PAR-Clip - een methode om Transcriptome-breed de bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten te identificeren
2 juli 2010
RNA transcripten zijn onderworpen aan een uitgebreide posttranscriptionele regulering die wordt bemiddeld door een veelheid van trans-werkende RNA-bindende eiwitten (RBPs). Hier presenteren wij een generaliseerbaar methode om te identificeren precies en op een transcriptoom schaal van de RNA-bindingsplaatsen van RBPs.
Het algemene doel van deze procedure is om de transcriptoom brede bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten of RVP's te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst fotoreactieve nucleoside-analogen te gebruiken voor in vivo labeling van nascente transcripten. De tweede stap van de procedure is het cross-linken van RNA en RNA-bindende eiwitten door 365 nanometer UV-licht.
De derde stap van de procedure is het immunoprecipiteren van het onderzochte RNA-bindende eiwit en het herstellen van de cross-link naar RNA. De laatste stap van de procedure is het omzetten van de RNA in een CD NA-bibliotheek en diep sequentiëren. Het resulteert uiteindelijk in resultaten die transcriptoombrede bindingsplaatsen van de RVP's tonen en de definitie van het RNA-herkenningselement en zijn bindingsvoorkeuren mogelijk maken.
Hallo, mijn naam is Marcus Hoffner van het lab van Tom SEL aan de Rockefeller University in New York. Vandaag laten we een methode zien die par lip of photoable rib nucleoside analog enhanced cross-linking en immunoprecipitation wordt genoemd. We gebruiken deze procedure in ons lab om op transcriptoomschaal bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten en hun bindingsmotieven en voorkeuren te identificeren.
Oké, laten we beginnen. In vivo UV cross-linking begint in een laminar flow hood. In dit protocol zullen we gelabelde IGF two BP one cellen gebruiken als een voorbeeldmodel met behulp van steriele techniek.
Breid HEK 2 93 cellen stabiel uit die flag HA gelabelde IGF two BP one tot expressie onder controle van een Tet repressor in HEK 2 93 celkweekmedium. Gebruik tussen 100 en 400 keer 10 tot de zesde cellen en kweek ze tot ongeveer 80%co fluence. Bij 14 uur vóór cross-linking hadden de cellen de fotoreactieve riboside-analoge voor thio uridine of voor SU direct in het celkweekmedium. Als alternatief kan zes th guine of zes SG worden gebruikt na toevoeging van de fotoreactieve riboside om expressie van de flag HA gelabelde IGF two BP one te induceren door toevoeging van doxycycline. De cellen worden vervolgens een nacht in een celincubator geïncubeerd.
Vervolgens giet je het groeimedium af. Was de cellen vervolgens eenmaal met 10 milliliter ijskoud fosfaat gebufferd zoutwater per plaat. Verwijder vervolgens de PBS volledig door af te gieten.
Plaats de onbedekte platen op een bak met ijs en bestraal ze met 365 nanometer UV-licht in een straddle linker 2, 400 UV crosslinker of equivalent. Daarna schraap je de cellen met een rubberen politieman in één milliliter PBS per plaat. Breng de cellen over in 50 milliliter centrifugeerbuizen en centrifugeer ze 5 minuten bij 500 G bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg en bewaar het cellenpellet.
Op dit punt kunnen cellenpellets worden snel bevroren in vloeibare stikstof en worden bewaard bij minus 80 gedurende ten minste 12 maanden. Om door te gaan met de procedure hervat je het pellet in drie volumes van een X NP 40 lysebuffer en incubeer het op ijs gedurende 10 minuten. Klaar de cellenlysaat door centrifugeren bij 13.000 G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.
Na centrifugatie, maak de lysaat verder vrij door het door een vijf micron membraan spuitfilter te filteren. Voeg vervolgens RNAs T een toe tot een eindconcentratie van één eenheid per microliter en incubeer in een waterbad bij 22 graden Celsius gedurende 15 minuten. Koel vervolgens de reactie af op ijs gedurende vijf minuten.
Na in vivo UV cross-linking. Bereid de magnetische kralen voor immunoprecipitatie voor. Breng 10 microliter dyna beads protein G magnetische deeltjes per een miljoen cellysaat over naar een 1,5 milliliter micro centrifugeerbuisje.
Plaats vervolgens de buis met de kralen op een magnetische standaard gedurende één tot twee minuten. Verwijder het supernatant en voeg één milliliter citraat fosfaatbuffer toe aan de buis terwijl deze op de magnetische separator staat. Dek vervolgens de buis af en vortex het monster om de kralen opnieuw op te schorten.
Centrifugeer kort om eventuele kralen die in de dop van de buis achterblijven te verzamelen. Herhaal deze wassing met een extra milliliter citraat fosfaatbuffer. Na de wassing, schors de kralen en citraat fosfaatbuffer opnieuw op in een volume van twee keer het oorspronkelijke volume van de kralensuspensie.
Voeg vervolgens 0,25 milligram Anti-Flag M twee monoklonaal antilichaam toe per één milliliter kralensuspensie. Incubeer de suspensie op een roterende wiel gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur. Na de incubatie, was de kralen twee keer in één milliliter citraat fosfaatbuffer zoals eerder beschreven, deze wassing dient om eventueel ongebonden antilichaam te verwijderen. Na de wassing, schors de kralen en citraat fosfaatbuffer opnieuw op zoals eerder beschreven. Om te beginnen met immunoprecipitatie, voeg de vers bereide antilichaam geconjugeerde magnetische kralen toe aan de RNAs T een behandelde cellysaat.
Breng de mengsel over naar 15 milliliter centrifugeerbuizen en roter gedurende één uur bij vier graden Celsius. Na incubatie, verzamel de magnetische kralen, gooi het supernatant weg, schors de kralen opnieuw op in één milliliter IP wasbuffer en breng ze over naar 1,5 milliliter centrifugeerbuizen. Was de kralen zoals eerder beschreven twee keer in één milliliter IP wasbuffer.
Na de laatste wassing, schors de kralen opnieuw op in het oorspronkelijke kralenvolume IP wasbuffer. Voeg vervolgens RNAT een toe tot een eindconcentratie van 100 eenheden per microliter. Incubeer de kralensuspensie in een waterbad van 22 graden Celsius gedurende 15 minuten.
Koel vervolgens de suspensie af op ijs gedurende vijf minuten. Was vervolgens de kralen drie keer in één milliliter hoge zout wasbuffer. Schrop vervolgens de kralen opnieuw op in één oorspronkelijk kralenvolume defosforyleringsbuffer.
Voeg kalfsintestinaal alkalisch fosfatase toe tot een eindconcentratie van 0,5 eenheden per microliter en incubeer de suspensie gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Was de kralen twee keer in één milliliter fosfatase wasbuffer en vervolgens nog twee keer in polynucleotidekinase of PNK buffer zonder DTT. Schrop vervolgens de kralen opnieuw op in één oorspronkelijk kralenvolume PNK buffer.
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het identificeren van RNA-bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten (RBPs) op transcriptoombrede schaal. De procedure maakt gebruik van fotoreactieve nucleoside-analoga en UV-crosslinking om de studie van RBP-interacties met RNA te vergemakkelijken.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- RNA-transcripten ondergaan uitgebreide posttranscriptionele regulatie.
- RNA-bindende eiwitten (RBP's) spelen een cruciale rol bij deze regulatie.
- Het identificeren van RBP-bindingsplaatsen is essentieel voor het begrijpen van de RNA-biologie.
- Huidige methoden kunnen tekortschieten in precisie of toepasbaarheid op het gehele transcriptoom.
Doel van de studie
- Om een generaliseerbare methode te ontwikkelen voor het identificeren van RBP-bindingsplaatsen.
- Om het begrip van RNA-herkenningselementen en bindingsvoorkeuren te verbeteren.
- Om een protocol te bieden dat kan worden toegepast op diverse RNA-bindende eiwitten.
Gebruikte methoden
- In vivo labelen van pas gevormde transcripten met behulp van fotoreactieve nucleoside-analogen.
- Cross-linking van RNA en RBP's met UV-licht.
- Immunoprecipitatie van RBP's om cross-linked RNA terug te winnen.
- Deep sequencing van RNA om bindingsplaatsen te identificeren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van transcriptome-brede bindingsplaatsen voor RBP's.
- Definitie van RNA-herkenningselementen en hun bindingsvoorkeuren.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode op diverse celtypen.
Conclusies
- De ontwikkelde methode biedt een robuuste aanpak voor het bestuderen van RBP-interacties.
- Het verbetert het begrip van posttranscriptionele regulatiemechanismen.
- Deze techniek kan in diverse onderzoekskonteksten worden ingezet om de RNA-biologie te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Het identificeren van transcriptoombrede RNA-eiwitinteracties maakt een mechanische risicoreductie van RNA-bindend eiwit-targets mogelijk tijdens vroege discovery-fasen. PAR-CliP biedt mutatiegebaseerde signaaldiscriminatie om de betrouwbaarheid van targets te vergroten en fout-positieven in RBP-validatieworkflows te verminderen. Dit ondersteunt het voorspellende vertrouwen bij de identificatie van lead-moleculen door RNA-herkenningselementen en bindingsvoorkeuren in ziekterelateerde systemen te verduidelijken.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door het in kaart brengen van directe RNA-bindingsplaatsen van RBP's die betrokken zijn bij post-transcriptionele regulatie.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van fotoreactieve nucleoside-analogen (4-SU, 6-SG) en UV-crosslinking bij 365 nm om transiënte en stabiele interacties in levende cellen vast te leggen.
- Wetenschappelijke waarde: Definieert RNA-herkenningsstroomelementen en bindingsvoorkeuren via T→C- of G→A-mutaties in cDNA-sequenties, waardoor het werkelijke signaal van de achtergrond kan worden gescheiden.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, mutatie-gelabelde cDNA-bibliotheken voor deep sequencing, wat reproduceerbare detectie van RBP-gebonden RNA-fragmenten mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare input voor bioinformatische analyse, wat de assay-gereedheid voor target engagement screening ondersteunt.
- Wetenschappelijke waarde: Karakteriseert bindingsvoorkeuren en motievenverrijking, wat bijdraagt aan het ontwerp van RNA-gerichte kleine moleculen of oligonucleotiden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt RBP-bindingsplaatsen aan functionele resultaten in ziekterelevante systemen, wat bijdraagt aan de afstemming van translationele biomarkers.
- Operationele waarde: Werkt bij verschillende celtypen (bijv. HEK293) en kan worden aangepast voor primaire cellen of ziektemodelcellen die getagde RBP's tot expressie brengen.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt besluitvorming over verdere ontwikkeling op basis van risicoanalyse mogelijk door de mechanistische rollen van RBP's in RNA-stabiliteit, splicing of translatie te verduidelijken.
Integratie van Pipeline & Workflow
PAR-CliP past binnen het discovery-continuüm, van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische mechanistische studies, en biedt een resolutie van de bindingsplaats die dient als basis voor downstream modulatiestrategieën.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door directe RNA-targets te identificeren van RBPs die ziekterelevante transcripten reguleren.
- Screening: Levert kwantitatieve, sequentieerklare outputs die vergelijking van binding mogelijk maken over verschillende condities, mutanten of therapeutische verstoringen.
- Analytics: Vertrouwt op bio-informatische scoring van kenmerkende mutaties (T→C, G→A) om crosslinked RNA te onderscheiden van de achtergrond, wat nauwkeurige peak calling mogelijk maakt.
- Translational Research: Verbindt moleculaire bindingsgegevens met functionele continuïteit door RBP-sites te koppelen aan het lot van RNA in preklinische modellen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het profileren van diverse RBPs (bijv. IGF2BP1) over projecten heen, waardoor redundante methodeontwikkeling wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij doelwitvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit bij het in kaart brengen van RNA-regulonen.
- Operationele waarde: Standaardisatie door gedefinieerde crosslinking-condities, filtering op basis van mutaties en reproduceerbare bibliotheekvoorbereiding.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen door het verduidelijken van de sterkte en specificiteit van RBP-RNA-interacties, waardoor biologische risico's in een late fase worden verminderd.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van RNA-gerichte therapieën op basis van gevalideerde bindingsplaatsen en motiefvoorkeuren.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in moleculaire klonering, celkweek en protocollen voor UV-crosslinking.
- Toegang tot een 365 nm UV-crosslinker, reagentia voor immunoprecipitatie en een infrastructuur voor deep sequencing is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de analoge dosering, de crosslinking-tijd en de stringentie van de wasstappen.
- Aanpassing is vereist bij de overgang van tagged overexpressiemodellen naar endogene systemen of primaire cel-systemen.
- Praktische beperking: 6-SG vertoont een lagere crosslinking-efficiëntie dan 4-SU, waardoor een hogere celinput nodig is om de achtergrondruis van overvloedige cellulaire RNA's te overwinnen.
