Fabricatie van Micro-weefsels met behulp van modules van Collageen gel met cellen

Het algemene doel van deze procedure is het produceren van modulaire micro-weefsels die kunnen worden gebruikt voor experimenten in weefseltechnologie. Dit wordt bereikt door eerst de collageenoplossing met een spuit in een polyethyleenbuisje te trekken en vervolgens het collageen te laten gelleren. De tweede stap is het doorknippen van het polyethyleenbuisje in lengtes van twee millimeter om de micro-weefselmodules te vormen.

De derde stap van de procedure is het scheiden van de modules van de buisjes, en tot slot worden de modules bekleed met endotheelcellen. Uiteindelijk kunnen de resulterende micro-weefsels worden gebruikt voor in vitro cellulaire assays om de interactie van cellen via een microfluïdische kamer te bestuderen. Daarnaast kunnen de micro-weefsels worden geïmplanteerd om weefsels te genereren voor het bestuderen van de interactie en remodeling van de micro-weefsels in vivo.

Hallo, mijn naam is Brendan Long van het Sepan Lab hier aan de Universiteit van Toronto. Een groot obstakel bij het creëren van grote 3D-weefselvervangers is het gebrek aan snelle vascularisatie na implantatie. In deze video laten we u zien hoe u modulair weefsel kunt creëren dat is gecoat met endotheelcellen om deze beperking te helpen overwinnen.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Chamberlain, een post-op fellow uit het Septin-lab. De hoeveelheid collageen die geneutraliseerd moet worden, is afhankelijk van de lengte van de polyethyleenbuis. In deze demonstratie gebruiken we een polyethyleenbuis van twee meter met een binnendiameter van 0,76 millimeter en een buitendiameter van 1,22 millimeter.

Om de slang voor te bereiden, schuift u een 20 G naald in één uiteinde van de slang en plaatst u de slang vervolgens in een converter self-heal pouch voor gassterilisatie. Aangezien één milliliter collageen ongeveer twee meter polyethyleenslang vult, neutraliseren we één milliliter collageen. Plaats het collageen in een 15 milliliter conische buis en bewaar de buis op ijs.

Voeg 128 µL 10 x alpha-MEM per milliliter collageen toe aan de buis en meng dit door de oplossing herhaaldelijk te pipetteren. Let erop dat er zo min mogelijk luchtbellen ontstaan; de oplossing moet geel kleuren wanneer de alpha-MEM wordt gemengd met het aangezuurde collageen. Neutraliseer vervolgens het collageen door 0,8 M natriumbicarbonaat toe te voegen. Voor een globale schatting van de pH wordt natriumbicarbonaat toegevoegd totdat de gele collageenoplossing een lichtroze kleur krijgt.

Over het algemeen is 30 tot 60 µL per milliliter collageen nodig om een pH van 7,4 te bereiken. Om te voorkomen dat het geneutraliseerde collageen gaat gelleren, dient het op ijs te worden bewaard totdat het klaar is voor gebruik. Om de procedure voor het gelleren van het collageen te starten, brengt u de zak met de gesteriliseerde polyethyleenslang naar een biologische veiligheidskast en snijdt u het afgesloten uiteinde van de zak af, terwijl de slang in de zak blijft.

Gebruik gesteriliseerde pincetten om een spuit van drie milliliter te bevestigen aan de 20 gauge naald die eerder in één uiteinde van de slang was geplaatst. Voer het andere uiteinde van de slang in het geneutraliseerde collageen in totdat de punt zich aan de bodem van de conische buis bevindt, die op ijs wordt gehouden. Deze volgende stap moet langzaam worden uitgevoerd, anders introduceert u luchtbellen in het collageen.

Trek de zuiger van de spuit langzaam terug om het collageen in de polyethyleenbuis te trekken. Wanneer het collageen door de buis is getrokken, verwijder dan de naald van 20 gauge en plaats beide uiteinden van de buis terug in de zak. Plak de zak dicht en incubeer deze gedurende 60 minuten bij 37 °C.

Een vooraf geassembleerd snijapparaat wordt gebruikt om de buisjes door te snijden. Om deze procedure te starten, plaatst u de buisjes in een steriele tray vóór het snijapparaat en voert u de buisjes in bij de uitlaat van het apparaat; bereid een conische buis van 50 milliliter voor met 25 milliliter medium voor endotheelcellen. Om de gesneden modules op te vangen, stelt u het snijapparaat in op lengtes van twee millimeter en snijdt u vervolgens de buisjes.

Incubeer de gesneden modules in de 50 milliliter conische buis bij 37 degrees Celsius gedurende 60 minuten. Om de collageenmodules uit de buisjes te verwijderen, wordt de 50 liter conische buis met de modules op gemiddelde snelheid gevortext gedurende 10 seconden. Laat de modules vervolgens naar de bodem van de buis bezinken, wat ongeveer vijf minuten duurt.

Er vormt zich een losse pellet van modules onderin de buis, terwijl de tubing een laag bovenop het medium vormt. Nadat de modules zijn neergeslagen, gebruikt u een serologische pipette van 10 milliliter met een brede opening om ze over te brengen naar een conische buis van 15 milliliter. Vortex de conische buis van 15 milliliter en laat de modules vervolgens nog twee keer bezinken.

De bezonken modules uit de tweede en derde vortex worden ook overgebracht naar de buis van 15 milliliter. Nadat alle modules uit de buisjes zijn verwijderd en zijn samengevoegd, wordt het volume medium in de buis aangevuld tot vijf milliliter. De modules zijn nu klaar om te worden gecoat met endotheelcellen; in de volgende stap wordt getoond hoe endotheelcellen moeten worden voorbereid voor het coaten van de modules.

Verwijder eerst het medium van de cellen en was deze met PBS. Voeg na het verwijderen van de PBS drie milliliter trypsine EDTA toe en incubeer gedurende vijf minuten bij 37 °C. Resuspendeer vervolgens de cellen in zeven milliliter medium en breng deze over naar een buis van 15 milliliter.

Tel de cellen met behulp van een hemocytometer; u heeft 5 × 10⁶ endotheelcellen per milliliter gepakte modules nodig op de bodem van de conische buis. Pelleteer de cellen bij 300 G gedurende vijf minuten. Resuspendeer de celpellet in vijf milliliter endotheelcelmedium.

Voeg nu vijf milliliter medium met endotheliale cellen toe aan de modules. De modules worden samen met de endotheliale cellen geïncubeerd, zowel statisch als dynamisch; voor statische incubatie worden de modules met de endotheliale cellen door inversie gemengd en wordt de buis vervolgens 15 minuten rechtop geplaatst bij 37 °C. Na 15 minuten wordt de buis opnieuw omgekeerd en nogmaals 15 minuten geïncubeerd bij 37 °C.

Om de modules dynamisch te incuberen met de endotheelcellen, wordt de buis van 15 milliliter voorzichtig geschud bij 37 °C gedurende 60 minuten. Zodra de incubatie met de endotheelcellen voltooid is, worden de modules overgebracht naar een plaat die niet is behandeld voor weefselkweek en overnacht geïncubeerd bij 37 °C. Plaats de modules de volgende dag in een nieuwe, niet voor weefselkweek behandelde plaat met vers medium om niet-gehechte endotheelcellen te verwijderen. Incubeer de met endotheelcellen gecoate modules bij 37 °C totdat de cellen 100% van het oppervlak van de modules bedekken.

Dit duurt gewoonlijk ongeveer zeven dagen. De modules zullen er cilindrisch uitzien wanneer ze voor het eerst uit de buis worden gehaald. Als ze zijn bekleed met endotheelcellen, kunnen ze tot 50% in volume inkrimpen en een ovale vorm ontwikkelen, en kunnen ze dichter en ondoorzichtiger worden wanneer ze met lichtmicroscopie worden bekeken.

Op deze afbeeldingen worden de diameter en lengte van de modules respectievelijk aangeduid met d en l. De volgende afbeelding toont ingebedde Hep G2-cellen die op het moment van fabricage gelijkmatig over de modules zijn verdeeld. De cellen behielden een hoge levensvatbaarheid, zoals blijkt uit de groene kleur van de levende cellen.

Dode cellen zouden rood van kleur zijn wanneer de endotheelcellen confluent zijn. Op het oppervlak van de modules is er een vorming van tight junctions, wat zichtbaar is via immunofluorescentie. Kleuring van VE-cadherine en massatransportanalyse hebben aangetoond dat de modules in staat zijn om hoge celdichtheden te ondersteunen zonder de ontwikkeling van een necrotische kern door ontoereikend zuurstoftransport, wat vaak problematisch is bij grotere weefsels.

In dit voorbeeld laat massen Tri chro-kleuring van typische kleine modules zien dat de modules zeven dagen na fabricage een uniforme en hoge distributie van levende cellen behielden. In contrast hiermee was er in de kern van de grote modules een groot aantal dode cellen gevormd, waardoor slechts een dunne rand van levensvatbare cellen overbleef. Modules zijn ook geproduceerd met een mengsel van collageen en een fijne polymeer of met drug-eluting microsferen.

Wanneer h hm EC one cellen op palin collageenmodules worden geplaatst, behouden de modules hun cilindrische vorm en is er sprake van beperkte celhechtingseigenschappen in vergelijking met modules die uitsluitend uit collageen bestaan. Hier wordt een lichtmicroscoopbeeld getoond van een collageenmodule die biologisch afbreekbare microsferen op basis van PLGA bevat. Verschillende in vitro assays zijn compatibel gebleken met deze modules.

Bijvoorbeeld, in een angiogenese-assay kunnen capillair-achtige formaties op een module met endotheliale cellen gemakkelijk worden gedetecteerd en gekwantificeerd na vijf dagen incubatie met adipose-afgeleide stamcellen. In een ander voorbeeld tonen confocale microscopiebeelden van een live/dead-assay op modules levende cellen die groen zijn gekleurd en dode cellen die rood zijn gekleurd. Tot slot zijn modules ook gebruikt in microfluïdische kamers en geïmplanteerd in muizen en ratten om de interactie tussen verschillende celtypen te bestuderen en hoe de micro-weefsels worden geremodelleerd door de respons van de gastheer.

Na afloop van de procedure kunnen de modules worden gekweekt in een Petrischaal of in andere vaten, zoals een bioreactor of een microfluïdisch apparaat. Deze methode kan ook worden aangepast om verschillende weefsels te creëren door gebruik te maken van diverse combinaties van celtypen of door buisjes met een verschillende diameter te gebruiken. Bedankt voor het kijken.