Het kwantificeren van de Frequentie van Tumor voortplantende cellen met behulp van beperkte verdunning Cell Transplantation in syngene zebravis

De bepaling van de beperkende verdunning voor celtransplantatie is de gouden standaard voor het beoordelen van het potentieel voor zelfvernieuwing in experimentele diermodellen. In deze demonstratie worden syngeneïsche zeebrasembevruchte eitjes in één celstadium geïnjecteerd met rag twee MIC en RAG twee GFP om transgene zeebrasen te creëren die een fluorescent gelabelde T-cel acute lymfatische leukemie zullen ontwikkelen. Na 60 levensdagen worden de primaire leukemiecellen uit zeebrasen geïsoleerd en vervolgens gezuiverd met behulp van fluorescentie geactiveerde celsortering.

Vervolgens worden de cellen bij beperkende verdunning getransplanteerd in de buikholte van volwassen zeebrasen, en worden de vissen gedurende maximaal 90 dagen gemonitord op tumorgroei. Ten slotte wordt het extreme beperkende verdunningsanalyse statistische softwareprogramma gebruikt om de frequentie van leukemie-propagerende cellen binnen de oorspronkelijke tumor te kwantificeren. Bepaling van de beperkende verdunning voor celtransplantatie maakt het mogelijk voor onderzoekers om nauwkeurig de hoeveelheid zelfvernieuwende cellen te bepalen die zich in de tumormassa bevinden.

Het zijn deze zelfvernieuwende cellen die de kankervorming aansturen en uiteindelijk verantwoordelijk zijn voor recidief. Het grote voordeel van het uitvoeren van bepaling van de beperkende verdunning voor celtransplantatie in het zeebrasmodel is dat veel vissen voor elk experiment kunnen worden getransplanteerd, wat resulteert in een betere precisie bij het bepalen van de frequentie van zelfvernieuwende tumorpropagerende cellen. Deze methode geeft inzicht in tumorpropagerende cellen bij T-cel acute lymfatische leukemie.

Het kan ook worden toegepast om andere zeebraskankermodellen te begrijpen. Jessica Blackburn, een collega in het lab en Sally Liu, een getalenteerde technicus, zullen de procedure voor u demonstreren vandaag Om Rag twee CM en RAG twee G-F-P-D-N-A Constructs lineair te maken, verteer 10 microgram van elk plasmide met restrictie-enzym, niet één bij 37 graden Celsius gedurende de nacht. Na fenyl chloroform extractie en ethanol precipitatie, suspenderen we elk plasmide in 20 microliter water.

Bepaal de DNA-concentraties op een 1% agro gel door een een-op-een, een-op-vijf en een-op-tien verdunning van elk verteerd plasmide met 20 microliter, 10 microliter en vijf microliter van een hoog bereik DNA ladder te laten lopen. Verdun nu het DNA tot een eindconcentratie van 60 nanogram per microliter voor injectie in CG een stam syngen. Injecteer 250 nanoliter van 30 nanogram per microliter rag twee CM en 30 nanogram per microliter in een celstadium zeebrasembevruchte eitje.

Rag twee GFP in één celstadium zeebrasembevruchte eitjes door DNA zorgvuldig direct in de cel te targeten en niet in de dooier. Bewaar de geïnjecteerde embryo's bij 28,5 graden Celsius en verwijder de dode embryo's na 24 uur bij vijf dagen leven, breng dieren over naar grote tanks ongeveer 28 dagen na injectie. Anesthetiseer larvale zeebrasen door 200 microliter van vier nanogram per milliliter trica S toe te voegen aan 25 milliliter vissensysteemwater in een petrischaal.

Onderzoek de larven op ontwikkeling van fluorescent gelabelde TALL door een epifluorescentiemicroscoop te gebruiken om GFP-fluorescentie te detecteren. Scheid tumorpositieve larven van diegenen die negatief zijn om ervoor te zorgen dat er geen leukemieuze vissen worden gemist in de analyse. Negatieve larven kunnen op een later tijdstip worden onderzocht wanneer tumoren mogelijk groter zijn geworden. Monitor fluorescent gelabelde leukemieuze vissen minstens één keer per week met behulp van de epifluorescentiemicroscoop om tumorgroei bij te houden.

Wanneer GFP positieve leukemiecellen meer dan 50%van het dier hebben overgenomen, voeg een milliliter van vier nanogram per milliliter. Trica S toe in een petrischaal met negen milliliter vissensysteemwater om de vissen op te offeren, plaats de vissen in een nieuwe petrischaal met één milliliter van 5% foetaal bovien serum in 0,9 XPBS, macèreer de vissen met een scheermes, pipet de mixtuur om grote celklompjes te scheiden. Laat vervolgens de cellen door een 40 micrometer gaaszeef in een 50 milliliter buis passeren.

Pipet 500 microliter van de cellen in een vier milliliter polystyreen buis. Voeg één microliter van één milligram per milliliter, peridium jodide toe om dode cellen te labelen, voorzichtig mengen, houd de cellen op ijs. Bereid ook een wild type CG een vis voor om normale bloedcellen te verzamelen, die dienen als drager voor de tumorcellen tijdens transplantatie bij vier milliliter van 5%FPS in 0,9 X PB S in de 50 milliliter buis voor een totaal volume van vijf milliliter.

Tel de normale bloedcellen, verdun tot drie keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter in 5%FBS in 0,9 x pbs, pipet vervolgens 100 microliter per putje van een 96-putjesplaat met behulp van een fluorescentie geactiveerde celsorteerder. Sorteer GFP positieve PI negatieve tumorcellen in de 96-putjesplaat met bloedcellen bij aangegeven doses. Sorteer daarnaast 10.000 cellen in een putje zonder normale bloedcellen en heranalyseer met behulp van FACS om de zuiverheid en levensvatbaarheid van de gesorteerd cellen te beoordelen. Centrifugeer de 96-putjesplaat bij 2000 Gs gedurende 10 minuten om de cellen te pelletten.

Verwijder 95 microliter van de snuit en suspendeer de cellen in de resterende vijf microliter. Injecteer de celsuspensie in de buikholte van volwassen syngeneïsche zeebrasen van meer dan 60 dagen oud met behulp van een 26 en een halve gauge microspuiten. Zeebrasen hoeven niet te worden verdoofd voorafgaand aan transplantatie.

Transplanteer 45 vissen met 10 leukemiecellen, 20 vissen met 100 cellen, zeven vissen met 1000 cellen en vijf vissen met 10.000 TALL cellen ongeveer 28 dagen na transplantatie. Onderzoek de ontvangende zeebrasen met een epifluorescentiemicroscoop met een 4 85 20 excitatiegolflengte en 5 30 25 emissiefilter. Om GFP-fluorescentie te detecteren.

Noteer het aantal positieve vissen per totaal aantal geïnjecteerde vissen. Onderzoek de