Fabricatie van Micro-weefsels met behulp van modules van Collageen gel met cellen
December 13th, 2010
Oprichting van micro-weefsels met behulp van cilindrische collageen gels, genaamd modules, die ingesloten cellen en dat het oppervlak bevatten, is bekleed met endotheelcellen.
Het algemene doel van deze procedure is om modulaire microweefsels te produceren die kunnen worden gebruikt voor weefselengineeringexperimenten. Dit wordt bereikt door eerst de collageenoplossing in een polyethyleen buis te trekken, met behulp van een spuit, en vervolgens het collageen te geleren. De tweede stap is om de polyethyleenbuis in twee millimeter lange stukken te snijden om de microweefselmodules te vormen.
De derde stap van de procedure is om de modules van de buis te scheiden, en ten slotte worden de modules bedekt met endotheelcellen. Uiteindelijk kunnen de resulterende microweefsels worden gebruikt voor in vitro cellulaire assays om de interactie van cellen via een microfluïdische kamer te bestuderen. Bovendien kunnen de microweefsels worden geïmplanteerd om weefsels te genereren voor het bestuderen van de interactie en remodellering van de microweefsels in vivo.
Hallo, mijn naam is Brendan Long van het Sepan Lab hier aan de Universiteit van Toronto. Een van de grootste obstakels bij het creëren van grote 3D weefselsubstituut is een gebrek aan snelle vascularisatie na implantatie. In deze video zullen we je laten zien hoe je modulaire weefsels kunt creëren die zijn bedekt met endotheelcellen om deze beperking te overwinnen.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Chamberlain, een post-op fellow van het Septin lab. De hoeveelheid collageen die moet worden geneutraliseerd, is afhankelijk van de lengte van de polyethyleenbuis. In deze demonstratie gebruiken we een polyethyleenbuis van twee meter met een binnendiameter van 0,76 millimeter en een buitendiameter van 1,22 millimeter.
Om de buis voor te bereiden, draai een 20 G enen naald in één uiteinde van de buis en plaats vervolgens de buis in een converter zelfhelende zak voor gassterilisatie. Aangezien één milliliter collageen ongeveer twee meter polyethyleenbuis vult, zullen we één milliliter collageen neutraliseren. Plaats het collageen in een 15 milliliter conische buis en houd de buis op ijs.
Voeg 128 microliters van 10 x alfa, MEM per milliliter collageen toe aan de buis en meng door de oplossing herhaaldelijk te pipetteren. Zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan, de oplossing moet geel worden terwijl de alfa MEM in het verzuurde collageen wordt gemengd. Neutraliseer vervolgens het collageen door 0,8 molair natriumbicarbonaat toe te voegen. Voor een algemene schatting van de pH, voeg natriumbicarbonaat toe totdat de gele collageenoplossing een lichtroze kleur krijgt.
Het duurt meestal 30 tot 60 microliters per milliliter collageen om een pH van 7,4 te bereiken. Om te voorkomen dat het geneutraliseerde collageen geleert, bewaar het op ijs totdat het klaar is om te worden gebruikt. Om de procedure voor het geleren van het collageen te beginnen, neemt u de zak met de gesteriliseerde polyethyleenbuis naar een biologische veiligheidskast en snijdt u het verzegelde uiteinde van de zak af terwijl u de buis in de zak houdt.
Gebruik gesteriliseerde pincetten om een drie milliliter spuit op de 20 gauge naald te bevestigen die eerder in één uiteinde van de buis is geplaatst. Steek het andere uiteinde van de buis in het geneutraliseerde collageen totdat de punt zich op de bodem van de conische buis bevindt, die op ijs wordt gehouden. Deze volgende stap moet je langzaam doen, anders breng je luchtbellen in het collageen terecht.
Trek langzaam de zuiger van de spuit terug om het collageen in de polyethyleenbuis te trekken. Wanneer het collageen door de buis is getrokken, trekt u de 20 gauge naald eruit en legt u beide uiteinden van de buis terug in de zak. Nadat de zak is dichtgetaped, incubeer gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius.
Een voorgemonteerde snijapparatuur zal worden gebruikt om de buis te snijden. Om deze procedure te beginnen, plaats de buis in een steriele lade voor de snijapparatuur en laad de buis in de snijapparatuur bij de uitlaat van de snijapparatuur. Zet een 50 milliliter conische buis op met 25 milliliter endotheelcelmedia. Om de gesneden modules te verzamelen, zet u de snijapparatuur in om twee millimeter lange stukken buis te snijden en snijd vervolgens de buis.
Incubeer de gesneden modules in de 50 milliliter conische buis gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius. Om collageenmodules uit de buis te verwijderen, vortex, de 50 liter conische buis met de modules op gemiddelde snelheid. Laat de module gedurende 10 seconden naar de bodem van de buis zinken, wat ongeveer vijf minuten duurt.
Er zal een losse pellet van modules ontstaan op de bodem van de buis, terwijl de buis een laag op de media zal vormen. Nadat de modules zijn bezonken, gebruikt u een breedmond, 10 milliliter serologische pipet om ze over te brengen naar een 15 milliliter conische buis. Vortex, de 15 milliliter conische buis, en laat vervolgens de modules nog twee keer bezinken.
De bezonken modules van de tweede en derde vortex worden ook overgebracht naar de 15 milliliter buis. Nadat alle modules uit de buis zijn verwijderd en gepoold, brengt u het mediavolume in de buis op vijf milliliter. De modules zijn nu klaar voor het coaten met endotheelcellen, wat vervolgens zal worden getoond om endotheelcellen voor te bereiden voor het coaten van de modules.
Verwijder eerst het media van de cellen en was met PBS. Voeg na het verwijderen van de PBS drie milliliter trypsine EDTA toe en incubeer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Resus, suspendeer de cellen in zeven milliliter media en breng over naar een 15 milliliter buis.
Tel de cellen met behulp van een hemo cytometer, u heeft vijf keer 10 tot de zesde endotheelcellen per milliliter gepakte modules nodig op de bodem van de conische buis. Bezinken de cellen bij 300 G gedurende vijf minuten. Breng de celpellet opnieuw op smaak in vijf milliliter endotheelcelmedia.
Voeg nu vijf milliliter media met endotheelcellen toe aan de modules. De modules worden geïncubeerd met de endotheelcellen, zowel statisch als dynamisch voor statische incubatie, vermengde modules met endotheelcellen door omkering en zet vervolgens de buis rechtop bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Draai na 15 minuten de buis opnieuw om en incubeer bij 37 graden Celsius no
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een procedure voor het creëren van modulaire microweefsels met behulp van cilindrische collageengels ingebed met cellen. De microweefsels kunnen worden gebruikt voor verschillende weefseltechniekexperimenten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Weefseltechniek
- Celbiologie
- Microfluidica
Achtergrond
- Microweefsels zijn essentieel voor het bestuderen van cellulaire interacties.
- Collageengels bieden een ondersteunende matrix voor celgroei.
- Endotheelcellen spelen een cruciale rol bij weefselontwikkeling.
- In vitro en in vivo toepassingen worden verkend.
Doel van de studie
- Om modulaire microweefsels te produceren voor weefseltechniek.
- Om celinteracties in een gecontroleerde omgeving te bestuderen.
- Om de ontwikkeling van weefsels voor in vivo-onderzoek te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Collageenoplossing wordt in polyethyleenbuizen getrokken.
- Het collageen wordt geleerd om vaste modules te vormen.
- Modules worden gesneden in twee millimeter lengte.
- Endotheelcellen worden bedekt op het oppervlak van de modules.
Belangrijkste resultaten
- Met succes micro weefselmodules gemaakt van collageengels.
- Modules kunnen worden gebruikt voor in vitro cellulaire assays.
- Microweefsels kunnen worden geïmplanteerd voor in vivo-onderzoek.
- Faciliteert het onderzoek naar celinteracties en weefselremodellering.
Conclusies
- De procedure maakt de creatie van functionele microweefsels mogelijk.
- Deze microweefsels zijn waardevol voor zowel in vitro als in vivo onderzoek.
- Mogelijke toepassingen in regeneratieve geneeskunde en weefseltechniek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Modular micro-tissue fabrication addresses the vascularization bottleneck in 3D tissue engineering by enabling scalable, perfusable constructs with embedded or coated endothelial cells. This approach supports predictive modeling of cell-cell interactions and tissue remodeling in both in vitro and in vivo settings, reducing late-stage attrition in regenerative medicine programs. The method provides a tunable platform for de-risking therapeutic hypotheses through standardized, reproducible tissue modules.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through controlled co-culture of multiple cell types within diffusion-limited modules.
- Operational Value: Supports functional target validation by maintaining high cell viability and uniform distribution without necrotic cores.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by modeling vascularized tissue microenvironments relevant to drug response.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized micro-tissue substrates compatible with angiogenesis, live/dead, and microfluidic assays for quantitative readouts.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through uniform module dimensions and consistent endothelial coating efficiency.
- Scalability: Allows parallel preparation of hundreds of modules for high-content screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant systems for studying host-tissue interaction and remodeling post-implantation in rodent models.
- Operational Value: Bridges in vitro findings to in vivo studies using identical module batches, enhancing translational continuity.
- Risk Mitigation: Enables early assessment of vascular integration and tissue stability prior to costly preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The module fabrication process fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, supporting assay-ready tissue generation and preclinical continuity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling precise spatial arrangement of cell types to study paracrine signaling and dependency.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized tissues with quantifiable outputs such as capillary formation and viability metrics.
- Analytics: Generates measurable dependent variables including module dimensions, cell density, oxygenation status, and endothelial coverage for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects in vitro angiogenesis and microfluidic assay results to in vivo implantation outcomes, supporting risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform adaptable to various cell types, gel materials, and tubing diameters across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in tissue-level drug responses through vascularized models.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility via defined module fabrication and coating protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of vascularization failures and necrotic core formation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of leads based on tissue-level performance in perfusable, modular systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue engineering, sterile technique, and microfluidic handling.
- Depends on access to biological safety cabinets, precision cutting devices, and incubators for gelation and cell culture.
- Necessitates standardization of collagen neutralization, tubing preparation, and endothelial cell seeding density across teams.
- Involves adaptation considerations when substituting collagen with crosslinkable gels or altering tube diameters for different module sizes.
- Limited by diffusion constraints in uncoated modules and the time required to achieve full endothelial coverage (up to seven days).
