Isolation and Enrichment of Outer Membrane-Derived Extracellular Vesicles from Bacteria
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 3:53 min • September 26th, 2025
Start by inoculating a colony of genetically engineered bacteria into a liquid medium.
These bacteria express a fluorescent fusion protein in the outer membrane, an external protective layer.
Incubate for the bacteria to release extracellular vesicles (EVs), membrane-bound nanostructures involved in intercellular communication, which incorporate the fluorescent protein.
Transfer the culture into a bottle and centrifuge at low speed to pellet the cells.
Transfer the supernatant containing EVs, cellular proteins, and cell debris. Centrifuge at high speed, and remove the supernatant containing debris.
Filter the supernatant through a membrane to eliminate any remaining bacteria and debris.
Inoculate a sample on agar and incubate it. The lack of bacterial colony formation confirms the absence of bacteria.
Transfer the solution to an ultrafiltration device with a semipermeable membrane and centrifuge to trap the EVs while eliminating smaller proteins.
Collect the concentrated EVs in a tube for downstream analysis.
Begin by inoculating single colonies of Escherichia coli into 250 to 1000 milliliters of Luria-Bertani, or LB broth, using a sterile loop. Then, incubate the culture aerobically in a shaking incubator at 300 rotations per minute and 37 degrees Celsius. After 48 hours of incubation, clarify the bacterial culture medium by transferring the cell cultures to clean 500-milliliter polypropylene centrifuge bottles to centrifuge in a large-capacity, fixed-angle rotor at four degrees Celsius and 5,000 times G for 15 minutes.
Transfer the supernatant to clean centrifuge bottles by carefully pouring to centrifuge at 10,000 times G for 15 minutes. Next, transfer the supernatant to a 0.2-micron polyethersulphone vacuum-driven filter device of an appropriate size and connect the filtration device to a vacuum wall supply. If the filtration rate significantly drops, move the unfiltered material to a new device.
The filtered medium can be stored at four degrees Celsius overnight or can be further processed immediately. To check for the complete removal of the viable cells, spread an aliquot of the filtered supernatant on suitable agar plates and ensure the absence of any colonies after incubation at optimum conditions for the bacterial strain. For concentrating the filtered medium with a volume of 100 milliliters, load 90 milliliters of filtered culture medium onto the reservoir of centrifugal ultrafiltration device with a 100 kilodaltons molecular weight cutoff and centrifuge the medium in swinging bucket rotor at four degrees Celsius and 2,000 times G for 15 to 30 minute intervals until the volume of the medium in the top reservoir has been concentrated to less than 0.5 milliliters.
To top up the reservoir with any remaining filtered culture medium, remove the flow-through in the bottom of the device to rebalance. If the viscosity of the concentrated medium in the reservoir is visibly increased, dilute the medium with PBS and reconcentrate by centrifugation to reduce any non-extracellular vesicle, or EV proteins, smaller than the molecular weight cutoff of 100 kilodaltons. Then, transfer the concentrated medium to a low-protein binding tube to store at four degrees Celsius overnight.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het isoleren van extracellulaire blaasjes (EV's) uit genetisch gemodificeerde bacteriën die een fluorescent fusie-eiwit tot expressie brengen. Het proces omvat verschillende centrifugatie- en filtratiestappen om de verwijdering van levensvatbare cellen te garanderen en de EV's te concentreren voor verdere analyse.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Microbiologie
- Celbiologie
- Biotechnologie
Achtergrond
- Extracellulaire blaasjes spelen een cruciale rol bij de intercellulaire communicatie.
- Genetisch gemodificeerde bacteriën kunnen worden gebruikt voor de productie van fluorescerende eiwitten.
- De isolatie van EV's is essentieel voor het bestuderen van hun functies en toepassingen.
- Standaardmethoden omvatten centrifugatie- en filtratietechnieken.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het isoleren van EV's uit bacteriële culturen.
- Het waarborgen van de verwijdering van levensvatbare bacteriën tijdens het isolatieproces.
- Het concentreren van EV's voor verdere analyse.
Gebruikte methoden
- Inoculatie van genetisch gemodificeerde bacteriën in vloeibaar medium.
- Incubatie om de afgifte van EV's mogelijk te maken.
- Centrifugatie om cellen en debris van het supernatant te scheiden.
- Filtratie om resterende bacteriën te verwijderen en EV's te concentreren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van EV's bevestigd door de afwezigheid van bacteriële koloniën.
- Concentratie van EV's bereikt middels ultrafiltratietechnieken.
- Fluorescerende eiwitten geïncorporeerd in EV's zijn geverifieerd.
- Methode demonstreerde efficiëntie bij het verwerken van grote volumes kweekmedium.
Conclusies
- De beschreven methode is effectief voor het isoleren van EV's uit bacteriële culturen.
- Het waarborgt de verwijdering van levensvatbare cellen, waardoor het geschikt is voor downstream-applicaties.
- Het biedt een basis voor verdere studies naar de functies en toepassingen van EV's.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
De isolatie van bacteriële extracellulaire blaasjes (EV's) maakt mechanische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase mogelijk door een schaalbare bron van membraan-afgeleide nanodeeltjes te bieden voor target-validatie en fenotypische screening. De methode ondersteunt de ontwikkeling van assays door gestandaardiseerde, reproduceerbare EV-verrijking, waardoor de variabiliteit in downstream functionele analyses wordt verminderd. Dit positioneert de techniek als een translationeel instrument voor het evalueren van therapeutica of vaccinkandidaten van bacteriële oorsprong met een verbeterde voorspellende betrouwbaarheid.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar uit bacteriële membranen afgeleide blaasjes als potentiële immunomodulerende agentia of systemen voor antigeenafgifte.
- Operationele waarde: Biedt een consistente EV-bron voor functionele screening van gastheer-pathogeeninteracties.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door het isoleren van EV's met gedefinieerde oppervlaktemarkers voor studies naar target engagement.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gestandaardiseerde EV-preparaten voor high-throughput screening van bacteriële blaasjesopname of immuunactivatie.
- Operationele waarde: Garandeert de verwijdering van levensvatbare cellen en debris, wat de specificiteit van de assay verbetert en foutpositieve signalen vermindert.
- Schaalbaarheid: Concentratie via ultrafiltratie maakt het mogelijk om grote cultuurvolumes te verwerken, zodat deze gereed zijn voor screeningcampagnes.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Translationele continuïteit: Geconcentreerde EV's behouden fluorescente markering voor het volgen van de biodistributie in preklinische modellen.
- Mechanistische risicoreductie: Geïsoleerde EV's maken evaluatie van door bacteriële blaasjes gemedieerde pathways mogelijk zonder storende effecten van levende bacteriën.
- Relevantie voor preklinische modellen: Ondersteunt dosis-responsanalyses in infectie- of inflammatiemodellen met behulp van gestandaardiseerde EV-inputs.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot leadidentificatie, waarbij bacteriële EV's dienen als mechanistische probes of transportvoertuigen. Het maakt screeningworkflows mogelijk door gezuiverde, kwantificeerbare EV-fracties te leveren voor functionele readouts. Het proces ondersteunt analyses via fluorescente of biochemische detectie van verrijkte EV's, wat comparatieve analyse tussen verschillende condities faciliteert. Hergebruik op bedrijfsniveau wordt ondersteund door de schaalbaarheid van het protocol en de standaardisatie over verschillende bacteriële stammen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten over de rol van bacteriële blaasjes bij intercellulaire signalering en immuunmodulatie.
- Screening: Levert debrisvrije EV-preparaten voor betrouwbare screening van verbindingen of genotypen.
- Analytiek: Maakt kwantitatieve meting van de EV-opbrengst en het fluorescentiesignaal voor normalisatie mogelijk.
- Translationeel onderzoek: Verbindt EV-isolatie met de preklinische evaluatie van therapeutica op basis van bacteriële blaasjes.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor EV-productie over meerdere projecten voor bacteriële engineering.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van het target door bacteriële contaminatie in EV-preparaten te elimineren.
- Operationele waarde: Standaardiseert isolatie via sequentiële centrifugatie en filtratie, wat de consistentie tussen batches verbetert.
- Strategische waarde: Vermindert fout-positieve screeningsresultaten, waardoor de efficiëntie van go/no-go-beslissingen in de vroege ontdekkingsfase wordt verbeterd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten op basis van bacteriële blaasjes mogelijk door reproduceerbare EV-winning.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de omgang met bacteriële culturen en aseptische technieken om de integriteit van EV's te waarborgen.
- Afhankelijk van toegang tot centrifuges die 5,000×g en 10,000×g kunnen bereiken, vacuümfiltratie-units en ultrafiltratie-apparaten met een 100 kDa cutoff.
- Vraagt om standaardisatie van de filtratie- en ultrafiltratiestappen tussen teams om een consistente recovery van EV's te garanderen.
- Overwegingen voor adaptatie omvatten het aanpassen van centrifugatietijden of filtergroottes voor verschillende bacteriële soorten of EV-groottes.
- Praktische beperking: de opbrengst aan EV's kan variëren afhankelijk van de bacteriële groeifase en inductie-efficiëntie, wat optimalisatie per stam vereist.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Isolatie en karakterisering van extracellulaire vesicles geproduceerd door ijzer-beperkte mycobacteriën
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Grootte uitsluiting chromatografie om bacteriële buitenste membraanblaasje heterogeniteit te analyseren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie en karakterisering van cyanobacteriële extracellulaire blaasjes
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolation of Siderophore-Containing Extracellular Vesicles from Mycobacterium tuberculosis
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolation of Bacterial Extracellular Vesicles Using Size-Exclusion Chromatography
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Separation and Enrichment of Extracellular Vesicles in the Presence of Virions
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Size Exclusion Chromatography Based Separation of Bacterial Extracellular Vesicles: A Technique to Separate Heterogenous Population of Gram-Negative Bacterial Outer Membrane Vesicles Based on Their Size
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Zuivering van extracellulaire vesikel preparaten met hoge opbrengst uit de buurt van het virus
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Mycobacterium tuberculose Extracellulaire vesikelverrijking door grootte-uitsluitingschromatografie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026