Bepaling van de moleculaire structuren van HIV envelop glycoproteïnen met behulp van Cryo-electron tomography en geautomatiseerde Sub-tomogram Middeling

Meer dan 60 miljoen mensen zijn besmet met HIV, het virus dat aids veroorzaakt. HIV AIDS is een wereldwijde gezondheidscrisis en hoewel intensieve onderzoeksinspanningen de levens van geïnfecteerde personen aanzienlijk hebben verlengd, blijft een echte vaccin nog steeds ongrijpbaar. Een belangrijk onderdeel van het onderzoek naar een HIV-vaccin is het envelop glycoproteïne, dat HIV gebruikt om doelcellen binnen te dringen.

In deze video laten we zien hoe we structuren van dit belangrijke eiwit verkrijgen met behulp van een beeldvormingstechniek genaamd cryo-elektron tomografie. Beginnend met gezuiverd HIV, laten we stappen zien bij de voorbereiding van bevroren monsters, stappen bij het opnemen van elektronenmicroscopische beelden van deze bevroren monsters en stappen bij het omzetten van deze beelden in structurele modellen die nuttig kunnen zijn voor de ontwerp van een hiv aids vaccin. Een uniek aspect van wat we in deze video presenteren, is dat het werk zal worden gedemonstreerd door leden van haar laboratorium, variërend van middelbare scholieren tot studenten op bachelor- en masterniveau en allemaal tot postdoctorale fellows en senior wetenschappers.

De voorbereiding van verglaasde virusmonsters geschikt voor cryo-elektron tomografie wordt bereikt door een waterige suspensie van virussen te verspreiden over kleine gaatjes in een koolstoffilm die wordt ondersteund door een koperrooster, en vervolgens de virussen snel in te vriezen. Het doel van deze stap is om een bevroren monster van intacte virussen te bereiden die in een bijna natuurlijke staat zijn vastgelegd. Om te beginnen worden de roosters in een eenheid met een gloeiontlading geplaatst.

Dit apparaat reinigt de roosters door ze bloot te stellen aan geïoniseerd gas. Nu de roosters klaar zijn voor gebruik, wordt een suspensie van virussen gemengd met kleine gouddeeltjes bereid. Deze deeltjes zijn essentieel voor gegevensverzameling en -verwerking.

Vervolgens wordt een druppel virussuspensie op het vers geplasma-gereinigde rooster geplaatst. Het rooster wordt vervolgens in een robot geladen, die het met filterpapier afveegt, waardoor de druppel wordt gereduceerd tot een dunne vloeistofsfilm. Het monster wordt vervolgens in vloeibaar ethaan gedompeld, dat de virussen snel bevriest met een snelheid van meer dan 100.000 kelvin per seconde.

Het gedompelde verglaasde rooster wordt vervolgens overgebracht naar een opslagdoos voor transport naar de microscoop. Dit wordt herhaald totdat het gewenste aantal roosters is bevroren. Nu de virusmonsterroosters klaar zijn, is de volgende stap om ze in de microscoop te laden.

Voor beeldvorming kan dit handmatig of met robotische assistentie worden gedaan. Wanneer de monsterroosters handmatig worden geladen, zit de gebruiker aan een gespecialiseerd station waar de monsters onder vloeibare stikstof kunnen worden gemanipuleerd, worden de monsters in een draagbare met stikstof gekoelde kamer geplaatst die wordt verzegeld, geëvacueerd en vervolgens aan de microscoop wordt bevestigd. Nieuwere microscopen zijn in staat tot meer geautomatiseerde monsterlading.

Hier in een Titan Cryos-microscoop worden bevroren monsters door de gebruiker naar de microscoop gebracht en vervolgens robotisch geladen met de monsterroosters die in de microscoop zijn geladen. Elke rooster kan door de gebruiker worden onderzocht voordat de beeldvorming kan beginnen. De microscoopparameters worden ingesteld voor elk gebied op het monsterrooster dat kenmerken van belang heeft.

In dit geval zijn de kenmerken HIV-virussen. Telkens wanneer een nieuw gebied wordt gedefinieerd, slaat de microscoopcomputer de gebiedsspecifieke beeldvormingsparameters op. Wanneer de gebruiker alle interessante posities heeft gedefinieerd, bezoekt de computer elke positie automatisch opnieuw en verzamelt een dataset.

Elke dataset wordt verzameld door de monsterrooster ten opzichte van de elektronenbundel te kantelen, terwijl ervoor wordt gezorgd dat de bundel op dezelfde plek op de rooster blijft scherp. Gegevensverzameling in elektronenmicroscopie vereiste traditioneel dat gebruikers bij de microscoop zaten en fysiek interacteerden met de apparatuur. Deze stijl van microscoopinteractie wordt hier getoond tijdens een bezoek van president Obama aan een intel-fabriek.

Recente vorderingen in microscoopcomputerinterfaces stellen gebruikers nu in staat om de gegevensverzameling in realtime te monitoren en aan te passen vanaf een externe computer in het laboratorium of elders. Om de vormen van de envelop te visualiseren, moet de informatie van honderden afzonderlijke beelden worden gemiddeld om het signaal te versterken. Dit is een rekenintensief proces, dat hier wordt bereikt door gebruik te maken van een cluster computers genaamd Bio Wolf.

Gelegen in het NIH, zijn krachtige methoden ontwikkeld om individuele volumes te extraheren en de informatie te gemiddelen met behulp van algoritmen die kunnen werken op de hoge ruisniveaus. Intrinsiek aan dit type gegevens, leveren de dichtheidskarten die zijn verkregen van zowel inheemse virussen als virussen die complex zijn voor biologisch belangrijke moleculen, een rijke database van informatie over de structurele biologie van HIV. De dichtheidskarten komen tot leven op moleculair detail wanneer de gegevens worden gecombineerd met informatie van röntgenkristallografie van de afzonderlijke subeenheden die het envelop glycoproteïen spike vormen.

Gegevens die uit deze tomo's komen, kunnen erg dicht en uitdagend zijn om te interpreteren. 3D-software voor de entertainmentindustrie kan worden gebruikt om de 3D-modellen te visualiseren door kleuren, texturen en verlichting toe te voegen, waardoor ze gemakkelijker te analyseren zijn. Veelgebruikte visualisatiesoftware omvat Mirror 3D Studio Max en Maya.

We hebben zojuist stapsgewijze procedures gedemonstreerd voor het verkrijgen van moleculaire modellen voor de structuur van het envelop. Glycoproteïne, beginnend met gezuiverd HIV. Met behulp van deze methode hebben we ook structuren bepaald voor het envelop glycoproteïne in complex met een verscheidenheid aan moleculen die zich aan het virus kunnen binden en het kunnen gebruiken.

Hier laten we een voorbeeld zien van de structuur van het envelop glycoproteïne in complex met een antilichaam genaamd B12. Begrijpen waarom sommige moleculen zich aan het virus kunnen binden en het kunnen gebruiken terwijl andere dat niet doen, is erg belangrijk voor rationeel vaccinontwerp. Het bepalen van moleculaire structuren van envelop glycoproteïnen van HIV of van andere virussen, zoals influenza en Ebola, is de sleutel tot het begrijpen van virale binnenkomst