Immunofluorescentie detectie van twee thymidine-analogen (CldU en IDU) in het jeugdwerk Tissue
7 december 2010
We hebben afgeleid van een strategie om sequentiële opname van thymidine-analogen (CldU en IDU) op te sporen in de weefsels van volwassen muizen om twee opeenvolgende rondes van celdeling te kwantificeren. Deze strategie is nuttig om de celvernieuwing van de langlevende weefsels, oncogene transformatie, of transit-amplificerende cellen te detecteren.
Hallo en welkom bij het Calor D-U-I-D-U kleuringsprotocol. Onze video begint vandaag met stap drie: rehydratie, permeatie en antigeenherstel. Begin hiermee door de coupes in de houder te plaatsen.
Zodra de coupes zijn geladen, plaatst u deze gedurende vijf minuten in een xyleenbad. Dit wordt gevolgd door een tweede xyleenbad, opnieuw voor vijf minuten.
Ga verder met het rehydrateren van uw coupes door ze te verplaatsen naar ethanoloplossingen, beginnend met een 100% oplossing en eindigend bij 50%. Voltooi vervolgens de rehydratatie van de coupes door ze vijf minuten lang in 1x PBS te plaatsen om de celmembranen te permeabiliseren. Dompel uw coupes gedurende vijf minuten onder in een 0,2% Triton X-oplossing. Bereid uw coupes voor op antigeenherstel in de magnetron door ze in een glazen beker te plaatsen met een voldoende volume 0,01 M natriumcitraatbuffer, zodanig dat de oplossing vijf centimeter boven de bovenkant van de coupes uitkomt.
Om rekening te houden met verdampingsverlies, worden de slides in de magnetron verhit totdat de oplossing kookt. Dit zou ongeveer drie tot 10 minuten duren op vol vermogen. Controleer of de slides koken.
Verlaag het vermogen van de magnetron tot tussen 10 en 80% en laat de coupes nog 20 minuten langzaam koken. Plaats na het koken het bekerglas met de coupes op een werkblad om ze ongeveer twee uur lang langzaam af te koelen tot ze kamertemperatuur hebben bereikt. Controleer of de coupes op kamertemperatuur zijn.
Dompel de objectglaasjes 40 minuten lang bij kamertemperatuur onder in 1,5 natuurlijke zoutzuur. Haal de objectglaasjes uit het zoutzuur en plaats ze vijf minuten in een 1x PBS-wasstap. Dit wordt gevolgd door een tweede 1x PBS-wasstap.
Verwijder de objectglazen uit de one XPBS-toegangsoplossing met een vloeibare blokkeerwaspen. Omcirkel elke weefselsectie en plaats het objectglas terug in de PBS. Maak een bevochtigingskamer door een nat vel keukenpapier op de bodem van een luchtdichte container te leggen.
Bereid een blokkeringsoplossing voor van 10% blokkeringsserum verdund in 1X PBS. Het is belangrijk om elke weefselcoupe volledig te bedekken met de oplossing voor weefselcoupes die gewoonlijk ongeveer 1 bij 1,5 centimeter groot zijn. Een volume van 50 µL blokkeringsoplossing is voldoende.
Bereid het primaire IDU-antilichaam voor door muizen anti-BRDU antisera te verdunnen in 5% donkeiserum. Gebruik een verdunningsfactor van 1:250. Pipetteer de primaire oplossing op elke coupesectie op de objectglaasjes.
Plaats de coupes in een koelkast bij 4 °C. Bereid voor een incubatie gedurende de nacht een wasbuffer met hoge stringentie voor. TBST is hiervoor geschikt.
Plaats de objectglazen rug-aan-rug. Plaats de objectglazen in ongeveer 35 tot 40 milliliters TBST-oplossing. Plaats de buizen in een schuddende bacteriële cultuurincubator bij 37 °C.
Laat ze 20 minuten schudden bij 225 RPM. Plaats nu uw coupes in een houder. Leg uw coupes voor een PBS-was van vijf minuten in één XPBS.
Dit gebeurt door een tweede wasbeurt met XPBS van vijf minuten. Bereid de primaire CLDU-antilichaamoplossing door rat anti-BRDU te verdunnen in 5% donkeyserum. Voeg een concentratie van 1:250 toe, leg de objectglaasjes op een papieren handdoek en markeer deze vervolgens met een waspen.
Gebruik een pipette om elke weefselsectie te bedekken met de primaire CLDU-oplossing. Gebruik ongeveer 50 µL oplossing om ervoor te zorgen dat elke weefselsectie volledig is bedekt. Plaats de objectglazen in een koelkast op 4 °C voor een incubatie gedurende de nacht.
Plaats de objectglazen in een houder en leg deze vervolgens gedurende vijf minuten in een eerste 1X PBS-wasbeurt. Plaats de objectglazen daarna gedurende vijf minuten in een tweede 1X PBS-wasbeurt. Bereid de secundaire antilichamen voor door CY2 donkey anti-RAD en PS5 donkey anti-muis antilichamen te verdunnen in 5% donkerserum. DPI zal ook worden gebruikt voor kernkleuring. Bedek de weefselcoupes volledig met de secundaire antilichamen.
50 µL van de oplossingen zouden voldoende moeten zijn om het weefsel volledig te bedekken. Plaats de rehydratatiekamer op een donkere plaats bij kamertemperatuur voor een incubatie van één uur. Plaats de coupes in een houder en was deze vervolgens één keer met XPBS gedurende vijf minuten.
Plaats de coupes voor een tweede wasbeurt in 1x PBS gedurende vijf minuten. Dep het overtollige PBS-oplossing weg op een papieren handdoek. Breng vervolgens een kleine druppel Prolong Gold anti-fade monteermedium aan op elke weefselcoupe.
Neem een dekglas en plaats dit voorzichtig bovenop uw coupes op de objectglas. Gebruik een papieren handdoek als pers om eventuele overtollige luchtbellen die tussen de coupes en het dekglas gevangen zijn geraakt, naar buiten te drukken. Gebruik tot slot een pipetpunt om eventuele resterende luchtbellen te verwijderen. Beeld uw weefsel van belang af met een fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een energiezuinige lichtbron en meerdere fluorescentiekanalen om de resultaten te kwantificeren.
Begin met het tellen van het aantal Dabi-positieve cellen. Tel het aantal CLDU-positieve cellen met behulp van de SI-tweekanaalsafbeelding. Tel het aantal IDU-positieve cellen met behulp van de SCI-vijfkanaalsafbeelding.
Tel tot slot de dubbel positief gelabelde cellen door te schakelen tussen het afbeeldingsbestand van het SCI twee-kanaal en het SCI vijf-kanaal.
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het detecteren van de sequentiële incorporatie van thymidine-analogen (CldU en IdU) in weefsels van volwassen muizen, wat kwantificering van twee opeenvolgende ronden van celdeling mogelijk maakt. Deze techniek is waardevol voor het bestuderen van celvernieuwing in langlevende weefsels, oncogene transformatie en transit-amplificerende cellen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
- Oncologie
Achtergrond
- Thymidine-analogen worden gebruikt om delende cellen te labelen.
- Inzicht in celdeling is essentieel voor het bestuderen van weefselregeneratie.
- Celvernieuwing is belangrijk in zowel de normale fysiologie als bij ziektebeelden.
- Sequentiële labeling kan inzicht bieden in de dynamiek van celpopulaties.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het kwantificeren van celdeling in weefsels.
- Het beoordelen van de implicaties van celvernieuwing in verschillende biologische contexten.
- Het verbeteren van het begrip van oncogene processen door middel van celdelingsanalyse.
Gebruikte methoden
- Sequentiële incorporatie van CldU en IdU in muisweefsels.
- Fluorescentiemicroscopie voor visualisatie van gelabelde cellen.
- Kwantificatie van DAB-, CldU- en IdU-positieve cellen.
- Gebruik van specifieke antilichamen voor detectie van thymidine-analogen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle detectie van sequentiële celdeling in weefselmonsters.
- Kwantitatieve analyse van celvernieuwingssnelheden.
- Identificatie van potentiële markers voor oncogene transformatie.
- Inzichten in het gedrag van transit-amplificerende cellen.
Conclusies
- De ontwikkelde methode biedt een robuuste benadering voor het bestuderen van celdeling.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van weefseldynamiek bij gezondheid en ziekte.
- Deze techniek kan worden toegepast op diverse onderzoeksgebieden, waaronder oncologie en regeneratieve geneeskunde.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Nauwkeurige kwantificering van sequentiële celdeling maakt mechanische risicoreductie bij targetvalidatie mogelijk door proliferatiedynamiek in ziekte-relevante systemen te verduidelijken. Deze benadering ondersteunt het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen door onderscheid te maken tussen transiënte en aanhoudende proliferatieve responsen, wat bijdraagt aan leadidentificatie en portefeuilletriage. De toepasbaarheid van de methode op langlevende weefsels verbetert de translationele biomarkerontdekking in de oncologie en regeneratieve geneeskunde.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door twee opeenvolgende ronden van celdeling in primair weefsel te meten.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk door directe visualisatie van proliferatiekinetiek in ziektemodellen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door het kwantificeren van celvernieuwingssnelheden, wat bijdraagt aan de betrouwbaarheid van het target en de modulatie van signaalpaden.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de analyse: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream evaluatie van verbindingen via gestandaardiseerde immunostaining-protocollen.
- Kwantitatieve output: Genereert meetbare aantallen DAB-, CldU- en IdU-positieve cellen voor reproduceerbare screeningseindpunten.
- Schaalbaarheid: Geoptimaliseerd voor toediening van lage doses thymidine-analogen via drinkwater, wat chronische doseringsstudies in preklinische modellen mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Toegepast om oncogene transformatie te identificeren en de bijdragen van transit-amplificerende cellen aan weefselgroei te beoordelen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug van ontdekking naar preklinische validatie door kwantitatieve proliferatiegegevens over verschillende weefseltypen te leveren.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Informeert voortgangsstrategieën door te verduidelijken of de waargenomen groei voortkomt uit stamcelactiviteit of transit-amplificerende expansie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische effectiviteit, en levert proliferatiemetrieken die go/no-go-beslissingen in elke fase ondersteunen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetests door sequentiële DNA-synthese te kwantificeren als reactie op farmacologische of genetische perturbaties.
- Screening: Levert assay-klare weefselcoupes met gestandaardiseerde detectie van thymidine-analoog-incorporatie voor compound-screening.
- Analytics: Maakt vergelijking van proliferatie-indices tussen condities mogelijk via fluorescentiekanaal-scheiding en kwantificering van dubbel-positieve cellen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt vroege discovery met preklinische validatie door celstamboomdynamiek te volgen in weefsels die relevant zijn voor menselijke ziekten.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor longitudinale proliferatiestudies over meerdere therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie door direct bewijs van de geschiedenis van celdeling te leveren.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde workflows voor permeabilisatie, antigen-retrieval en multiplex immunostaining.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicoreductie van targets op basis van proliferatieve liability.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door therapeutische effecten op stamcel- versus progenitorcelcompartimenten te onderscheiden.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in immunohistochemie en fluorescentiemicroscopie voor multiplex-detectie.
- Afhankelijk van toegang tot infrastructuur voor antigeen-reductie (magnetron, citraatbuffer) en de mogelijkheid tot sequentiële antilichaam-incubatie.
- Necessiteert cross-team standaardisatie van blokkerings-, was- en montageprotocollen om batch-effecten te minimaliseren.
- Adaptatie over verschillende modelsystemen vereist validatie van de antilichaamspecificiteit en weefselpermeabiliteit in elke context.
- Praktische beperkingen omvatten potentiële epitope-maskering en de noodzaak voor optimalisatie van doseringsschema's van analogen om toxiciteit te vermijden.
