Dopamine-afgifte op afzonderlijke presynaptische Terminals gevisualiseerd met FFNs

De fluorescerende valse neurotransmitter. FFN 511 is de fluorescerende monoamine die als substraat kan dienen voor de synaptische fysieke monoamine-transporter wanneer deze wordt toegepast op hersensnijplakken. FN 511 wordt door dopaminerge synaptische blaasjes opgenomen via de monoamine-transporter en kan worden gebruikt om de afgifte van neurotransmitters direct te visualiseren vanuit presynaptische terminals van monoaminerge neuronen, zoals die in het S stratum. De afgifte van neurotransmitters vanuit de terminals is in de snijplak zichtbaar als een afname van punctate fluorescerende signalen.

In deze video worden coronale sal-sneden van 250 micrometer dik geprepareerd met een vibratoom, gekleurd met FFN 511 en afgebeeld met een multifoton laser-microscoop. Er worden detaining-experimenten getoond die een frequentieafhankelijke heterogeniteit van iCal-vrijgave onthullen. Hallo, ik ben HU van het lab van David in de afdeling Neurologie aan de Columbia University.

Hoi, ik ben Minerva, ook van het Soldier Lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor het labelen van dopamine-terminalen in hersensecties met fluorescerende faux-neurotransmitters. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om dopaminevrijgave te bestuderen.

Laten we beginnen. Voordat de acute sal-sneden worden voorbereid, moet het kunstmatige cerebrospinaalvocht (A CSF) worden geoxygeneerd en minstens 15 minuten vóór de extractie van de hersenen op ijs worden gekoeld; houd het A CSF ijskoud en geoxygeneerd. Haal tijdens de dissectie de volledige hersenen uit de muis en monteer deze op het vibrasleufje, dat op de vibratoom is geplaatst met behulp van secondelijm. De extractie en montage van de hersenen moeten binnen twee minuten worden voltooid.

Vul het plateau met gekoelde, geoxygeneerde A CSF coronal gesneden rechte hersensecties of hersenschijfjes met een dikte van 250 micrometer tussen +1,54 en +0,62. Drie hele schijfjes worden verkregen, die met een naald in zes halve schijfjes kunnen worden gesneden. Incubeer de hersenschijfjes gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur in geoxygeneerde A CSF terwijl de hersenschijfjes worden geïncubeerd.

Bereid in gezuurstofte A CSF de 10 micromolaire FFN 511-laadoplossing voor door 10 millimolaire FFN 511-stockoplossing toe te voegen aan de A CSF. Bereid daarna een oplossing van honderd micromolaire A-D-V-A-S-E-P zeven in A CSF. Zuurstof beide oplossingen gedurende ten minste 15 minuten voordat ze afzonderlijk in de plakken worden geladen. Incubeer elke hersenplak gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met de FFN 511-laadoplossing.

Verwijder vervolgens het di dat gebonden is aan extracellulair weefsel door de beladen slice gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te incuberen in geoxygeneerde 100 micromolair advers, zeven A CSF. De slices zijn nu klaar voor imaging. FFN 511-kleuring wordt in de slices afgebeeld met behulp van een Prairie Ultima multiphoton laser-scanning microscoop. Plaats de FFN 511-beladen slice in de opnamekamer en perfundeer deze met geoxygeneerde A CSF met een stroomsnelheid van 1 tot 2 milliliter per minuut. Plaats vervolgens een platinaharp met nylon snaren bovenop de slice om beweging te minimaliseren.

Om beweging tijdens het experiment verder te minimaliseren, laat u de coupes ten minste 10 minuten stabiliseren in de kamer voordat u begint met de beeldvorming. Visualiseer en lokaliseer de dorsale stri AUM met brightfield-luminescentie onder een 10 x waterimmersie-objectief en plaats en positioneer de bipolaire getwiste wolfraamelektroden in deze regio voor het uitvoeren van een stimulatie-experiment. Het ideale beeldvormingsgebied bevindt zich binnen 300 micrometers.

Plaats dit gebied, waarin de SAL-terminalen zijn gelabeld met FFN 511, tussen de twee punten van de stimulerende bipolaire elektrode in het centrum van het beeldveld onder een 63 x waterimmersie-ultraviolet objectief. FFN 511 wordt geëxciteerd bij 760 nanometer met een MiTai-laser van Spectral Physics. Optimale fluorescentie van SAL-terminalen is zichtbaar via een banddoorlaatfilter; leg beelden vast in 12-bits formaat met belangstellende gebieden (regions of interest) van 75 bij 75 micrometer bij een resolutie van 512 bij 512 pixels. Een voorbeeldbeeld van SAL-dopamineterminalen gelabeld met FFN 511 wordt hier getoond.

De FFN 511-labeling kan worden verwijderd door hoge concentraties kaliumchloride-amphetaminesulfaat of door elektrische stimulatie in het kaliumchloride-detaining-experiment; wanneer een hoge kalium-A CSF-oplossing op de hersensnij wordt aangebracht, verdwijnt de FFN 511-labeling binnen vier minuten. Registreer XYZT-beelden om de detaining van FFN 511 in de loop van de tijd te volgen bij FFN 511-kleuring door elektrische stimulatie. Verkrijg voor ten minste vijf minuten vóór de stimulatie een controle-tijdreeksbeeld van de Zack om minimale beweging van de snede en geen fotobleking door de laser te garanderen na de acquisitie van de controlebeelden.

Zet de XYZT-beeldvorming voort terwijl de stimulatie wordt gestart bij frequenties van één, vier of 20 hertz; stimuli worden lokaal op het striatum toegepast door een isof lex stimulusisolator, aangestuurd door een master eight pulsgenerator met bipolaire elektroden. Deze video toont de afbraak van FFN 511 tijdens exocytose in een SAL-brensnijde. Preparatie: wanneer de belading van FFN 511 in de SAL voltooid is, worden uitgebreide labeling in het striatum, schaarse labeling in de cortex en geen labeling in het corpus callosum waargenomen.

De selectieve markering van dopamineterminals kan worden aangetoond door kaliumchloride, zoals te zien is in deze representatieve afbeeldingen vóór kaliumchloride en twee minuten na de toediening van 70 millimolair kaliumchloride. Een CSF-depletie van FFN 511-markering kan ook worden bereikt met amfetamine. En deze afbeelding toont FFN 511-markering in het striatum vóór amfetamine.

Terwijl deze afbeelding het striatum toont 20 minuten na detraining met 20 micromolar amfetamine, wordt de detraining van FFN 511-labeling door lokale elektrische stimulatie geïllustreerd in deze afbeeldingen, die de FFN 511-labeling in het striatum tonen vóór stimulatie en op 217 seconden en 514 seconden na het begin van stimulatie bij vier hertz. Deze grafiek van genormaliseerde fluorescentie-intensiteit over de tijd laat zien dat detraining van FFN 511 calcium- en frequentieafhankelijk is; controles, weergegeven door de open driehoeken, ontvingen geen stimulatie. Detraining met cadmiumchloride, weergegeven door open cirkels, was identiek aan de ongestimuleerde controles.

De afbuigingscurves voor elke stimulatiefrequentie, weergegeven door de gekleurde cirkels, werden gefit met een enkelvoudige exponentiële vervalfunctie en de halfwaardetijden werden berekend als tau vermenigvuldigd met 0,693. We hebben zojuist aangetoond hoe een fluorescerende neurotransmitter-sensor FFN 11 in dopamine-terminaal kan worden geladen in een acute slice en hoe deze kan worden vrijgegeven door hoog kalium en door stimulaties op te wekken. Dit is de eerste methode die is ontwikkeld om de afgifte van neurotransmitters optisch te onderzoeken op het niveau van individuele synaptische terminalen.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de coupes zeer gezond te houden en rekening te houden met de laadtijd, het bleken van de achtergrond en bewegingsartefacten; coupes vertonen een goede FFN five 11 lading en beeldvorming tot vier uur na de coupevoorbereiding. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.