Isolatie en karakterisering van cyanobacteriële extracellulaire blaasjes

Dit protocol is belangrijk omdat het niet alleen benaderingen demonstreert voor het zuiveren van blaasjes uit cultuur op verschillende schalen, afwegingen, verschillen tussen methodologieën en ook aandacht voor het werken met veldmonsters. Cyanobacteriën bieden unieke uitdagingen voor het bemonsteren en analyseren van blaasjes. Deze technieken hebben met succes blaasjes geïsoleerd en geconcentreerd uit cultuur en uit omgevingsmonsters.

Om monsters van minder dan 500 milliliter te concentreren, begint u met het spoelen van de 15 tot 20 milliliter ultrafiltratie centrifugaalconcentrators met type 1 ultrapure grade water. Laad de concentrators in de centrifuge en draai bij 4.400 x g bij vier graden Celsius. Gooi de doorloop weg en herhaal de stap minstens twee keer.

Laad het bovennatuurlijke monster in een in water gespoelde concentrator en draai onder dezelfde omstandigheden. Herhaal deze stap totdat het monster is geconcentreerd tot een eindvolume van 15 tot 30 milliliter. Om een volume van meer dan 500 milliliter te concentreren, voert u tangentiële stromingsfiltratie uit door het apparaat in te stellen zoals beschreven in het manuscript.

Bevestig een peristaltische pomp aan de inlaatleiding en plaats verstelbare klemmen op de retentaatlijn. Ontsmet de tangentiële stromingsfiltratie zoals beschreven in het manuscript en spoel het apparaat vervolgens door met een liter type 1 ultrapuur water. Voeg minder dan 0,2 micron filtraat toe aan het monsterreservoir.

Verhoog langzaam de pompsnelheid en tegendrukniveaus op de retentaatleiding om de output van de filtraatleidingen te verhogen. Blijf de tangentiële stromingsfiltratie uitvoeren en vul het reservoir opnieuw met cultuursupernatant terwijl het materiaal wordt verwijderd. Stop met het concentreren van het monster zodra het volume in het reservoir de laagst mogelijke hoeveelheid bereikt die nodig is om de stroom in de inlaatleiding te behouden zonder luchtbellen in te brengen.

Sluit de uitstroomlijn met een klem. Verwijder de tegendruk op de retentate lijn. Recirculeer het geconcentreerde supernatant gedurende 10 minuten door het filter, waardoor de recirculatiesnelheid wordt verlaagd van 20 tot 40 milliliter per minuut om het herstel te maximaliseren.

Verplaats de retentaatlijn in een schoon vat, verwijder de inlaatleiding uit het monster en verzamel het geconcentreerde materiaal. Win eventueel achtergebleven materiaal in het monsterreservoir terug met behulp van een pipet. Filtreer het geconcentreerde supernatant door een spuitfilter van 0,2 micron.

Bewaar indien nodig het laatste concentraat ongeveer drie weken bij vier graden Celsius voordat u overgaat op blaasjeszuivering. Om het geconcentreerde kweekmonster te pelleteren, plaatst u het in een schone ultracentrifugebuis en voegt u schone media of buffer toe om ervoor te zorgen dat de buis wordt gevuld. Verwijder na het centrifugeren het supernatant met een pipet.

Was het gepelletiseerde materiaal opnieuw met verse kweekmedia of wasbuffer, zoals 1X fosfaat-gebufferde zoutoplossing en herhaal de centrifugatie. Resuspenseer de uiteindelijke pellet in verse cultuur door voorzichtig te pipetteren met een pipet van één milliliter en breng deze over in een schoon vat. Om dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie uit te voeren, bereidt u iodixanol-aandelen zoals beschreven in het manuscript.

Meng een deel van de 4X-buffer met drie delen van 60% iodixanol-bouillon om een 45% iodixanol-oplossing te maken. Verdun 45% iodixanol met 1X buffer om voorraden gradiëntmedia van 40, 35, 30, 25, 20, 15 en 10% uiteindelijke iodixanolconcentraties te creëren. Leg vervolgens zorgvuldig gelijke hoeveelheden van al deze iodixanol-gradiëntvoorraden in een ultracentrifugebuis, waarbij het volledige buisvolume wordt gebruikt.

Verzamel na het centrifugeren de fracties van elk 0,5 milliliter voor een gradiënt van ongeveer 4,5 milliliter door zorgvuldig te pipetteren of een fractiecollector te gebruiken. Bepaal de dichtheid van elke fractie, in gram per milliliter, met behulp van een analytische balans en gekalibreerde pipet. Verwijder het monster uit de buis, bepaal het gewicht en breng het monster terug naar de buis.

Verdun afzonderlijke fracties met een schone buffer in een nieuwe buis, gevolgd door een schone media- of bufferwas. Breng voorzichtig vijf microliter blaasjes aan en laat het vijf minuten zitten. Verwijder het monster door de rand van een raster aan te raken op een stuk schoon filtreerpapier.

Pipetteer 20 tot 50 microliter 2% uranylacetaat op een plat oppervlak bedekt met plastic film. Plaats vervolgens het rooster er twee minuten op drijvend. Verwijder uranylacetaat met filterpapier en drijf kort op een druppel ultrapuur water om te wassen.

Vul de kamer met ultrapuur water met een schone spuit en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Klik op start camera'en visualiseer het optimale gebied van de kamer rond de vingerafdruk. Schuif de schuifregelaars van de schermversterking en het cameraniveau naar het maximum en verlaag vervolgens naar het laagste niveau om de zwakste deeltjes te zien.

Pas de focus indien nodig aan om ervoor te zorgen dat deeltjes ongeveer even zichtbaar zijn over het gezichtsveld en blijf wassen met ultraschoon water totdat de kamer schoon is. Voeg het blaasjemonster toe aan de kamer met een spuit van één milliliter en bevestig de acquisitie-instellingen. Selecteer standaardmeting'in de Vervolgkeuzelijst SOP en wijzig de instellingen om ten minste drie technische replica's van elk 60 seconden video's te verzamelen.

Druk op create 'and run script' en volg de aanwijzingen en duw ongeveer 100 microliter monster in de kamer tussen de replicaties. Bepaal de deeltjesparameters door op analyse 'en open experiment' te klikken en het monsterbestand te laden. Selecteer geselecteerde bestanden verwerken' en wacht tot de analyse is voltooid.

De isolatie en karakterisering van extracellulaire blaasjes van de cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803, toonde aan dat het buitenmembraan carotinoïden bevat, die een karakteristieke oranje kleuring verlenen aan blaasjesmonsters verzameld door directe pelleting door ultracentrifugatie. De geresuspendeerde blaasjeskorrel werd onderzocht door transmissie-elektronenmicroscopie door monsters negatief te kleuren met uranylacetaat of door ultradunne secties te observeren.

De grootteverdeling en -concentratie van vesikels werden beoordeeld met behulp van dynamische lichtverstrooiing en nanodeeltjesvolganalyses. Gezuiverde Synechocystis sp. PCC6803 blaasjes werden gescheiden op een natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegel en gekleurd voor lipopolysacchariden.

Monsters moeten voor en na het geconcentreerde blaasjesmonster worden genomen om ervoor te zorgen dat de tangentiële stroomfiltratie werkt en de blaasjes geconcentreerd raken. Vervolgens moet u beide monsters meten met behulp van de nanodeeltjesvolganalyse. Toekomstige inspanningen zijn nodig om deze methode samen te voegen met andere benaderingen zoals de grootte-uitsluitingschromatografie of asymmetrische veldstroomfractionering om de discriminatie en isolatie van kleine deeltjes uit cultuur- en milieumonsters te verbeteren.

Deze techniek is nuttig om de cyanobacteriën blaasjes en de specifieke functionele rollen van deze blaasjes in cyanobacteriële biologie te bestuderen.