Name: Fabricatie van Micro-weefsels met behulp van modules van Collageen gel met cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Leer modulaire micro-weefsels fabriceren met collageen gel-modules voor weefselengineering en celbiologie. Deze methode ondersteunt zowel in vitro als in vivo onderzoek naar celinteracties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De financiering werd verstrekt door de National Institutes of Health (EB 001013), Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada en de Canadese Institutes of Health Research. Wij danken dr. AP McGuigan voor haar expertise en te helpen in de ontwikkeling van modules.

1) Bereiding van Tubing <ol><li> Knip 2 tot 3 m lengte van polyethyleen buis (0,76 mm ID x 1,22 mm OD). </li><li> Draad een 20 G1 naald in een uiteinde van de slang. </li><li> Spoel de slang en plaats in converters een zelf-seal zakje (7 1 / 2 "x 13"). De twee uiteinden van de buizen moeten worden geplaatst aan het einde van de onverharde zak en tape op zijn plaats met gas sterilisatie tape. </li><li> Seal zak en gas te steriliseren. </li></ol> 2) neutralisatie van Collageen Let op: 1 ml van collageen vult ongeveer 2 m van polyethyleen buizen. <ol><li> Leg de benodigde hoeveelheid collageen die nodig is voor de gewenste lengte van de slang in een 15 ml conische buis en blijf op ijs. </li><li> Voeg 128 uL van 10x α-MEM per ml van collageen aan de buis en meng door herhaaldelijk pipetteren de oplossing. Let op: (1) De oplossing moet geel als de α-MEM wordt gemengd om te zetten in de aangezuurde collageen en (2) proberen te bellen minimaliseren bij het mengen. </li><li> Neutraliseer het collageen door het toevoegen van 0,8 M natriumbicarbonaat totdat het collageen heeft een pH van 7,4. Voor een algemene schatting van de pH-waarde toe te voegen natriumbicarbonaat tot de gele collageen-oplossing maakt een licht roze kleur. Opmerking: Het duurt meestal 30 tot 60 pi per elke mL van collageen. </li><li> Houden geneutraliseerd collageen op ijs totdat u ze gaat gebruiken als de geneutraliseerde collageen gel indien niet bewaard op 4 ° C. </li></ol> 3) Inbedding van cellen (optioneel) Opmerking: Afhankelijk van het celtype de cellen kan worden ingebed in een concentratie van tussen de 1 miljoen cellen per ml naar 20 miljoen cellen per ml. Gebruik het medium die nodig zijn voor de cellen die u wilt insluiten. <ol><li> Verwijder het afdrukmateriaal uit cellen en was met 5 ml PBS. </li><li> Verwijder de PBS en voeg 3 ml trypsine-EDTA. </li><li> Incubeer de cellen in trypsine-EDTA voor 5 min op 37 ° C. </li><li> Resuspendeer cellen in 7 ml media. </li><li> Tellen cellen. </li><li> Breng de benodigde aantal cellen voor het inbedden van een 15 ml conische buis. </li><li> Pellet de cellen op 300 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Aspireren media uit de cel pellet. </li><li> Resuspendeer de cellen in de geneutraliseerde collageen en te houden op het ijs. </li></ol> 4) Gelling van Collageen <ol><li> In een biologisch veiligheidskabinet afgesneden van de verzegelde einde van de zak met de polyethyleen buis. </li><li> Bevestig een 3 ml spuit aan de 20G naald in de ene uiteinde van de slang met behulp van gesteriliseerde pincet. Houd de slang in de zak. </li><li> Steek het andere uiteinde van de slang in het geneutraliseerde collageen totdat de punt is aan de onderkant van de conische buis met behulp van steriele pincet. Houd de conische buis op ijs. </li><li> Trek het collageen in de polyethyleen buizen door het terugtrekken van de zuiger van de spuit langzaam. Opmerking: Als het collageen wordt getrokken in de slang om snel te bellen dan zal vormen in het collageen. </li><li> Na het trekken van het collageen door de slang, trek de 20G naald uit buizen en weer beide uiteinden in de zak. Tape de zak dicht. </li><li> Incubeer de zak bij 37 ° C gedurende 60 minuten. Als het collageen bevat cellen dan draait u de tas over elk 15 minuten. zodat de cellen niet vestigen aan de ene kant van de module. </li></ol> 5) Het snijden van catheter met de Gegeleerde Collageen <ol><li> Autoclaaf headers en blad voor de snij-inrichting en de lade naar buizen vast te houden. </li><li> Monteer de snij-inrichting. </li><li> Plaats buis in een steriele bak voor snij-inrichting en laad de slang in het snij-apparaat. </li><li> Opzetten van een 50 ml conische buis met 25 ml van de media bij de uitlaat van de snij-inrichting om de snede modules te verzamelen. Opmerking: Gebruik media die FBS zelfs voor collageen-only modules als de modules niet los van de slang, zonder FBS in de media. Als de modules bevatten cellen gebruiken de media die nodig zijn voor de ingesloten cellen. Als er geen ingebed cellen in de modules gebruik maken van de media voor de endotheelcellen. </li><li> Stel het snij-inrichting tot 2 mm lengte van de slang snijden en de slang te snijden. </li><li> Incubeer gesneden modules bij 37 ° C gedurende 60 min in de 50 ml conische buis. </li></ol> 6) Het verwijderen van collageen Modules van Tubing <ol><li> Vortex 50 ml conische buis bevat modules in de buizen voor 10 sec. Let op: Wees voorzichtig bij het scheiden van modules ingebouwd met een hoge celdichtheid om breuk te voorkomen. </li><li> Laat modules naar de bodem van de buis. Duurt ongeveer 5 minuten. </li><li> Met behulp van een brede mond 10 ml serologische pipet overdracht de vaste modules om een ​​15 ml conische buis. </li><li> Herhaal de stappen 6,1 tot 6,3 keer. </li><li> Ga naar stap 7 te laag modules met endotheelcellen of overdracht modules om een ​​niet-weefselkweek behandeld plaat. </li></ol> 7) Coaten van de modules met endotheliale cellen <ol><li> Vestigen modules in de bodem van een 15 ml conische buis met 5 ml van media voor ee embedded cellen. </li><li> Verwijder het afdrukmateriaal uit de endotheelcellen en was met 5 ml PBS. </li><li> Verwijder de PBS en voeg 3 ml trypsine-EDTA. </li><li> Incubeer de cellen in trypsine-EDTA voor 5 min op 37 ° C. </li><li> Resuspendeer cellen in 7 ml media. </li><li> Tellen cellen. Need 5x10 6 endotheliale cellen per ml verpakt modules op de bodem van de conische buis. </li><li> Pellet de cellen op 300 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer in 5 ml endotheelcellen media. </li><li> Voeg de 5 ml van de media die endotheelcellen aan de modules. Opmerking: Dit geeft een 50:50 verhouding van de twee media types die we hebben gevonden om te werken voor de overleving en functie van beide celtypen. Test het gebruik van een co-cultuur medium geformuleerd om goed onderhoud van fenotypen van de twee cellen typen zorgen alvorens het te gebruiken. </li><li> Incubeer de modules met de endotheliale cellen zowel statisch en dynamisch. </li><li> Voor statische incubatie mix modules met endotheliale cellen door inversie en rechtop zet de buis bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Herhalen. </li><li> Dynamisch zaad van de endotheelcellen door zachtjes schommelen van de buis bij 37 ° C gedurende 60 minuten. </li><li> Tweemaal herhalen statische incubatie. </li><li> Plaats de modules in een niet-weefselkweek behandelde plaat en 's nachts bij 37 ° C. incubeer </li><li> De volgende dag plaats van de modules in een nieuwe niet-weefselkweek behandeld plaat met vers medium (50:50 mix bij gebruik van co-cultuur systeem) niet gehecht endotheliale cellen te verwijderen. </li><li> Incubeer modules die zijn gecoat met endotheliale cellen totdat ze 100% van het oppervlak van de modules. Dit duurt meestal ongeveer 7 dagen. </li></ol> 8) representatieve resultaten: De modules zal er cilindrische wanneer ze voor het eerst worden verwijderd uit de tube. Als de modules bevatten ingebedde cellen en / of zijn bedekt met endotheliale cellen kunnen ze maximaal contract tot 50% in volume en de ontwikkeling van een ovale vorm (figuur 1). De modules zal ook dichter en meer ondoorzichtig wanneer bekeken door lichtmicroscopie (figuur 1). Ook als de endotheelcellen zijn samenvloeiende op het oppervlak van de modules is er een formatie van tight junctions, die kan worden gezien door immunofluorescentiekleuring van VE-cadherine (figuur 2). Massa-overdracht analyse heeft aangetoond dat de modules zijn geschikt voor hoge dichtheden cel (8x10 7 cellen / cm 3) zonder het ontwikkelen van een necrotische kern als gevolg van onvoldoende zuurstof vervoeren, die vaak problematisch is in grotere weefsels (bv. modules van grote diameter, D = 1,4 mm) (Figuur 3). <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1: Module fabricatie en contractie. Module krimp opgetreden tijdens de drie dagen na HUVEC-C (endotheel cellijn) seeding resultaten aanzienlijk kleiner module diameter en lengte (p &lt;0,001) (A). Embedded HepG2 cellen werden gelijkmatig verdeeld binnen de modules op het moment van fabricage en behield een hoge levensvatbaarheid (B). [Live cellen groen; dode cellen red] [aangepast van Corstorphine 2010] <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2: VE-cadherine immunofluorescentie kleuring van EG-tight junctions cel 10 dagen na RAEC waar coating op het oppervlak van een module. Schaalbalk = 50 pm. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3: trichroom vlekken Masson's van typische modules (0,76 mm initiële diameter) en grote modules (1,4 mm initiële diameter) tonen het effect van zuurstof diffusie beperkingen. Zeven dagen na de fabricage, had een groot aantal dode cellen gevormd binnen de kern van de grote modules (onderste rechter paneel), waardoor er slechts een dunne rand (~ 200μm dik) van levensvatbare cellen. Omgekeerd, de kleine modules behouden een uniforme en hoge distributie van levende cellen. [Modules ingebed met HepG2 cellen en bekleed met endotheelcellen.] [Genomen uit Corstorphine 2010] <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4: (A) HMEC-1 gezaaid op poloxamine - collageen modules. Na dag 1 van het zaaien poloxamine-collageen modules behouden hun cilindrische vorm en is er beperkte celhechting eigenschappen in vergelijking met collageen alleen modules. Schaalbalk = 200 micrometer. (B) licht microscoop beeld van een collageen-module met PLGA-op basis van biologisch afbreekbaar microsferen. Schaalbalk = 500 pm. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5: Voorbeelden van in vitro testen. (A) Angiogenese test: capillaire-achtige formaties op de module gezaaid met endotheliale cellen kunnen gemakkelijk worden opgespoord en gekwantificeerd na 5 dagen incubatie met vet-afgeleide stamcellen. (B) confocale microscopie beelden van een levende / dode test op modules waar de ste handhaven voor de levende cellen is groen en voor de dode cellen is rood. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6: Collageen modules met ingesloten mesenchymale stamcellen en een oppervlaktelaag van endotheelcellen. Modules werden blootgesteld aan shear stress (~ 0,64 dyn / cm 2) voor 7 dagen in een microfluïdische kamer en beginnen te fusion zien op punten van contact. Endotheelcellen zijn gekleurd met vWF (bruin) en de mesenchymale stamcellen kernen verschijnen blauw (H &amp; E). Schaalbalk = 100 urn. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig7.jpg" alt="Figuur 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 7"> Figuur 7: Honderden collageen modules met adipose-stamcellen (ASC) en bedekt met Human microvasculaire endotheelcellen (HMEC) worden geïmplanteerd onder de huid van muizen tot ASC / HMEC interactie in vivo regeneratie voor vet toepassingen te bestuderen.

<ol><li>Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+vessel+tissue+engineering+driven+by+endothelialized+modules%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules.</a> , (2010).</li>
<li>Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+factor+and+diffusion+limitations+in+collagen+gel+modules+containing+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2010).</li>
<li>Gupta, R., Van Rooijen, N., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+endothelialized+modular+constructs+implanted+in+an+omental+pouch+in+nude+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Fate of endothelialized modular constructs implanted in an omental pouch in nude rats.</a> Tissue Eng. Part A 15, 2875-2887 (2009).</li>
<li>Leung, B. M., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+tissue+engineering+construct+containing+smooth+muscle+cells+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">A modular tissue engineering construct containing smooth muscle cells and endothelial cells.</a> Ann Biomed Eng. 35, 2039-2049 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Leung, B., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+cell-containing+gel+modules+to+assemble+modular+tissue-engineered+constructs+%5Bcorrected%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fabrication of cell-containing gel modules to assemble modular tissue-engineered constructs [corrected].</a> Nat Protoc. 1, 2963-2969 (2006).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+organoid+engineered+by+modular+assembly+enables+blood+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vascularized organoid engineered by modular assembly enables blood perfusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11461-11466 (2006).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+tissue+engineering%3A+fabrication+of+a+gelatin-based+construct%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Modular tissue engineering: fabrication of a gelatin-based construct.</a> J Tissue Eng Regen Med. 1, 136-145 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+sub-mm-sized+modules+containing+encapsulated+cells+for+modular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of sub-mm-sized modules containing encapsulated cells for modular tissue engineering.</a> Tissue Eng. 13, 1069-1078 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+criteria+for+a+modular+tissue-engineered+construct%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Design criteria for a modular tissue-engineered construct.</a> Tissue Eng. 13, 1079-1089 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thrombogenicity+of+human+umbilical+vein+endothelial+cell+seeded+collagen+modules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The thrombogenicity of human umbilical vein endothelial cell seeded collagen modules.</a> Biomaterials. 29, 2453-2463 (2008).</li>
<li>Sosnik, A., Leung, B., McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen%2Fpoloxamine+hydrogels%3A+cytocompatibility+of+embedded+HepG2+cells+and+surface-attached+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Collagen/poloxamine hydrogels: cytocompatibility of embedded HepG2 cells and surface-attached endothelial cells.</a> Tissue Eng. 11, 1807-1816 (2005).</li>
</ol>

We hebben verzonnen verschillende micro-weefsels met behulp van modules ingebed met verschillende celtypen 1-11. We hebben met succes embedded primaire cardiomyocyten, eilandjes, adipose mesenchymale stamcellen en stromale cellen evenals verschillende cellijnen waaronder HepG2, NIH 3T3 en kloon 9 levercellen. We hebben bekleed de modules met verschillende soorten endotheelcellen waaronder rat aorta endotheel-cellen, humane navelstreng endotheel cellen en humane microvasculaire endotheelcellen. Modules zijn oo...

<table><tbody><tr><td>Intramedic PE60-slang</td><td>BD Biosciences</td><td>427416</td><td>Slangen met een andere diameter kunnen worden gebruikt om de diameter van de modules te wijzigen</td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Purcol verzuurd collageen, 3 mg/mL</td><td>Cedarlane Labs</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>20G naald</td><td>BD Biosciences</td><td>305175</td><td>De diameter van de naald moet vergelijkbaar zijn met de diameter van de slang</td></tr><tr><td>3 mL spuit</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>15 mL buis</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL buis</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Convertors Self-Seal Pouch 7 1/2&amp;#8221; x 13&amp;#8221;</td><td>Cardinal Health</td><td>92713</td><td></td></tr><tr><td>10 ml serologische pipet met brede tip</td><td>BD Biosciences</td><td>357504</td><td></td></tr><tr><td>10 ml serologische pipet</td><td>BD Biosciences</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml serologische pipet</td><td>BD Biosciences</td><td>357543</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricatie van micro-weefsels met behulp van modules van collageen gel met cellen

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

Dit protocol beschrijft de fabricage van een type micro-weefsels genaamd modules. De module aanpak genereert uniform, schaalbaar en gevasculariseerd weefsel. De modules kunnen worden gemaakt van collageen en andere gelable of verknoopbare materialen. Ze zijn ongeveer 2 mm lang en 0,7 mm in diameter bij de fabricage, maar krimpen in omvang met ingesloten cellen of wanneer de modules zijn bekleed met endotheelcellen. De modules individueel zijn klein genoeg dat de ingebedde cellen binnen de diffusie limiet van zuurstof en andere voedingsstoffen, maar modules kunnen samen verpakt worden om grotere weefsels die zijn perfusable vormen. Deze weefsels zijn modulair opgebouwd, omdat verschillende celtypen kunnen worden ingebed in of gecoat op de modules voordat ze worden samen verpakt om complexe weefsels te vormen. Er zijn drie belangrijke stappen voor het maken van de modules: (1) het neutraliseren van het collageen en de inbedding in de cellen, (2) geleermiddelen het collageen in de buis en het snijden van de modules en (3) het bekleden van de modules met endotheelcellen.

Oprichting van micro-weefsels met behulp van cilindrische collageen gels, genaamd modules, die ingesloten cellen en dat het oppervlak bevatten, is bekleed met endotheelcellen.

Fabricatie van Micro-weefsels met behulp van modules van Collageen gel met cellen

Dit protocol beschrijft de fabricage van een type microweefsels genaamd modules. De modulebenadering genereert uniforme, schaalbare en gevasculariseerde ...

Het algemene doel van deze procedure is het produceren van modulaire micro-weefsels die kunnen worden gebruikt voor experimenten in weefseltechnologie. Dit wordt bereikt door eerst de collageenoplossing met een spuit in een polyethyleenbuisje te trekken en vervolgens het collageen te laten gelleren. De tweede stap is het doorknippen van het polyethyleenbuisje in lengtes van twee millimeter om de micro-weefselmodules te vormen.De derde stap van de procedure is het scheiden van de modules van de buisjes, en tot slot worden de modules bekleed met endotheelcellen. Uiteindelijk kunnen de resulterende micro-weefsels worden gebruikt voor in vitro cellulaire assays om de interactie van cellen via een microfluïdische kamer te bestuderen. Daarnaast kunnen de micro-weefsels worden geïmplanteerd om weefsels te genereren voor het bestuderen van de interactie en remodeling van de micro-weefsels in vivo.Hallo, mijn naam is Brendan Long van het Sepan Lab hier aan de Universiteit van Toronto. Een groot obstakel bij het creëren van grote 3D-weefselvervangers is het gebrek aan snelle vascularisatie na implantatie. In deze video laten we u zien hoe u modulair weefsel kunt creëren dat is gecoat met endotheelcellen om deze beperking te helpen overwinnen.De procedure zal worden gedemonstreerd door Chamberlain, een post-op fellow uit het Septin-lab. De hoeveelheid collageen die geneutraliseerd moet worden, is afhankelijk van de lengte van de polyethyleenbuis. In deze demonstratie gebruiken we een polyethyleenbuis van twee meter met een binnendiameter van 0,76 millimeter en een buitendiameter van 1,22 millimeter.Om de slang voor te bereiden, schuift u een 20 G naald in één uiteinde van de slang en plaatst u de slang vervolgens in een converter self-heal pouch voor gassterilisatie. Aangezien één milliliter collageen ongeveer twee meter polyethyleenslang vult, neutraliseren we één milliliter collageen. Plaats het collageen in een 15 milliliter conische buis en bewaar de buis op ijs.Voeg 128 µL 10 x alpha-MEM per milliliter collageen toe aan de buis en meng dit door de oplossing herhaaldelijk te pipetteren. Let erop dat er zo min mogelijk luchtbellen ontstaan; de oplossing moet geel kleuren wanneer de alpha-MEM wordt gemengd met het aangezuurde collageen. Neutraliseer vervolgens het collageen door 0,8 M natriumbicarbonaat toe te voegen. Voor een globale schatting van de pH wordt natriumbicarbonaat toegevoegd totdat de gele collageenoplossing een lichtroze kleur krijgt.Over het algemeen is 30 tot 60 µL per milliliter collageen nodig om een pH van 7,4 te bereiken. Om te voorkomen dat het geneutraliseerde collageen gaat gelleren, dient het op ijs te worden bewaard totdat het klaar is voor gebruik. Om de procedure voor het gelleren van het collageen te starten, brengt u de zak met de gesteriliseerde polyethyleenslang naar een biologische veiligheidskast en snijdt u het afgesloten uiteinde van de zak af, terwijl de slang in de zak blijft.Gebruik gesteriliseerde pincetten om een spuit van drie milliliter te bevestigen aan de 20 gauge naald die eerder in één uiteinde van de slang was geplaatst. Voer het andere uiteinde van de slang in het geneutraliseerde collageen in totdat de punt zich aan de bodem van de conische buis bevindt, die op ijs wordt gehouden. Deze volgende stap moet langzaam worden uitgevoerd, anders introduceert u luchtbellen in het collageen.Trek de zuiger van de spuit langzaam terug om het collageen in de polyethyleenbuis te trekken. Wanneer het collageen door de buis is getrokken, verwijder dan de naald van 20 gauge en plaats beide uiteinden van de buis terug in de zak. Plak de zak dicht en incubeer deze gedurende 60 minuten bij 37 °C.Een vooraf geassembleerd snijapparaat wordt gebruikt om de buisjes door te snijden. Om deze procedure te starten, plaatst u de buisjes in een steriele tray vóór het snijapparaat en voert u de buisjes in bij de uitlaat van het apparaat; bereid een conische buis van 50 milliliter voor met 25 milliliter medium voor endotheelcellen. Om de gesneden modules op te vangen, stelt u het snijapparaat in op lengtes van twee millimeter en snijdt u vervolgens de buisjes.Incubeer de gesneden modules in de 50 milliliter conische buis bij 37 degrees Celsius gedurende 60 minuten. Om de collageenmodules uit de buisjes te verwijderen, wordt de 50 liter conische buis met de modules op gemiddelde snelheid gevortext gedurende 10 seconden. Laat de modules vervolgens naar de bodem van de buis bezinken, wat ongeveer vijf minuten duurt.Er vormt zich een losse pellet van modules onderin de buis, terwijl de tubing een laag bovenop het medium vormt. Nadat de modules zijn neergeslagen, gebruikt u een serologische pipette van 10 milliliter met een brede opening om ze over te brengen naar een conische buis van 15 milliliter. Vortex de conische buis van 15 milliliter en laat de modules vervolgens nog twee keer bezinken.De bezonken modules uit de tweede en derde vortex worden ook overgebracht naar de buis van 15 milliliter. Nadat alle modules uit de buisjes zijn verwijderd en zijn samengevoegd, wordt het volume medium in de buis aangevuld tot vijf milliliter. De modules zijn nu klaar om te worden gecoat met endotheelcellen; in de volgende stap wordt getoond hoe endotheelcellen moeten worden voorbereid voor het coaten van de modules.Verwijder eerst het medium van de cellen en was deze met PBS. Voeg na het verwijderen van de PBS drie milliliter trypsine EDTA toe en incubeer gedurende vijf minuten bij 37 °C. Resuspendeer vervolgens de cellen in zeven milliliter medium en breng deze over naar een buis van 15 milliliter.Tel de cellen met behulp van een hemocytometer; u heeft 5 × 10⁶ endotheelcellen per milliliter gepakte modules nodig op de bodem van de conische buis. Pelleteer de cellen bij 300 G gedurende vijf minuten. Resuspendeer de celpellet in vijf milliliter endotheelcelmedium.Voeg nu vijf milliliter medium met endotheliale cellen toe aan de modules. De modules worden samen met de endotheliale cellen geïncubeerd, zowel statisch als dynamisch; voor statische incubatie worden de modules met de endotheliale cellen door inversie gemengd en wordt de buis vervolgens 15 minuten rechtop geplaatst bij 37 °C. Na 15 minuten wordt de buis opnieuw omgekeerd en nogmaals 15 minuten geïncubeerd bij 37 °C.Om de modules dynamisch te incuberen met de endotheelcellen, wordt de buis van 15 milliliter voorzichtig geschud bij 37 °C gedurende 60 minuten. Zodra de incubatie met de endotheelcellen voltooid is, worden de modules overgebracht naar een plaat die niet is behandeld voor weefselkweek en overnacht geïncubeerd bij 37 °C. Plaats de modules de volgende dag in een nieuwe, niet voor weefselkweek behandelde plaat met vers medium om niet-gehechte endotheelcellen te verwijderen. Incubeer de met endotheelcellen gecoate modules bij 37 °C totdat de cellen 100% van het oppervlak van de modules bedekken.Dit duurt gewoonlijk ongeveer zeven dagen. De modules zullen er cilindrisch uitzien wanneer ze voor het eerst uit de buis worden gehaald. Als ze zijn bekleed met endotheelcellen, kunnen ze tot 50% in volume inkrimpen en een ovale vorm ontwikkelen, en kunnen ze dichter en ondoorzichtiger worden wanneer ze met lichtmicroscopie worden bekeken.Op deze afbeeldingen worden de diameter en lengte van de modules respectievelijk aangeduid met d en l. De volgende afbeelding toont ingebedde Hep G2-cellen die op het moment van fabricage gelijkmatig over de modules zijn verdeeld. De cellen behielden een hoge levensvatbaarheid, zoals blijkt uit de groene kleur van de levende cellen.Dode cellen zouden rood van kleur zijn wanneer de endotheelcellen confluent zijn. Op het oppervlak van de modules is er een vorming van tight junctions, wat zichtbaar is via immunofluorescentie. Kleuring van VE-cadherine en massatransportanalyse hebben aangetoond dat de modules in staat zijn om hoge celdichtheden te ondersteunen zonder de ontwikkeling van een necrotische kern door ontoereikend zuurstoftransport, wat vaak problematisch is bij grotere weefsels.In dit voorbeeld laat massen Tri chro-kleuring van typische kleine modules zien dat de modules zeven dagen na fabricage een uniforme en hoge distributie van levende cellen behielden. In contrast hiermee was er in de kern van de grote modules een groot aantal dode cellen gevormd, waardoor slechts een dunne rand van levensvatbare cellen overbleef. Modules zijn ook geproduceerd met een mengsel van collageen en een fijne polymeer of met drug-eluting microsferen.Wanneer h hm EC one cellen op palin collageenmodules worden geplaatst, behouden de modules hun cilindrische vorm en is er sprake van beperkte celhechtingseigenschappen in vergelijking met modules die uitsluitend uit collageen bestaan. Hier wordt een lichtmicroscoopbeeld getoond van een collageenmodule die biologisch afbreekbare microsferen op basis van PLGA bevat. Verschillende in vitro assays zijn compatibel gebleken met deze modules.Bijvoorbeeld, in een angiogenese-assay kunnen capillair-achtige formaties op een module met endotheliale cellen gemakkelijk worden gedetecteerd en gekwantificeerd na vijf dagen incubatie met adipose-afgeleide stamcellen. In een ander voorbeeld tonen confocale microscopiebeelden van een live/dead-assay op modules levende cellen die groen zijn gekleurd en dode cellen die rood zijn gekleurd. Tot slot zijn modules ook gebruikt in microfluïdische kamers en geïmplanteerd in muizen en ratten om de interactie tussen verschillende celtypen te bestuderen en hoe de micro-weefsels worden geremodelleerd door de respons van de gastheer.Na afloop van de procedure kunnen de modules worden gekweekt in een Petrischaal of in andere vaten, zoals een bioreactor of een microfluïdisch apparaat. Deze methode kan ook worden aangepast om verschillende weefsels te creëren door gebruik te maken van diverse combinaties van celtypen of door buisjes met een verschillende diameter te gebruiken. Bedankt voor het kijken.

fabrication-micro-tissues-using-modules-collagen-gel-containing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Hier tonen we de fabricage van op basis van collageen, weefsel constructen die het skelet myoblasten. Deze 3-D ontworpen constructies kunnen worden gebruikt om weefsels te vervangen of...

Fabricage van myogene Engineered Tissue constructen

Een methode wordt beschreven voor de bereiding van een 3-dimensionale matrix van collageen type I en primaire humane fibroblasten. Deze organotypische gel dient als nuttige substraat invasieve celmigratie beoordelen omdat het bootst basiskenmerken van weefsel stroma en vatbaar is voor vele vormen van microscopie.

Organotypische Collageen I Assay: een Smeedbaar Platform to Cell Gedrag beoordelen in een 3-dimensionale Context

Dit model systeem gaat uit van een myofibroblast-bevolkte fibrine gel die kan worden gebruikt om endogene collageen (her) inrichting real-time op een niet-destructieve manier te bestuderen. Het modelsysteem is zeer instelbaar, als het kan worden gebruikt met verschillende bronnen van cellen, medium additieven, en kan gemakkelijk worden aangepast aan specifieke behoeften.

Techniek Fibrine-based Tissue constructen van myofibroblasten en Application of Constraints en Zeef to Cell en collageen (Re) organisatie Induce

In dit werk presenteren we een techniek voor de snelle fabricage van levend vasculair weefsel door directe cultivatie van collageen, gladde spiercellen en endotheelcellen. Daarnaast wordt een nieuw protocol beschreven voor de mechanische karakterisering van gefabriceerd vasculair weefsel.

Engineering 3D Cellularized Collageen Gel voor Vasculaire Tissue Regeneration

Weefselmanipulatie omvat vaak in vitro expansie om autologe voor weefselregeneratie creëren. Deze studie geeft een werkwijze voor weefselexpansie, regeneratie, reconstructie en in vivo werd ontwikkeld om de verwerking van cellen en biologische materialen buiten het lichaam te minimaliseren.

Gehakt Tissue in Compressed Collageen: A-cel met Biotransplant voor Single-geënsceneerde Reconstructieve Repair

De creatie van functionele microweefsels binnen microfluïdische apparaten vereist de stabilisatie van celfenotypen door traditionele celkweektechnieken aan te passen aan de beperkte ruimtelijke dimensies in microapparaten. Aanpassing van collageen maakt de laag-voor-laag afzetting van ultradunne collageenstructuren mogelijk die primaire cellen, zoals hepatocyten, kunnen stabiliseren als microfluïdische weefselmodellen.

Layer-by-layer Collageen depositie in Microfluïdische Inrichtingen voor Microtissue Stabilization

Collageen is een essentieel onderdeel van de ECM en biedt essentiële signalen verscheidene cellulaire processen gaande van migratie differentiatie en proliferatie. Er wordt hier een protocol voor het inbedden van cellen in 3D collageen hydrogels, en een meer geavanceerde techniek voor het genereren van gerandomiseerde of uitgelijnd collageen matrices gebruikt PDMS microkanalen.

Voorbereiding van de 3D Collageen Gels en Microkanalen voor de Studie van 3D-Interacties<em&gt; In Vivo</em

Dit manuscript beschrijft een zachte lithografie gebaseerde techniek uniforme arrays van driedimensionale (3D) epitheliale weefsels gedefinieerde geometrische midden van extracellulaire matrix ingenieur. Deze methode is vatbaar voor een grote verscheidenheid aan celtypen en experimentele contexten en zorgt voor high-throughput screening van identieke herhalingen.

Techniek Driedimensionale epitheelweefsels Embedded binnen extracellulaire matrix

Dit protocol beschrijft de fabricage van elastische 3D macroporeuze microcryogels door de integratie van microfabrication met cryogelation-technologie. Bij het laden met cellen, worden 3D-microtissues gegenereerd, die kan gemakkelijk ingespoten in vivo om regeneratieve therapie of geassembleerd tot arrays voor in vitro high-throughput drug screening.

3D Microtissues voor injecteerbare regeneratieve therapie en High-throughput Drug Screening

Dit protocol demonstreert het gebruik van een microfluïdisch kanaal met veranderende geometrie langs de vloeistofstroomrichting om extensieve spanning (stretching) te genereren om vezels uit te lijnen in een 3D-collageenhydrogel (&lt; 250 μm dik). De resulterende uitlijning strekt zich uit over enkele millimeters en wordt beïnvloed door de extensieve reksnelheid.

Micro-engineering 3D collageen hydrogels met lange-afstand vezeluitlijning

Het volgende protocol presenteert een op afschuiving gebaseerde extrusiemethode voor de fabricage van collageenhydrogels met fibrillen met nanoschaalpatronen, die kan worden toegepast op een breed scala aan weefselengineeringtoepassingen.

Productie van collageen met nanofibrillaire patronen voor weefselmanipulatie

Leer modulaire micro-weefsels fabriceren met collageen gel-modules voor weefselengineering en celbiologie. Deze methode ondersteunt zowel in vitro als in vivo onderzoek naar celinteracties.

Fabricatie van Micro-weefsels met behulp van modules van Collageen gel met cellen

Meer video's verkennen