Name: PAR-Clip - een methode om Transcriptome-breed de bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten te identificeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Leer PAR-Clip om transcriptoom-brede bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten te identificeren met behulp van fotoreactieve nucleoside-analogen en UV-crosslinking. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van RNA-eiwitinteracties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de leden van de Tuschl laboratorium voor nuttige discussies. MH wordt ondersteund door de Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD). Dit werk werd ondersteund door het Zwitsers Nationaal Fonds Grant # 3100A0-114001 naar MZ, TT is een HHMI onderzoeker, en het werk in zijn laboratorium werd ondersteund door NIH beurzen GM073047 en MH08442 en de Starr Foundation.

Het protocol beschrijft de PAR-Clip procedure voor HEK293 cellen die FLAG / HA-gelabeld IGF2BP1 na inductie met doxycycline. We zullen gebruik maken van een anti-FLAG antilichaam voor immunoprecipitatie. PAR-Clip zal werken met elke cellijn die detecteerbare niveaus van de endogene, niet-gecodeerde RNA bindend eiwit (RBP) van belang als een efficiënte antilichaam voor immunoprecipitatie beschikbaar is. Uitbreiding van cellen <ol><li> Uit te breiden FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 cellen in groei medium. Wij raden u aan tussen de 100 tot 400 x 10 6 cellen (ca. 10-40 15 cm celkweek platen) als uitgangspunt. Groeien ze ongeveer 80% confluentie. </li><li> 14 uur voor crosslinking toevoegen) 4-thiouridine tot een uiteindelijke concentratie van 100 uM (1:1000 v / v van een 1 M 4-thiouridine voorraad-oplossing) rechtstreeks naar de cel kweekmedium en b), leiden tot uitdrukking van de FLAG / HA getagd IGF2BP1 door toevoeging van 1 ug / ml doxycycline (1:10.000 v / v van 10 mg / ml doxycycline voorraad-oplossing). LET OP: in plaats van 4-thiouridine kunt u ook gebruik maken van 100 pM van 6-thioguanosine. </li></ol> UV-crosslinking <ol><li> Een keer wassen cellen met 10 ml ijskoude PBS per plaat en volledig te verwijderen PBS. </li><li> Plaats borden op een dienblad met ijs en bestralen ontdekt met 0,15 J / cm 2 van 365 nm UV-licht in een Stratalinker 2400 (Stratagene) of soortgelijk apparaat. </li><li> Schraap cellen af ​​met een rubberen politieman in 1 ml PBS per plaat, over te dragen aan 50 ml centrifugeren buizen en verzamelen door centrifugatie bij 500 xg gedurende 5 min bij 4 ° C en gooi het supernatant. 100 x 10 6 HEK293 cellen (10 15 cm platen) zal opleveren ca.. 1 ml van de natte cel pellet. </li><li> (Optioneel) Tenzij u rechtstreeks wilt doorgaan met cellysis, shock bevriezen van de cel pellet in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C. Celpellets kunnen worden opgeslagen voor ten minste 12 maanden. </li></ol> Cellysis en RNaseT1 verteren <ol><li> Neem celpellet van verknoopt cellen in drie volumes van 1x NP40 lysisbuffer en incubeer op ijs gedurende 10 minuten. </li><li> Duidelijke cellysaat door centrifugatie bij 13.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Schakel het lysaat verder door te filteren door een 0,2 um membraan spuitfilter (Pall Acrodisc of gelijkwaardig). </li><li> Voeg RNase T1 (Fermentas, 10.000 U / pl) tot een uiteindelijke concentratie van 1 U / pl en incuberen in een waterbad gedurende 15 minuten bij 22 ° C. Cool reactie vervolgens gedurende 5 minuten op ijs voordat u verder gaat. </li></ol> Immunoprecipitatie en herstel van verknoopt doelwit RNA-fragmenten Met behulp van de magnetische separator Volg deze richtlijnen in het monster voorbereiding op de magnetische korrels te voorkomen dat uitdroogt. <ol><li> Plaats de buis met de kralen op de magnetische staan ​​een 2 minuten. </li><li> Voeg de buffer op de buis, terwijl de buis op de magnetische separator. </li><li> Dop van de tube, verwijder het uit de magnetische scheider, en resuspendeer de kralen. U kunt resuspendeer de kralen door flicking de buis met uw vinger of gebruik een vortexer vastgesteld op 5 6. </li><li> Centrifuge kort om alle kralen die kunnen blijven in het dopje te verzamelen. </li><li> Herhaal de stappen 1 tot en met 4 zoals vereist. </li></ol> Voorbereiding van de magnetische beads <ol><li> Breng 10 ul van Dynabeads Proteïne G magnetische deeltjes (Invitrogen) per ml cellysaat (voor een typisch experiment moet worden ca.. 40 50 ul van kralen) naar een 1,5 ml microfugebuis. Twee keer wassen kralen met 1 ml citraat-fosfaat buffer. </li><li> Resuspendeer twee keer het volume van de citraat-fosfaat buffer ten opzichte van het oorspronkelijke volume van de kraal schorsing. </li><li> Voeg 0,25 ug van anti-FLAG M2 monoklonaal antilichaam (Sigma) per ml suspensie en incubeer op een roterend wiel gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Twee keer wassen kralen in 1 ml citraat-fosfaat buffer om ongebonden antilichamen te verwijderen. </li><li> Resuspendeer kralen in twee keer het volume van de citraat-fosfaat buffer ten opzichte van het oorspronkelijke volume van de kraal schorsing. </li></ol> Immunoprecipitatie (IP), tweede RNase T1 spijsvertering, en defosforylering <ol><li> Voeg 20 ul van vers bereide antilichaam-geconjugeerde magnetische korrels per ml van de gedeeltelijke RNase T1 behandeld cellysaat en incubeer in 15 ml centrifugeren buisjes op een roterend wiel gedurende 1 uur bij 4 ° C. </li><li> Verzamel magnetische kralen aan een magnetische deeltjes collector voor 15 en 50 ml centrifugeren buizen (Invitrogen) en over te dragen aan 1,5 ml microfugebuisje buizen. </li><li> Was kralen 3 keer in 1 ml van IP wasbuffer. </li><li> Voeg RNaseT1 (Fermentas, 10.000 U / pl) tot een uiteindelijke concentratie van 100 U / ul toe en incubeer de kraal suspensie in een waterbad gedurende 15 minuten bij 22 ° C. Koel vervolgens op ijsgedurende 5 minuten. </li><li> Was kralen 3 keer in 1 ml van een hoge-zout wasbuffer. </li><li> Resuspendeer kralen in een volume van defosforylering buffer </li><li> Voeg kalf intestinale alkalische fosfatase (CIAP, NEB) tot een uiteindelijke concentratie van 0,5 U / pl, en incubeer de suspensie gedurende 10 minuten bij 37 ° C. </li><li> Twee keer wassen kralen in 1 ml fosfatase wasbuffer </li><li> Was kralen tweemaal in polynucleotide kinase (PNK) buffer zonder DTT (de DTT concentratie nodig zijn voor de enzymatische reactie is hoog genoeg om de magnetische korrels schade). </li><li> Resuspendeer kralen in een originele kraal volume van PNK buffer </li></ol> Radiolabeling van RNA segmenten verknoopt aan immunogeprecipiteerd eiwitten <ol><li> Om de kraal schorsing hierboven beschreven, toe te voegen Υ-32 P-ATP tot een uiteindelijke concentratie van 0,5 uCi / ul en T4 PNK (NEB) tot 1 U / ul in een origineel kraal volume. Incubeer de suspensie gedurende 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Voeg niet-radioactieve ATP tot een uiteindelijke concentratie van 100 uM te verkrijgen en voor nog eens 5 minuten incuberen bij 37 ° C. </li><li> Was de magnetische korrels 5 keer met 800 ul van PNK buffer zonder DTT. </li><li> Resuspendeer de parels in 70 pl van SDS-PAGE laadbuffer. </li></ol> SDS-PAGE en elektro van verknoopt RNA-eiwit-complexen van de gel plakken <ol><li> Incubeer de radioactief gelabelde schorsing voor 5 min in een warmte-blok bij 95 ° C te denatureren en laat de immunogeprecipiteerd RBP met verknoopt RNA en vortex. </li><li> Verwijder de magnetische korrels op de afscheider en breng het supernatant naar een schone 1,5 ml microfugebuis. </li><li> Belasting 40 ul van de supernatant per putje van een Novex Bis-Tris 4-12% (Invitrogen) prefab polyacrylamidegel en laat de gel voor 55 min bij 200 V. </li><li> Demonteer de gel kamer en afbreken van de gel, waarbij het gemonteerd op een plaat. Ter bevordering van de uitlijning van de gel op de phosphorimager papieren afdruk, raden wij aan het implanteren van drie kleine radioactieve gel stukjes asymmetrisch op drie van de vier hoeken van de gel. Radioactieve gel stukken kunnen worden afgehaald bij gels die voorheen werden gebruikt om radioactief gelabelde synthetische oligonucleotiden te zuiveren. Wikkel de gel in plastic folie (bv Saran wrap) om besmetting te voorkomen. </li><li> Expose de gel om een ​​blanco phosphorimager scherm voor 1 uur en visualiseren op een phosphorimager. </li><li> Lijn de gel op de top van de phosphorimager afdruk met behulp van de geïmplanteerde gel stukken voor oriëntatie. Knip de bands die overeenkomen met de verwachte grootte van RBP (IGF2BP1, ca.. 75 kDa) en over te dragen aan een D-Tube kunstnier Midi Tube en voeg 800 ul 1x SDS lopen buffer. </li><li> Electroelute de verknoopte RNA-RBP-complex in 1x SDS draait buffer bij 100 V gedurende 2 uur uitgesneden uit de gel en electroeluted in een D-Tube kunstnier Midi (Novagen) in 800 pl SDS buffer loopt volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol> Proteinase K spijsvertering <ol><li> Voeg een gelijk volume van 2x proteïnase K-buffer met betrekking tot de electroeluate, gevolgd door de toevoeging van proteïnase K (Roche) tot een uiteindelijke concentratie van 1,2 mg / ml. Incubeer gedurende 30 minuten bij 55 ° C. </li><li> Herstel de RNA door zure fenol / chloroform / IAA extractie (25:24:1, pH 4,0), gevolgd door een chloroform extractie. Voeg 1 ui glycogeen (10 mg / ml voorraad) neerslag het RNA door het toevoegen van drie volumes ethanol. Los de pellet in 10,5 ul water. </li></ol> cDNA-bibliotheek voorbereiding en diepe sequencing Draag de herstelde RNA door middel van een standaard-cDNA-bibliotheek voorbereiding protocol oorspronkelijk beschreven voor het klonen van kleine RNA&#39;s de regelgeving 19. De eerste stap, 3 &#39;adapter ligatie werd uitgevoerd zoals beschreven op een 20 ul schaal met behulp van 10,5 ul van de herstelde RNA. Gebruik de Solexa sequencing adapter sets beschreven. Afhankelijk van de hoeveelheid RNA hersteld, kan 5&#39;-adapter-3&#39;-adapter producten zonder inserts worden gedetecteerd na amplificatie van het cDNA als extra PCR-bands. In dergelijke gevallen, accijnzen op de langere PCR-product van de verwachte grootte van een 3% NuSieve lage smeltpunt agarose gel, elueren het PCR-product uit de gel stukken met behulp van de GelElute kit (Qiagen) en sequentie met behulp van de Solexa technologie. Een Solexa sequencing run biedt meestal tussen de 6 en 10 miljoen volgorde leest dat genoeg zijn voor een transcriptoom brede dekking van de bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten. Bioinformatische analyse Zorgvuldige bio analyse van de volgorde leest moet worden gedaan om betekenisvolle inzicht te krijgen in de RNA bindingsplaatsen voor de onderzochte RBP, zoals de erkenning van RNA element, de voorkeur binding regio&#39;s van de RBP heeft (exonic vs intronische, coderende sequentie versus niet-vertaalde volgorde). De volgorde leest moeten worden aangepast tegen het genoom en EST databases. We gebruiken meestal leest Mapping unieke aan het genoom met maximaal een mismatch, insertie of deletie tot clusters van sequentie te bouwen leest die vervolgens verder kan worden geanalyseerd. De frequentie van karakteristieke mutaties in de geclusterde opeenvolgende leest, T naar C overgangen bij gebruik van 4-SU en G naar A overgangen bij het gebruik van zes-SG, zijn indicatief voor succes verknoopt sequenties. In onze ervaring niet-verknoopte RNA&#39;s voorzien van 4-SU vertonen een achtergrond mutatie snelheid van ongeveer 20%. Dit tarief is vergroot tot ca.. 50-80% bij de verknoping. Een gedetailleerde beschrijving van de bioinformatica analyse kan worden gevonden in het Aanvullend materiaal van de publicatie door Hafner et al.. 18 Optionele stappen Bepaling van de incorporatie niveaus van 4-thiouridine in totale RNA Isoleer totaal RNA uit de cel lijn stabiel uiting van de RBP van de belangstelling na een groei in het medium aangevuld met 100 uM 4SU 16 uur voorafgaand aan de oogst. Als een controle-, oogst-cellen gekweekt zonder 4SU toevoeging. Isoleer totaal RNA door de toevoeging van drie volumes TRIzol reagens (Sigma) om de gewassen celpellets volgens de fabrikant de instructies. was verder te zuiveren totaal RNA met behulp van Qiagen RNeasy volgens protocol van de fabrikant. Om te voorkomen dat oxidatie van 4SU tijdens de RNA-isolatie en analyse, voeg 0,1 mM dithiothreitol (DTT) om de buffers te wassen en de daaropvolgende enzymatische stappen. Digest en gedefosforyleerd totaal RNA om enkele nucleosiden voor HPLC-analyse zoals eerder beschreven 20. Kortom, in een 30 ul volume, incubeer 40 ug van gezuiverd totaal RNA waren voor 16 uur bij 37 ° C met 0,4 U bacteriële alkalische fosfatase (Worthington Biochemical) en 0,09 U slangengif fosfodiësterase (Worthington Biochemical). Als referentie standaard, gebruik maken van een synthetische 4SU-gelabelde RNA, (we standaard gebruiken CGUACGCGGAAUACUUCGA (4SU) U) en ook onderworpen aan enzymatische vertering te voltooien. Scheid de verkregen mengsels van ribonucleosides door HPLC op een Supelco Discovery C18 (gebonden fase silica 5 uM deeltje, 250 x 4,6 mm) reverse-phase kolom (Bellefonte PA, USA). HPLC buffers zijn 0,1 M Teaa in 3% acetonitril (A) en 90% acetonitril in water (B). Gebruik een isocratische gradiënt: 0% B gedurende 15 min, 0 tot 10% B gedurende 20 min, 10 tot 100% B gedurende 30 minuten. Breng een 5 min 100% B was aangebracht tussen loopt schoon te maken de HPLC-kolom. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2034/2034fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1 (rechter paneel) toont een representatief resultaat van een PAR-Clip uitgevoerd met cellijnen uiten van FLAG / HA-gelabeld IGF2BP1 met 4-SU en 6-SG. Merk op dat de verknoping efficiëntie van de 6-SG voor IGF2BP1 lager is dan de verknoping efficiëntie voor 4-SU. De lagere crosslinking rendement zal resulteren in een hogere achtergrond van de sequenties die afkomstig zijn uit fragmenten van overvloedige cellulaire RNA&#39;s en daarom moet u overwegen het opschalen van het experiment bij het gebruik van minder efficiënte fotoreactief nucleosiden. Het linker paneel van Figuur 1 toont een vergelijking van het gebruik van verschillende fotoreactief uridine-analogen die mogelijk voor PAR-Clip gebruikt ten opzichte van traditionele UV 254 nm crosslinking. De intensiteit van de radioactieve band van de juiste lengte geeft u een goed idee of de PAR-Clip experiment heeft gewerkt en je hebt voldoende geïsoleerde RNA uit te voeren door middel van een kleine RNA-sequencing protocol (stap-voor-stap beschrijving voor de cDNA-bibliotheek voorbereiding van de kleine RNA-sequencing kunnen worden gevonden in 19). De frequentie van karakteristieke mutaties in de volgorde leest, T naar C overgangen bij gebruik van 4-SU en G naar A overgangen bij het gebruik van zes-SG, zijn indicatief voor succes verknoopt sequenties. In onze ervaring niet-verknoopte RNA&#39;s voorzien van 4-SU vertonen een achtergrond mutatie snelheid van ongeveer 20%. Dit tarief is vergroot tot ca.. 50-80% bij de verknoping.

<ol><li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+regulons%3A+coordination+of+post-transcriptional+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat. Rev. Genet. 8 (7), 533-533 (2007).</li>
<li>Tenenbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 97 (26), 14085-14085 (2000).</li>
<li>Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+mRNAs+associated+with+the+translational+regulator+PUMILIO+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of mRNAs associated with the translational regulator PUMILIO in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 103 (12), 4487-4487 (2006).</li>
<li>Lopez de Silanes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+target+RNA+motif+for+RNA-binding+protein+HuR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 101 (9), 2987-2987 (2004).</li>
<li>Greenberg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+light-induced+crosslinking+of+mRNA+to+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet light-induced crosslinking of mRNA to proteins.</a> Nucl. Acids Res. 6 (2), 715-715 (1979).</li>
<li>Wagenmakers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking+of+mRNA+to+proteins+by+irradiation+of+intact+cells+with+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Cross-linking of mRNA to proteins by irradiation of intact cells with ultraviolet light.</a> Eur. J. Biochem. 112 (2), 323-323 (1980).</li>
<li>Mayrand, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+nuclear+ribonucleoprotein%3A+identification+of+proteins+in+contact+with+poly%28A%29%2B+heterogeneous+nuclear+RNA+in+living+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure of nuclear ribonucleoprotein: identification of proteins in contact with poly(A)+ heterogeneous nuclear RNA in living HeLa cells.</a> The Journal of Cell Biology. 90 (2), 380-380 (1981).</li>
<li>Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+heterogeneous+nuclear+RNA-protein+complexes+in+vivo+with+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of heterogeneous nuclear RNA-protein complexes in vivo with monoclonal antibodies.</a> Mol. Cell. Biol. 4 (6), 1104-11 (1984).</li>
<li>Adam, S. A., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+proteins+associated+with+mRNA+and+hnRNA+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus proteins associated with mRNA and hnRNA in infected HeLa cells.</a> J. Virol. 61 (10), 3276-3276 (1987).</li>
<li>Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1212 (2003).</li>
<li>Licatalosi, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-464 (2008).</li>
<li>Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA+code+for+the+FOX2+splicing+regulator+revealed+by+mapping+RNA-protein+interactions+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (2), 130-130 (2009).</li>
<li>Sanford, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+factor+SFRS1+recognizes+a+functionally+diverse+landscape+of+RNA+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Splicing factor SFRS1 recognizes a functionally diverse landscape of RNA transcripts.</a> Genome Res. 19 (3), 381-381 (2009).</li>
<li>Granneman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+binding+sites+on+U3+snoRNA+and+pre-rRNA+by+UV+cross-linking+and+high-throughput+analysis+of+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of protein binding sites on U3 snoRNA and pre-rRNA by UV cross-linking and high-throughput analysis of cDNAs.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. , (2009).</li>
<li>Guil, S., Caceres, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifunctional+RNA-binding+protein+hnRNP+A1+is+required+for+processing+of+miR-18a%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The multifunctional RNA-binding protein hnRNP A1 is required for processing of miR-18a.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14 (7), 591-591 (2007).</li>
<li>Chi, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute+HITS-CLIP+decodes+microRNA-mRNA+interaction+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps.</a> Nature. 460 (7254), 479-479 (2009).</li>
<li>Zisoulis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+discovery+of+endogenous+Argonaute+binding+sites+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive discovery of endogenous Argonaute binding sites in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. , (2010).</li>
<li>Hafner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. , (2010).</li>
<li>Hafner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+microRNAs+and+other+small+regulatory+RNAs+using+cDNA+library+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of microRNAs and other small regulatory RNAs using cDNA library sequencing.</a> Methods. 44 (1), 3-3 (2008).</li>
<li>Andrus, A., Kuimelis, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base+composition+analysis+of+nucleosides+using+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Nucleic+Acid+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Base composition analysis of nucleosides using HPLC.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. Chapter 10 (Unit 10.6), (2001).</li>
</ol>

TT is een mede-oprichter en wetenschappelijk adviseur van Alnylam Pharmaceuticals en een adviseur van Regulus Therapeutics.

Buffers en reagentia Groeimedium HEK293 cellen <ul><li> DMEM </li><li> 10% FBS </li><li> 2 mM L-Glutamine </li><li> 100 U / ml penicilline </li><li> 100 U / ml streptomycine </li><li> 100 ug / ml hygromycine </li><li> 15 ug / ml blasticidine </li></ul> 4-thiouridine stockoplossing (1 M) <ul><li> 260,27 mg 4-thiouridine </li><li> 1 ml DMSO </li></ul> Doxycycline voorraad (10 mg / ml) <ul><li> 10 mg doxycycline </li><li> 1 ml DMSO </li></ul> 1x NP40 lysis buffer Bereid een voorraad van 5x buffer zonder DTT en protease-remmers. Voeg DTT en protease-remmer direct voor het experiment. <ul><li> 50 mM HEPES, pH 7,5 </li><li> 150 mM KCl </li><li> 2 mM EDTA </li><li> 1 mM NaF </li><li> 0,5% (v / v) NP40 </li><li> 0,5 mM DTT </li><li> volledige EDTA-vrije proteaseremmer cocktail (Roche) </li></ul> Citraat-fosfaat buffer <ul><li> 4,7 g / l citroenzuur </li><li> 9,2 g / l Na 2 HPO 4 </li><li> pH 5,0 </li></ul> IP-wash buffer <ul><li> 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 </li><li> 300 mM KCl </li><li> 0,05% (v / v) NP40 </li><li> 0,5 mM DTT (voeg direct voor experiment) </li><li> volledige EDTA-vrije proteaseremmer cocktail (Roche) (toe te voegen direct voor experiment) </li></ul> High-zout wasbuffer <ul><li> 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 </li><li> 500 mM KCl </li><li> 0,05% (v / v) NP40 </li><li> 0,5 mM DTT (voeg vlak voor het experiment) </li><li> volledige EDTA-vrije proteaseremmer cocktail (Roche) (voeg vlak voor het experiment) </li></ul> Defosforylering buffer <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 </li><li> 100 mM NaCl </li><li> 10 mM MgCl 2 </li><li> 1 mM DTT </li></ul> Fosfatase wasbuffer <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 20 mM EGTA </li><li> 0,5% (v / v) NP40 </li></ul> Polynucleotide kinase (PNK) buffer zonder DTT <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 50 mM NaCl </li><li> 10 mM MgCl 2 </li></ul> PNK buffer <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 50 mM NaCl </li><li> 10 mM MgCl 2 </li><li> 5 mM DTT </li></ul> SDS-PAGE laadbuffer <ul><li> 10% glycerol (v / v) </li><li> 50 mM Tris-HCl, pH 6,8 </li><li> 2 mM EDTA </li><li> 2% SDS (w / v) </li><li> 100 mM DTT </li><li> 0,1% broomfenolblauw </li></ul> 2x proteïnase K-buffer <ul><li> 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 150 mM NaCl </li><li> 12,5 mM EDTA </li><li> 2% (w / v) SDS </li></ul>

par-clip - een methode om transcriptome-breed de bindingsplaatsen van rna-bindende eiwitten te identificeren

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA-transcripten worden onderworpen aan post-transcriptionele genregulatie door interactie met honderden RNA-bindende eiwitten (RBPs) en microRNA-bevattende ribonucleoproteïne complexen (miRNPs), die vaak worden uitgedrukt in een cel-type kelijk. Te weten hoe het samenspel van deze RNA-bindende factoren van invloed op de regulering van individuele transcripten, hoge resolutie kaarten van de in vivo eiwit-RNA interacties nodig zijn: 1. Een combinatie van genetische, biochemische en computationele benaderingen worden meestal toegepast op RNA-RBP-of RNA-RNP interacties vast te stellen. Microarray profilering van RNA&#39;s geassocieerd met immunopurified RBPs (RIP-Chip) 2 definieert doelen op een transcriptoom niveau, maar de toepassing ervan is beperkt tot de karakterisering van kinetisch stabiele interacties en slechts in zeldzame gevallen 3,4 maakt het mogelijk om identificatie van de RBP erkenning element (RRE ) binnen de lange doelwit RNA. Meer directe RBP doelwit site informatie wordt verkregen door het combineren van in vivo UV-crosslinking 5,6 met immunoprecipitatie 7-9, gevolgd door de isolatie van vernette RNA segmenten en cDNA sequencing (CLIP) 10. CLIP werd gebruikt om doelstellingen van een aantal RBPs 11-17 te identificeren. Echter, is CLIP beperkt door de lage efficiëntie van de UV 254 nm RNA-eiwit verknoping, en de locatie van het verknopen is niet gemakkelijk herkenbaar binnen de gesequenced verknoopt fragmenten, waardoor het moeilijk is aan UV-verknoopte doelwit RNA-segmenten los van achtergrond niet-verknoopte RNA-fragmenten ook aanwezig in het monster. We ontwikkelden een krachtige cell-based verknoping aanpak te bepalen met een hoge resolutie en transcriptoom-breed de bindingsplaatsen van cellulaire RBPs en miRNPs dat we term PAR-Clip (fotoactiveerbare-Ribonucleoside-Enhanced verknoping en Immunoprecipitatie) (zie Fig. 1A voor een overzicht van de methode). De methode is gebaseerd op de integratie van fotoreactieve ribonucleoside analogen, zoals 4-thiouridine (4-SU) en 6-thioguanosine (6-SG) in ontluikende RNA transcripten van levende cellen. Bestraling van de cellen door UV-licht van 365 nm induceert efficiënte verknoping van fotoreactief nucleoside-label cellulaire RNA&#39;s tot interactie RBPs. Immunoprecipitatie van de RBP van belang is, gevolgd door isolatie van de verknoopt en coimmunoprecipitated RNA. De geïsoleerde RNA wordt omgezet in een cDNA-bibliotheek en diepe gesequenced met behulp van Solexa technologie. Een karakteristieke eigenschap van cDNA-bibliotheken die door PAR-Clip is dat de precieze positie van de verknoping kan worden geïdentificeerd door mutaties die in de opeenvolgende cDNA. Bij gebruik van 4-SU, verknoopt sequenties thymidine aan cytidine overgang, terwijl met behulp van zes-SG resulteert in guanosine om mutaties adenosine. De aanwezigheid van de mutaties in verknoopte sequenties maakt het mogelijk om ze te scheiden van de achtergrond van de sequenties die afkomstig zijn van overvloedige cellulaire RNA&#39;s. Toepassing van de methode om een aantal verschillende RNA-bindende eiwitten werd gemeld bij Hafner et al.. 18

RNA transcripten zijn onderworpen aan een uitgebreide posttranscriptionele regulering die wordt bemiddeld door een veelheid van trans-werkende RNA-bindende eiwitten (RBPs). Hier presenteren wij een generaliseerbaar methode om te identificeren precies en op een transcriptoom schaal van de RNA-bindingsplaatsen van RBPs.

PAR-Clip - een methode om Transcriptome-breed de bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten te identificeren

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Het algemene doel van deze procedure is om de transcriptoom brede bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten of RVP's te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst fotoreactieve nucleoside-analogen te gebruiken voor in vivo labeling van nascente transcripten. De tweede stap van de procedure is het cross-linken van RNA en RNA-bindende eiwitten door 365 nanometer UV-licht.De derde stap van de procedure is het immunoprecipiteren van het onderzochte RNA-bindende eiwit en het herstellen van de cross-link naar RNA. De laatste stap van de procedure is het omzetten van de RNA in een CD NA-bibliotheek en diep sequentiëren. Het resulteert uiteindelijk in resultaten die transcriptoombrede bindingsplaatsen van de RVP's tonen en de definitie van het RNA-herkenningselement en zijn bindingsvoorkeuren mogelijk maken.Hallo, mijn naam is Marcus Hoffner van het lab van Tom SEL aan de Rockefeller University in New York. Vandaag laten we een methode zien die par lip of photoable rib nucleoside analog enhanced cross-linking en immunoprecipitation wordt genoemd. We gebruiken deze procedure in ons lab om op transcriptoomschaal bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten en hun bindingsmotieven en voorkeuren te identificeren.Oké, laten we beginnen. In vivo UV cross-linking begint in een laminar flow hood. In dit protocol zullen we gelabelde IGF two BP one cellen gebruiken als een voorbeeldmodel met behulp van steriele techniek.Breid HEK 2 93 cellen stabiel uit die flag HA gelabelde IGF two BP one tot expressie onder controle van een Tet repressor in HEK 2 93 celkweekmedium. Gebruik tussen 100 en 400 keer 10 tot de zesde cellen en kweek ze tot ongeveer 80%co fluence. Bij 14 uur vóór cross-linking hadden de cellen de fotoreactieve riboside-analoge voor thio uridine of voor SU direct in het celkweekmedium. Als alternatief kan zes th guine of zes SG worden gebruikt na toevoeging van de fotoreactieve riboside om expressie van de flag HA gelabelde IGF two BP one te induceren door toevoeging van doxycycline. De cellen worden vervolgens een nacht in een celincubator geïncubeerd.Vervolgens giet je het groeimedium af. Was de cellen vervolgens eenmaal met 10 milliliter ijskoud fosfaat gebufferd zoutwater per plaat. Verwijder vervolgens de PBS volledig door af te gieten.Plaats de onbedekte platen op een bak met ijs en bestraal ze met 365 nanometer UV-licht in een straddle linker 2, 400 UV crosslinker of equivalent. Daarna schraap je de cellen met een rubberen politieman in één milliliter PBS per plaat. Breng de cellen over in 50 milliliter centrifugeerbuizen en centrifugeer ze 5 minuten bij 500 G bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg en bewaar het cellenpellet.Op dit punt kunnen cellenpellets worden snel bevroren in vloeibare stikstof en worden bewaard bij minus 80 gedurende ten minste 12 maanden. Om door te gaan met de procedure hervat je het pellet in drie volumes van een X NP 40 lysebuffer en incubeer het op ijs gedurende 10 minuten. Klaar de cellenlysaat door centrifugeren bij 13.000 G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.Na centrifugatie, maak de lysaat verder vrij door het door een vijf micron membraan spuitfilter te filteren. Voeg vervolgens RNAs T een toe tot een eindconcentratie van één eenheid per microliter en incubeer in een waterbad bij 22 graden Celsius gedurende 15 minuten. Koel vervolgens de reactie af op ijs gedurende vijf minuten.Na in vivo UV cross-linking. Bereid de magnetische kralen voor immunoprecipitatie voor. Breng 10 microliter dyna beads protein G magnetische deeltjes per een miljoen cellysaat over naar een 1,5 milliliter micro centrifugeerbuisje.Plaats vervolgens de buis met de kralen op een magnetische standaard gedurende één tot twee minuten. Verwijder het supernatant en voeg één milliliter citraat fosfaatbuffer toe aan de buis terwijl deze op de magnetische separator staat. Dek vervolgens de buis af en vortex het monster om de kralen opnieuw op te schorten.Centrifugeer kort om eventuele kralen die in de dop van de buis achterblijven te verzamelen. Herhaal deze wassing met een extra milliliter citraat fosfaatbuffer. Na de wassing, schors de kralen en citraat fosfaatbuffer opnieuw op in een volume van twee keer het oorspronkelijke volume van de kralensuspensie.Voeg vervolgens 0,25 milligram Anti-Flag M twee monoklonaal antilichaam toe per één milliliter kralensuspensie. Incubeer de suspensie op een roterende wiel gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur. Na de incubatie, was de kralen twee keer in één milliliter citraat fosfaatbuffer zoals eerder beschreven, deze wassing dient om eventueel ongebonden antilichaam te verwijderen. Na de wassing, schors de kralen en citraat fosfaatbuffer opnieuw op zoals eerder beschreven. Om te beginnen met immunoprecipitatie, voeg de vers bereide antilichaam geconjugeerde magnetische kralen toe aan de RNAs T een behandelde cellysaat.Breng de mengsel over naar 15 milliliter centrifugeerbuizen en roter gedurende één uur bij vier graden Celsius. Na incubatie, verzamel de magnetische kralen, gooi het supernatant weg, schors de kralen opnieuw op in één milliliter IP wasbuffer en breng ze over naar 1,5 milliliter centrifugeerbuizen. Was de kralen zoals eerder beschreven twee keer in één milliliter IP wasbuffer.Na de laatste wassing, schors de kralen opnieuw op in het oorspronkelijke kralenvolume IP wasbuffer. Voeg vervolgens RNAT een toe tot een eindconcentratie van 100 eenheden per microliter. Incubeer de kralensuspensie in een waterbad van 22 graden Celsius gedurende 15 minuten.Koel vervolgens de suspensie af op ijs gedurende vijf minuten. Was vervolgens de kralen drie keer in één milliliter hoge zout wasbuffer. Schrop vervolgens de kralen opnieuw op in één oorspronkelijk kralenvolume defosforyleringsbuffer.Voeg kalfsintestinaal alkalisch fosfatase toe tot een eindconcentratie van 0,5 eenheden per microliter en incubeer de suspensie gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Was de kralen twee keer in één milliliter fosfatase wasbuffer en vervolgens nog twee keer in polynucleotidekinase of PNK buffer zonder DTT. Schrop vervolgens de kralen opnieuw op in één oorspronkelijk kralenvolume PNK buffer.</p

par-clip-method-to-identify-transcriptome-wide-binding-sites-rna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Vanwege het tijdelijke karakter van de pre-mRNA, kan het moeilijk zijn te isoleren en te...

Een snelle High-throughput Methode voor Mapping Ribonucleoproteins (RNP&#39;s) op de menselijke pre-mRNA

De ruimtelijke ordening van RNA-bindende eiwitten op een transcript is een belangrijke determinant van post-transcriptionele regulatie. Daarom ontwikkelden we de individuele-nucleotide resolutie van UV-crosslinking en immunoprecipitatie (iClip) dat precieze genoom-brede kartering van de bindingsplaatsen van een RNA-bindend eiwit maakt.

iClip - Transcriptome-breed in kaart brengen van eiwit-RNA Interacties met Individual Nucleotide resolutie

RNA-eiwitinteracties liggen aan de basis van veel cellulaire processen. Hier beschrijven we een in vivo methode om specifiek RNA te isoleren en nieuwe eiwitten te identificeren die ermee geassocieerd zijn. Dit kan nieuw licht werpen op hoe RNA's in de cel worden gereguleerd.

Novel-RNA-bindende eiwitten Isolatie door de snelle Methodologie

We beschrijven een protocol te identificeren van RNA-bindende proteÃ¯nen en kaart van de regio's hun RNA-bindende in levende cellen met behulp van UV-gemedieerde photocrosslinking en massaspectrometrie.

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Hier presenteren wij een interactief capture protocol toegepast op Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten. Deze methode berust op in vivo UV-verknoping en staat voor isolatie en identificatie van plantaardige mRNA-bindende eiwitten uit een fysiologische omgeving.

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

Een gedetailleerd protocol voor de toepassing van de klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vastleggen (CARIC) strategie ter identificatie van eiwitten bindende naar beide taalcode-instellingen en noncoding RNAs wordt gepresenteerd.

Vastleggen en identificatie van RNA-bindende proteÃ¯nen met behulp van klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vangen (CARIC) strategie

Sequentie specificiteit is essentieel voor genregulatie. Regelgevende eiwitten die specifieke sequenties herkennen zijn belangrijk voor genregulatie. Het definiëren van functionele binding sites voor dergelijke eiwitten is een uitdagend biologisch probleem. Een iteratieve benadering voor de identificatie van een bindingsplaats voor een RNA-bindend eiwit wordt hier beschreven en is toepasbaar op alle RNA-bindende eiwitten.

Sequentie ruimte verkennen om bindende sites te identificeren voor regulatoire RNA-bindende eiwitten

Hier presenteren we een eCLIP protocol om de belangrijkste RNA doelen van RBP kandidaten in testis te bepalen.

Verbeterde crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) methode voor efficiënte identificatie van proteïne-verbindend RNA in muis testis

Hier presenteren we een gewijzigd CLIP-seq protocol genaamd FbioCLIP-seq met FLAG-biotine tandem zuivering om de RNA doelen van RNA-bindende eiwitten (RBPs) in zoogdiercellen te bepalen.

Transcriptome-Wide Profilering van Protein-RNA Interacties door Cross-Linking en Immunoprecipitatie Gemedieerd door FLAG-Biotine Tandem Purification

Kinetische cross-linking en analyse van cDNA is een methode die onderzoek mogelijk maakt naar de dynamiek van eiwit-RNA interacties in levende cellen met een hoge temporele resolutie. Hier wordt het protocol in detail beschreven, inclusief de groei van gistcellen, UV-crosslinking, oogsten, eiwitzuivering en voorbereidingsstappen voor de volgende generatie sequencingbibliotheek.

Monitoring van eiwit-RNA interactiedynamica in vivo bij hoge temporele resolutie met behulp van χCRAC

Hier presenteren we een geoptimaliseerde in vitro methode om eiwitinteractoren van specifieke RNA-sequenties te ontdekken, kwantificeren en valideren, met behulp van totaal eiwitextract uit menselijke cellen, streptavidineparels bedekt met gebiotinyleerd RNA en massaspectrometrie-analyse.

Een geoptimaliseerde kwantitatieve pull-down analyse van RNA-bindende eiwitten met behulp van kort gebiotinyleerd RNA

Leer PAR-Clip om transcriptoom-brede bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten te identificeren met behulp van fotoreactieve nucleoside-analogen en UV-crosslinking. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van RNA-eiwitinteracties.

PAR-Clip - een methode om Transcriptome-breed de bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten te identificeren

Meer video's verkennen