan elke opvangbuis toe te voegen. De beoogde geneutraliseerde pH is 7,0 tot 8,0.Controleer de uiteindelijke pH met pH-indicatiepapier. Concentreer de ge-elueerde peptiden tot ongeveer 50 µL met behulp van een vacuümcentrifuge, zoals een thermo savant speed vac, gedurende ongeveer twee uur bij 35 °C. Controleer na het concentreren opnieuw de pH van het monster om te bevestigen dat deze tussen 7,0 en 8,0 ligt. Voeg indien nodig 50 mM ammoniumbicarbonaat toe om de pH te verhogen.Als het uiteindelijke monstervolume groter is dan 100 µL, concentreer het monster dan via vacuümcentrifugatie tot een volume tussen 50 en 100 µL. Verwijder vervolgens de N-gekoppelde koolhydraten van de peptiden door 250 units glycerolvrij peptide N-glycosidase F of P-N-G-A-F aan elke monsterbuis toe te voegen en incubeer dit gedurende de nacht bij 37 °C. Na de incubatie gedurende de nacht met P-N-G-S-F gebruikt u ZipTip-pipetpuntjes met een reverse phase C18-matrix om de monsters te ontzouten voordat u begint.Maak twee druppels op een stukje parafilm voor het wassen en elueren: één van 0,1% mierenzuur en één van 80% acetonitril plus 0,1% mierenzuur. Druppels worden gebruikt om kruiscontaminatie van peptiden tussen monsters te voorkomen, en voor elk zip tip-monster worden nieuwe druppels klaargemaakt. Begin met het bevochtigen van een zip tip met acetonitril-oplossingen. Equilibreer de zip tip door drie keer 10 µL 0,1% mierenzuur op te zuigen en weer uit te pipetteren.Laad het monster door het 10 keer op en neer te pipetteren. Spoel de tip vervolgens vijf keer met 10 µL 0,1% mierenzuur. Elueer het monster ten slotte twee keer met 80% acetonitril in 1% mierenzuur en verzamel de elueerde peptiden in een eppendorfbuisje.Reduceer het monstervolume tot minder dan 2 µL door concentratie in een vacuümcentrifuge en voltooi dit door de monsters opnieuw te suspenderen in 20 µL 0,1% mierenzuur. De monsters zijn nu klaar voor analyse via LC-MS/MS. De porro-conjugatie levert doorgaans lectineconcentraties op de beads op in het bereik van 2 tot 20 mg/mL, wat optimaal is voor affiniteitschromatografie.Lectinechromatografie van Mars-depleted menselijk plasma, verteerd met trypsine, verrijkt doorgaans de glycopeptiden in de gebonden fractie. Onze workflow identificeert N-gebonden glycopeptiden, die de ongekoppelde consensussequentie NXS of NXT bevatten, waarbij X elk residu is behalve proline. PNGase F-behandeling verwijdert de ongekoppelde glycanen en deaminaseert het asparagineresidu waaraan de glycanen waren gebonden.Deamidatie resulteert in een massaverschuiving van één Dalton van het deglycosyleerde peptide of deglycopeptide ten opzichte van het ongewijzigde peptide. Zo worden DEG-glycopeptiden geïdentificeerd als peptiden die de N-gekoppelde consensussequentie bevatten, waarbij het asparagine-residu binnen de consensussequentie wordt waargenomen als een massaverchil van plus één vergeleken met een ongewijzigd asparagine-residu. Hier illustreren twee voorbeeldspectra dit concept.Het bovenste spectrum toont de fragmentatie van een ongewijzigd peptide dat de EnLink-consensussequentie bevat. Het onderste spectrum toont de fragmentatie van hetzelfde peptide met het gedeamineerde asparagine-residu binnen de EnLink-consensussequentie. De omcirkelde moleculaire ionen van de Y zeven, Y acht en B drie fragmenten van het gedeamideerde peptide zijn in massa met één Dalton toegenomen vergeleken met hun tegenhangers in het ongewijzigde peptide.Deze massaverschuiving geeft aan dat het peptide in het onderste spectrum een gedeamide asparagine-residu bevat. Met gebruik van een QStar elite worden doorgaans 1000 tot 1300 peptiden geïdentificeerd in de doorstroomfractie en 200 tot 400 peptiden in de gebonden fractie. Gemiddeld bevat de doorstroomfractie van een a l of SNA-chromatografie twee tot 4% glycopeptiden, terwijl 30 tot 50% van de peptiden die in de gebonden fractie zijn teruggewonnen, glycopeptiden zijn.Wij gebruiken de term deg-glycopeptiden in plaats van glycopeptiden, aangezien de deglycosyleerde gedeamideerde moleculen worden waargenomen tijdens massaspectrometrische analyse. Wij stellen echter voor dat het grootste deel van de DEG-glycopeptiden in onze monsters voorheen ongekoppelde glycopeptiden waren die door PN-GF-behandeling zijn deglycosyleerd en gedeamideerd. De verrijking van deg-glycopeptiden in ons gebonden monster ondersteunt deze hypothese en stelt ons in staat om de detectie van D-glycopeptiden te gebruiken als een proxy voor de glycopeptiden die zijn gevangen door ons lectine-affiniteitschromatografieprotocol.Twee of meer verschillende invertase d-glycopeptiden zouden in de flow-through fractie waargenomen moeten worden en twee of meer verschillende lactoferrine de-glycopeptiden in de gebonden fractie. We hebben zojuist laten zien hoe u lectinekolommen voorbereidt en lectine-affiniteitschromatografie uitvoert in een HPLC-formaat. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te starten met hoogwaardige glycopeptidemonsters, de pH van uw monsters gedurende het experiment te bewaken en de kwaliteit van uw chromatografie te bevestigen met glycopeptidestandaarden.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

a-lectin-hplc-method-to-enrich-selectively-glycosylated-peptides-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een methode voor de analyse van de verandering van N-gekoppelde glycanen door het vroege leven van glycoproteïnen na hun biosynthese in zoogdiercellen. Dit wordt bereikt door pulse-chase analyse van metabolisch gelabeld glycanen, enzymatische vrijlating uit glycoproteïnen en onderzoek door HPLC.

Pulse-chase analyse van N-gebonden suikerketens van glycoproteïnen in zoogdiercellen

In deze studie beschrijven we een verbeterde protocol een gemultiplexte high-throughput antilichaam microarray met lectine detectiemethode die gebruikt kan worden in de glycosylering profilering van specifieke eiwitten. Dit protocol is voorzien van nieuwe betrouwbare reagentia en vermindert de tijd, kosten en lab-apparatuur eisen ten opzichte van de vorige procedure.

Chemisch-geblokkeerde Antilichaam Microarray voor multiplexverzending High-throughput Profilering van specifiek eiwit glycosylering in Complex Samples

Een specifieke en gevoelige methode om inzicht te krijgen in de expressie profiel van glycosfingolipiden antigenen in het immuunsysteem organen en cellen wordt beschreven. De methode maakt gebruik van de ion trap massaspectrometrie waardoor stapsgewijze versnippering van glycosfingolipiden moleculen voor structurele analyse in vergelijking met chemisch gesynthetiseerde standaard.

Massaspectrometrische analyse van glycosfingolipiden antigenen

This video demonstrates the principle of separation of hydrophilic polar compounds using hydrophilic interaction liquid chromatography. This technique helps in the purification of various polar analytes, including N-glycans.

Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography: A Technique to Separate Hydrophilic Polar Analytes Using Hydrophilic Beads

Celoppervlakeiwitten biologisch belangrijke en sterk geglycosyleerd. We introduceren hier een glycopeptide-capture benadering oplosbaar te maken, te verrijken, en deglycosylate deze eiwitten voor facile LC-MS gebaseerde proteomics analyses.

Glycopeptide Capture voor celoppervlak Proteomics

Een hoogdoorvoerprotocol werd ontwikkeld voor gecombineerde proteomics en glycomics zuivering en LC-MS/MS kwantificering in plasma. Deamidatie-analyse van N-gekoppelde glycosyleringsmotieven was specifiek voor degekoppelde sites. Nauwkeurige kwantificering van N-glycanen werd bereikt door filterondersteunde N-glycaanscheiding te koppelen aan de individualiteitsnormalisatie bij het labelen met glycaanhydrazide-tagsstrategie.

Een kwantitatieve Glycomics en Proteomics Combined Purification Strategy

We presenteren een methode voor de zuivering, detectie en identificatie van diGly peptiden die afkomstig zijn van ubiquitinated eiwitten uit complexe biologische monsters. De gepresenteerde methode is reproduceerbaar, robuust en presteert beter dan gepubliceerde methoden met betrekking tot het diepteniveau van de ubiquitinomenanalyse.

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

Posttranslationele modificaties (PTM's) veranderen eiwitstructuren en -functies. Methoden voor de gelijktijdige verrijking van meerdere PTM-typen kunnen de dekking in analyses maximaliseren. We presenteren een protocol met behulp van dual-functionele Ti(IV)-geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie gevolgd door massaspectrometrie voor de gelijktijdige verrijking en analyse van eiwit N-glycosylatie en fosforylering in pancreasweefsels.

Een spin-tipverrijkingsstrategie voor gelijktijdige analyse van N-glycopeptiden en fosfopeptiden uit menselijke pancreasweefsels

Er wordt een protocol gepresenteerd voor het verrijken van gastheerceleiwitten (HCP's) uit geneesmiddelen (DP) en het detecteren van peptiden met behulp van proteoomverrijkingskorrels. De methode wordt gedemonstreerd met behulp van een in-house vervaardigde monoklonale antilichaam (mAb) geneesmiddelsubstantie (DS), die een goed gekarakteriseerd referentiemateriaal is voor het evalueren en vergelijken van verschillende methoden in termen van prestaties.

Gastheerceleiwitanalyse met behulp van verrijkingsparels in combinatie met beperkte spijsvertering

Eerder werd al een systeem ontwikkeld voor de geautomatiseerde en snelle analyse van glycanen op eiwitten. Dit artikel presenteert het protocol voor "glyco-kwalitatieve analyse", geoptimaliseerd voor een breed spectrum van gebruikers, zoals degenen die zich bezighouden met het analyseren van glycaanstructuren in biofarmaceutica en andere glycoconjugaatmaterialen.

Snelle glyco-kwalitatieve beoordeling van recombinante eiwitten met behulp van een volledig geautomatiseerd systeem

Dit protocol beschrijft de glycomics-geleide glycoproteomics-methode, een geïntegreerde omics-technologie die uitgebreide inzichten biedt in het heterogene glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen die nodig zijn om de glycobiologie van kankers beter te begrijpen.

Glycomics-geleide glycoproteomics vergemakkelijkt uitgebreide profilering van het glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen 

Leer een lectine HPLC-methode voor het verrijken van geglycosyleerde peptiden uit menselijk plasma. Deze techniek combineert lectine-affiniteitschromatografie met massaspectrometrie voor biomarkeronderzoek.

Een Lectin HPLC-methode voor het selectief-geglycosyleerde Peptiden Enrich van complexe biologische monsters

Meer video's verkennen