Name: De voorbereiding van Quality Inositol pyro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Leer de productie en isolatie van inositolpyrofosfaten zoals IP7 via enzymatische reacties en gelelektroforese. Deze methode ondersteunt onderzoek naar signalering in kanker en diabetes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken A. Riccio voor nuttige opmerkingen en om het manuscript te lezen. Dit werk werd ondersteund door de Medical Research Council (MRC) financiering van de Cell Biology Unit en door een Human Frontier Science Program Grant (RGP0048/2009-C).

1. Enzymatische reactie - dag 1 (1 uur in de namiddag) <ol><li> De eerste stap is de voorbereiding van 10-20 onafhankelijke enzymatische reacties waarin IP-6 K1 of VIP1 IP-6 om te zetten in de pyrophosphorylated isovormen. </li><li> We maken gebruik van His-IP 6 K1 en GST-Vip1 enzymen gezuiverd van E. coli volgens het protocol eerder beschreven 17,18. </li><li> Bereid 50 pi reacties met 1X reactie buffer (30 mM Hepes pH 6,8, 50 mM NaCl, 6 mM MgSO 4, 1 mM DTT), 6 mM creatinefosfaat (PCR), 25 U / mL CreatinePhosphoKinase (CPK), 5 mM ATP (Mg zout), 0,3 mM IP6, 0,05-0,1 ug His-IP 6 K1-of GST-Vip1. Het volume aanpassen met MiliQ DDH 2 O. </li><li> Kort draaien de reactie en incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht met rotatie. </li></ol> 2. Polyacrylamide gel gieten en laden - dag 2 (4 uur in de middag) <ol><li> De polyacrylamide gel is opgesteld op basis van 24 cm lang, 18 cm breed glazen platen en 1,5 mm breed afstandhouders. Meestal een 16 rijstrook of een voorbereidende enkele rijstrook kam wordt gebruikt. </li><li> Maak een mix (50 ml / gel) met de volgende: 35,5% (w / v) Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1, 1X Tris / Boraat / EDTA (TBE), 0,05% (w / v) ammoniumpersulfaat (APS ), 0,05% (w / v) TEMED. Giet de mix tussen de pre-gegoten glazen platen, plaatst u de kam en laat polymeriseren gedurende 30-60 minuten bij RT. </li><li> Nadat de gel is gepolymeriseerd, overdracht van de apparatuur aan de koude kamer en pre-run in 1x TBE voor ongeveer 30-60 minuten op 200-300 Volt. </li><li> Voeg 1X van OrangeG kleurstof (10 mM Tris-HCl pH7.0, 1 mM EDTA, 30% glycerol, 0,1% OrangeG) naar elke reactie. Bereid een monster dat 2 nmol van IP-6 te laden als een standaard controle. </li><li> Was elke well grondig met stromend buffer met behulp van een injectiespuit en een 21G naald om een ​​neerslag te verwijderen, dan laadt u de gel. Vermijd het laden aan de zijkant putten. </li><li> Laat de gel 's nachts op 450-550 Volt (7 MAMP / gel), tot de OrangeG kleurstof band is in de laatste 10 cm van de onderkant van de gel. </li></ol> 3. Isolatie van IP 7 - dag 3 (4 uur) en dag 4 (6-7 uur SpeedVac droogproces) <ol><li> Demonteer de gel apparaat en verwijder voorzichtig een glasplaat het verlaten van de gel op de andere. Snijd een klein deel van de gel van net boven de OrangeG kleurstof band tot op de bodem met het IP-6-norm en een monster baan, zoals weergegeven in figuur 1. </li><li> Vlekken op de afgesneden gedeelte van de gel met Toluidine Blue (0,1% (w / v) toluïdineblauw, 20% (w / v) methanol, 2% (w / v) glycerol) voor een paar minuten (1-3 min) of totdat de inositol pyrofosfaat band verschijnt. Leg de glazen plaat die eerder terug verwijderd op de top van de gel op de ongekleurde gel niet uitdroogt. </li></ol> Het IP-7 band zichtbaar moet zijn, omdat het draait iets trager dan het IP-6-norm. ATP, die loopt sneller dan de IP-6, moet ook zichtbaar zijn (Figuur 1). Breng de gekleurde deel van de gel in een de-kleuroplossing (20% (w / v) methanol) voor een paar minuten weg te wassen overtollige van Toluidine Blue en plaats de gel met de ongekleurd gel. Als visualisatie van hogere pyrophosphorylated inositol isovormen (IP-8 en IP-9) is vereist, vlekken op de gel met Toluidine Blue kleuroplossing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens wegspoelen van de Toluidine Blue met de de-kleuroplossing voor ongeveer 15 minuten. <ol start="3"><li> Met een scheermesje snijd de IP-7 band op de onbesmet gedeelte van de gel met als referentie het IP-7 migreren positie bepaald met de gekleurde gel (figuur 1). </li><li> Zet het IP-7 band die werd uit de gel gesneden op een 15 mL buis en voeg 10 ml MilliQ DDH 2 O. Zet buizen in rotatie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi de vloeistof te verwijderen overmaat van TBE en microscopische deeltjes acrylamide. </li><li> Vervolgens voeren twee uitdroging-hydratatie cycli. Voeg 5 ml van 50% (w / v) methanol op de buis met de gel met IP-7 en draaien bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Breng de gel slice naar een nieuwe 15 ml buis met 5 ml van MilliQ DDH 2 O en draai bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Gooi de methanol en MilliQ H 2 O uit de buizen. Herhaal de uitdroging-hydratatie cyclus nog een keer door opnieuw de overdracht van de polyacrylamide gel in de buizen van 15 ml eerder gebruikte. Een van de wassingen kan worden uitgevoerd 's nachts. </li><li> Om zich te concentreren de geëlueerde IP-7, samen droog de ​​10 ml (5 ml MilliQddH 2 O en 5 ml 50% (w / v) methanol) met behulp van een SpeedVac verwarmd op 60 ° C. </li><li> Nadat de monsters zijn bijna droog, de overdracht van de resterende vloeistof (300-600 ul) om A1.5 ml centrifugebuis en spin gedurende 2 minuten bij 5000 tpm. </li><li> Verzamel supernatant en overbrengen naar een frisse 1,5 ml centrifugebuis; verlatende onderste 20 tot 30 pi, omdat het kan acrylamide deeltjes bevatten. </li><li> Indien nodig blijft het droogproces met behulp van een onverwarmde SpeedVac. Het herstel van IP-7 is drastisch verminderd indien de monsters helemaal droog is, dan beëindigen het droogproces wanneer de monsters bij de volume van 100-300 ul. </li></ol> 4. Bepaling van de IP-7 concentratie en zuiverheid. <ol><li> Gebruik 2-5 pi van de herstelde IP-7 monster om te draaien op een PAGE gel, vergelijkbaar met de artikelen 2.2-2.5. Plaats enkele verdunningen van IP-6 (dat wil zeggen 0,5, 1, 2, 4 nmol) als de concentratie standaard en 4 nmol van Poly-P marker. Na het uitvoeren van de gel, visualiseer de inositol pyrofosfaat isovormen door kleuring en de-kleuren van de hele gel met Toluidine Blue oplossing, volgens de procedure beschreven in paragraaf 3.2 (figuur 2A). </li><li> Na Toluidine kleuring, kunnen de concentraties worden bepaald door het scannen van de gel en het vergelijken van de verschillen in intensiteit tussen 6 IP en IP-7, met behulp van imaging-software zoals Image-J, zoals weergegeven in figuur 2B. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: De voorbereidende enzymatische omzetting van IP-6 naar 7 met behulp van IP-IP 6 K1 en VIP1 enzymen kan eenvoudig worden opgelost met behulp van PAGE-analyse (figuur 1). Het laden van IP-6 als een grootte van controle, samen met Toluidine Blue gel vlekken maakt de identificatie van de pyrophosphorylated derivaten, want ze draaien langzamer, afhankelijk van het aantal fosfaatgroepen aanwezig op de inositol ring. De hierboven beschreven procedure maakt het mogelijk eenvoudig zuivering van IP-7. De analyse van de gezuiverde inositol pyrofosfaat door PAGE onthulde de zuiverheid van onze IP-7 (Figuur 2A). Interessant is dat de 1/3PP-IP 5 isomeer van IP-7 product van VIP1 migreert iets trager dan de 5pp-IP 5 isomeer van IP-7 die wordt gegenereerd door de IP-6 K1. Het gebruik van IP-6-normen mogelijk te maken een eenvoudige kwantificering van de concentratie van de gezuiverde IP-7 (Figuur 2B). Voor het gebruik van IP-7 voor verdere experimenten, kan de biologische activiteit te worden beoordeeld (Figuur 3). 5pp-IP 5 is geïncubeerd met VIP1 en met de IP-7 fosfatase DDP1 (diphosphoinositol polyfosfaat phosphohydrolase). Routinematig wordt het gezuiverde IP-7 omgezet naar IP-8 door VIP1 en IP 6 door DDP1 (figuur 3). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1:. Toluidine kleuring van PAGE en isolatie van de IP-7 band The gedeelte van de gel met de standaard (IP 6) werd gesneden en gekleurd met behulp van een Toluidine Blue oplossing. De drie bands vertegenwoordigen (van boven naar onder) 7 IP, IP 6 en ATP. Het gekleurde deel van de gel werd vervolgens uitgelijnd met de rest van de gel. Hierdoor kan de lokalisatie van het gedeelte van de gel met IP-7, die vervolgens kan worden gesneden en gezuiverd (gestippelde kader). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2: PAGE-analyse van IP-6 K1 en VIP1 reactieproducten. A) Analyse van de IP-6 (4, 2, 1, 0,5 nmol) door Toluidine Blue kleuring was gebruikt om de IP-7 concentratie gezuiverd van zowel IP-6 K1 (5pp-IP 5) en VIP1 (1/3PP-IP te bepalen 5) reacties. B) Scatter plot analyse om de concentratie van de gezuiverde IP-7 te bepalen. Concentraties werden bepaald volgens band intensiteit, berekend met behulp van ImageJ software, ten opzichte van vooraf bepaalde hoeveelheden van IP-6. De X-as staat voor intensiteit, de Y-as staat de concentratie uitgedrukt in nmol. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3:. Analyse van IP zeven biologische activiteit Om de kwaliteit van het gezuiverde IP-7 bepalen we geïncubeerd 5pp-IP 5 (IP-6 K1 gegenereerd IP-7) met VIP1 of met de IP-7 fosfatase DDP1 en vervolgens opgelost de reactie op PAGE. De DAPI en Toluidine vlekken bleek de verwachte productie van IP-8 door VIP1 en de conversie van IP-7 om IP-6 door DDP1.

<ol><li>Bennett, M., Onnebo, S. M., Azevedo, C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates%3A+metabolism+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates: metabolism and signaling.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 552-564 (2006).</li>
<li>Burton, A., Hu, X., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+inositol+pyrophosphates+signalling+molecules%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Are inositol pyrophosphates signalling molecules?</a> J Cell Physiol. 220, 8-15 (2009).</li>
<li>Barker, C. J., Illies, C., Gaboardi, G. C., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates%3A+structure%2C+enzymology+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates: structure, enzymology and function.</a> Cell Mol Life Sci. 66, 3851-3871 (2009).</li>
<li>Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diphosphoinositol+polyphosphates%3A+metabolic+messengers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Diphosphoinositol polyphosphates: metabolic messengers.</a> Mol Pharmacol. 76, 236-252 (2009).</li>
<li>Saiardi, A., Erdjument-Bromage, H., Snowman, A. M., Tempst, P., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+diphosphoinositol+pentakisphosphate+by+a+newly+identified+family+of+higher+inositol+polyphosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of diphosphoinositol pentakisphosphate by a newly identified family of higher inositol polyphosphate kinases.</a> Curr Biol. 9, 1323-1326 (1999).</li>
<li>Draskovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+hexakisphosphate+kinase+products+contain+diphosphate+and+triphosphate+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Inositol hexakisphosphate kinase products contain diphosphate and triphosphate groups.</a> Chem Biol. 15, 274-286 (2008).</li>
<li>Mulugu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+family+of+enzymes+that+phosphorylate+inositol+hexakisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A conserved family of enzymes that phosphorylate inositol hexakisphosphate.</a> Science. 316, 106-109 (2007).</li>
<li>Fridy, P. C., Otto, J. C., Dollins, D. E., York, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+two+human+VIP1-like+inositol+hexakisphosphate+and+diphosphoinositol+pentakisphosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of two human VIP1-like inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol pentakisphosphate kinases.</a> J Biol Chem. 282, 30754-30762 (2007).</li>
<li>Illies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+inositol+pyrophosphates+for+full+exocytotic+capacity+in+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of inositol pyrophosphates for full exocytotic capacity in pancreatic beta cells.</a> Science. 318, 1299-1302 (2007).</li>
<li>Saiardi, A., Resnick, A. C., Snowman, A. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+regulate+cell+death+and+telomere+length+through+phosphoinositide+3-kinase-related+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates regulate cell death and telomere length through phosphoinositide 3-kinase-related protein kinases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1911-1914 (2005).</li>
<li>York, S. J., Armbruster, B. N., Greenwell, P., Petes, T. D., York, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+diphosphate+signaling+regulates+telomere+length%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inositol diphosphate signaling regulates telomere length.</a> J Biol Chem. 280, 4264-4269 (2005).</li>
<li>Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+mediate+chemotaxis+in+Dictyostelium+via+pleckstrin+homology+domain-PtdIns%283%2C4%2C5%29P3+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates mediate chemotaxis in Dictyostelium via pleckstrin homology domain-PtdIns(3,4,5)P3 interactions.</a> Cell. 114, 559-572 (2003).</li>
<li>Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+regulate+endocytic+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14206-14211 (2002).</li>
<li>Auesukaree, C., Tochio, H., Shirakawa, M., Kaneko, Y., Harashima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plc1p%2C+Arg82p%2C+and+Kcs1p%2C+enzymes+involved+in+inositol+pyrophosphate+synthesis%2C+are+essential+for+phosphate+regulation+and+polyphosphate+accumulation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol pyrophosphate synthesis, are essential for phosphate regulation and polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 280, 25127-25133 (2005).</li>
<li>Azevedo, C., Burton, A., Ruiz-Mateos, E., Marsh, M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphate+mediated+pyrophosphorylation+of+AP3B1+regulates+HIV-1+Gag+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphate mediated pyrophosphorylation of AP3B1 regulates HIV-1 Gag release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 21161-21166 (2009).</li>
<li>Bhandari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+pyrophosphorylation+by+inositol+pyrophosphates+is+a+posttranslational+event%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein pyrophosphorylation by inositol pyrophosphates is a posttranslational event.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15305-15310 (2007).</li>
<li>Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+InsP7+by+the+Inositol+Hexakisphosphate+Kinase+1+%28IP6K1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of InsP7 by the Inositol Hexakisphosphate Kinase 1 (IP6K1).</a> Methods Mol Biol. 645, 73-85 (2010).</li>
<li>Otto, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+inositol+phosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of inositol phosphate kinases.</a> Methods Enzymol. 434, 171-185 (2007).</li>
<li>Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+and+their+unique+metabolic+complexity%3A+analysis+by+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis.</a> PLoS One. 4, e5580-e5580 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Het gebruik van inositol pyrofosfaat in de biochemie wordt ernstig beperkt door de commerciële onbeschikbaarheid van dergelijke verbindingen en de slechte gevoeligheid van de bestaande detectiemethoden. De combinatie van pagina, die de scheiding van moleculen bezitten een verschillend aantal fosfaatgroepen, en Toluidine Blue (figuur 1), een metachromatische kleurstof die bindt aan fosfaat-groepen, maakt maakt het eenvoudig opsporen van inositol pyrophoshate isovormen het openen van nieuwe wegen van onderzoek 20. De beschreven gebruik van de PAGE-technologie om inositol pyrofosfaat producten van de enzymatische reactie te zuiveren uitgevoerd outby ofwel IP-6 K1 of VIP1 is een eenvoudige, economische en betrouwbare methode die het mogelijk maakt voor de productie van grote hoeveelheden van hoge kwaliteit IP-7. De hierboven beschreven methode is niet beperkt tot de eenvoudige zuivering van IP-7, maar kleine wijzigingen van de beschreven protocol kan de zuivering van een andere reeks van inositol pyro mogelijk te maken. Hogere gefosforyleerd inositol pyrofosfaat isovormen, met meer dan acht fosfaat groepen kunnen worden gedetecteerd met behulp van IP-7 of verschillende hoeveelheden van IP-6 als een substraat 20,6. Deze inositol pyrofosfaten kan worden gedetecteerd door het verhogen van de lengte van de kleuring procedure en vervolgens gezuiverd (paragraaf 3.2). Bovendien zou het gebruik van IP-5 als substraat voor de enzymatische reactie kan de zuivering van PP-IP 5 en andere inositol pyrofosfaten met een hydroxylgroep op de inositol ring. Kortom, deze niet veeleisend methode maakt het mogelijk om een ​​betrouwbare zuivering van milligram hoeveelheden van inositol pyro met wijd beschikbare instrumenten, waardoor het openen van nieuwe wegen voor dit spannende onderzoeksveld.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> Fytinezuur (IP 6) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8810 </td></tr><tr><td> Poly-P (natriumhexametafosfaat) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8510 </td></tr><tr><td> ATP-Mg 2 + zout </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9187 </td></tr><tr><td> OrangeG </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3756 </td></tr><tr><td> Creatinefosfaat (PCR) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7936 </td></tr><tr><td> CreatinePhospho Kinase (CPK) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3755 </td></tr><tr><td> GST-Vip1 </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> His-IP6K1 </td><td> 18 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> His-Ddp1 </td><td> Verkrijgbaar in het lab </td><td> Verkrijgbaar in het lab </td></tr><tr><td> Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40%) </td><td> Flowgen </td><td> H16972 </td></tr><tr><td> Ammoniumpersulfaat (APS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9164 </td></tr><tr><td> Tris / Boraat / EDTA (TBE) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T 9060 </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> BDH </td><td> 43083G </td></tr><tr><td> Toluidine Blue </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 198161 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> Christus </td><td> 100218 </td></tr><tr><td> Gel apparatuur </td><td> Hoefer </td><td> SE600 </td></tr><tr><td> Vacuum spruitstuk </td><td> Christus </td><td> Alpha 2-4 </td></tr><tr><td> Vacuümpomp </td><td> ABM Greiffenberger </td><td> 4EKF63CX </td></tr></tbody></table>

de voorbereiding van quality inositol pyro

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is aanwezig in de natuur of ongewijzigde of in meer complexe gefosforyleerde derivaten. Van de nieuwste, de twee meest voorkomende in eukaryote cellen zijn inositol pentakisphosphate (IP 5) en inositol hexakisphosphate (fytinezuur of IP-6). IP en IP 5 6 zijn de voorlopers van inositol pyrofosfaat moleculen die een of meer pyrofosfaat obligaties 1 bevatten. Fosforylatie van IP 6 genereert diphoshoinositolpentakisphosphate (IP-7 of PP-IP 5) en bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP 8 of (PP) 2-IP 4). Inositol pyrofosfaten zijn geïsoleerd van alle eukaryote organismen tot nu toe bestudeerd. Daarnaast zijn de twee verschillende klassen van enzymen die verantwoordelijk zijn voor de inositol pyrofosfaat synthese sterk geconserveerd doorheen de evolutie 2-4. Het IP-6 kinases (IP 6 KS) bezitten een enorme katalytische flexibiliteit, het omzetten van IP en IP 5 6 tot en met PP-IP en IP-4 7 respectievelijk vervolgens door het gebruik van deze producten als substraten, bevordering van het genereren van meer complexe moleculen 5,6 . Onlangs werd een tweede klasse van pyrofosfaat het genereren van enzymen die in de vorm van de gist-eiwit VIP-1 (ook wel aangeduid als PP-IP 5 K), die in staat is om IP-6 om te zetten in IP-7 en 8 IP 7,8. Inositol pyrofosfaten reguleren veel ongelijksoortige cellulaire processen zoals insuline secretie 9, de lengte van telomeren 10,11, chemotaxis 12, vesiculair transport 13, fosfaat homeostase 14 en HIV-1 gag los 15. Twee mechanismen van acties die zijn voorgesteld voor deze klasse van moleculen. Ze kunnen invloed hebben op cellulaire functie door allosterically interactie met specifieke eiwitten, zoals AKT 16. Als alternatief kan de pyrofosfaat groep kan een fosfaat doneren aan pre-gefosforyleerde eiwitten 17. Het enorme potentieel van dit onderzoek gebied wordt bemoeilijkt door het ontbreken van een commerciële bron van inositol pyrofosfaten, dat veel wetenschappers is het voorkomen van het bestuderen van deze moleculen en deze nieuwe post-translationele modificatie. De methoden die momenteel beschikbaar zijn inositol pyrofosfaten isoleren vereisen geavanceerde chromatografische apparatuur 18,19. Deze procedures gebruik van zure omstandigheden die kunnen leiden tot inositol pyrofosfaat degradatie 20 en dus tot een slechte herstel. Bovendien is de omslachtige post-column ontzouten procedures beperken het gebruik ervan aan gespecialiseerde laboratoria. In deze studie beschrijven we een weinig veeleisende methode voor het opwekken, isolatie en zuivering van de producten van de IP 6-kinase en PP-IP 5-kinases reacties. Deze methode was mogelijk door het vermogen van polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) op te lossen zeer gefosforyleerd inositol polyfosfaten 20. Volgende IP-6 K1 en PP-IP 5 K enzymatische reacties met behulp van IP-6 als de ondergrond, werd PAGE gebruikt om de gegenereerde inositol pyrofosfaten die vervolgens werden geëlueerd in water te scheiden.

Inositol pyrofosfaten spelen een belangrijke rol in de menselijke ziekten zoals kanker, diabetes en obesitas, maar het exacte werkingsmechanisme is een kwestie van geschil. Het gebrek aan commercieel beschikbare inositol pyrofosfaten maakt gedetailleerde studies problematisch. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het produceren en isoleren milligram inositol pyro.

De voorbereiding van Quality Inositol pyro

Myo-inositol komt in de natuur voor in ongewijzigde vorm of als complexere gefosforyleerde derivaten. Van deze laatste zijn de twee meest abundante in eukaryote cellen ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren en zuiveren van hoogwaardig en zuiver pyrophosfaat. Dit wordt bereikt door eerst IP six te gebruiken als substraat voor de IP six kinase, een enzym dat IP seven genereert. Vervolgens worden de enzymatische reacties geladen op een polyacrylamidegel en wordt de band die overeenkomt met IP seven uitgesneden.Het IP zeven wordt vervolgens geïsoleerd door opeenvolgende dehydratatie-hydratatiecycli. De laatste stap van de procedure is het bevestigen van de zuiverheid van het product en het bepalen van de concentratie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de biologische activiteit van IP zeven aantonen via incubatie van IP zeven.Met VIP-kinase 1 en met de fosfatase DDP1 voor IP7, genereren deze reacties respectievelijk IP8 en IP6. Deze methode kan inzicht bieden in IP7-signalering. Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals bij fosfaten zoals IP8 of de uit IP5 afgeleide PPIP4.Dit protocol begint met de voorbereiding van enzymatische reacties waarin IP6-kinase 1 of VIP1 IP6 omzet in de pyrofosfaat-gerelateerde isovormen. Voor deze demonstratie werden histamine-getagde IP6-kinase 1- en GST-getagde VIP1-enzymen gezuiverd uit E. coli volgens een eerder beschreven procedure. Begin met het voorbereiden van 10 tot 20 onafhankelijke enzymatische reacties met IP6 en His-IP6-kinase 1 of GST-VIP1, zoals beschreven in het geschreven protocol.Vul het volume aan tot 50 µL met milli-Q dubbel gedestilleerd water. Na het kort centrifugeren van de buisjes, worden de reacties gedurende de nacht bij 37 °C geïncubeerd onder rotatie. Bereid de polyacrylamidegel-apparatuur voor met glazen platen van 24 cm lang en 18 cm breed, tussenruimtes van 1,5 mm en een kam met 16 banen.Giet vervolgens een eerder bereide gellopossing tussen de vooraf gegoten glasplaten met een volume van 50 milliliters per gel. Plaats de kam en laat de gel 30 tot 60 minuten polymeriseren bij kamertemperatuur. Zodra de gel is gepolymeriseerd, wordt de apparatuur naar de koelkamer overgebracht.Voer een voorrun van de gel uit in 1× TBE gedurende ongeveer 30 tot 60 minuten bij 200 tot 300 volt, terwijl 1× oranje G-kleurstof wordt toegevoegd. Bereid voor elke reactie een standaardcontrolemonster voor dat 2 mol IP6 bevat. Was na de voorrun elke put grondig met runbuffer.Gebruik een spuit met een naald van 21 gauge om eventueel neerslag te verwijderen. Laad vervolgens de monsters in de gel, waarbij de eerste twee en de laatste twee banen van de gel worden vermeden. Laat de gel tot slot een nacht lopen bij zeven milliampère per gel, totdat de oranje G-kleurstofband zich binnen de laatste 10 centimeters van de onderkant van de gel bevindt.Om met de isolatie van IP zeven te beginnen, demonteert u de gelapparatuur en verwijdert u voorzichtig één glasplaat, waarbij de gel op de andere plaat blijft liggen. Snijd een klein gedeelte van de gel uit, vanaf net boven de oranje GD-band tot aan de onderkant, inclusief de IP zes-standaard en één monsterbaan. Kleur het uitgesneden gedeelte van de gel enkele minuten met toluidineblauw totdat de Anatol Pyrophosphate-band zichtbaar wordt.Plaats ondertussen de eerder verwijderde glasplaat weer bovenop de gel om te voorkomen dat het niet-gekleurde deel van de gel uitdroogt. Breng het gekleurde deel van de gel enkele minuten over naar een DES-kleuringsoplossing om overtollig toluidineblauw weg te wassen, en plaats de gel vervolgens weer bij het niet-gekleurde deel. De IP zeven-band zou zichtbaar moeten zijn, aangezien deze iets langzamer loopt dan de IP zes-standaard; de A TP, die sneller loopt dan IP zes, zou ook zichtbaar moeten zijn.Gebruik vervolgens een scheermesje om de IP seven-band op het niet-gekleurde gedeelte van de gel uit te snijden. Maak hierbij gebruik van de migratiepositie van IP seven die met de gekleurde gel is bepaald. Om de locatie van de IP seven-band te schatten, plaatst u de uit de gel gesneden IP seven-band in een buisje van 15 milliliter en voegt u 10 milliliter milli Q dubbel gedestilleerd water toe.Draai de buisjes na incubatie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en verwijder de vloeistof door decanteerom excess TBE en microscopische acrylamide-deeltjes te verwijderen. Voer vervolgens twee dehydratatie-hydratatiecycli uit door eerst vijf milliliter 50% methanol toe te voegen aan de buis met de IP seven-gel. Draai het monster twee uur lang bij kamertemperatuur.Breng vervolgens de gelsectie over naar een nieuwe buis van 15 milliliter die vijf milliliter milli Q dubbel gedestilleerd water bevat en laat deze twee uur bij kamertemperatuur roteren. Bewaar de buis met methanol na incubatie voor verder gebruik. Herhaal de dehydratie-hydratatiecyclus nogmaals om het geëlueerde IP seven te concentreren.Combineer de eerder toegevoegde vijf milliliters water en vijf milliliters 50% methanol. Droog de gecombineerde oplossing met een speed vac die is verwarmd tot 60 °C. Zodra de monsters bijna droog zijn, brengt u de resterende vloeistof over in een centrifugebuis van 1,5 milliliter.Centrifugeer de buis gedurende twee minuten bij 5.000 toeren per minuut. Verzamel de SUP-supernatans en laat de onderste 20 tot 30 µL ongemoeid, aangezien deze acrylamide-deeltjes kan bevatten. Breng het monster over naar een schone centrifugeerbuis van 1,5 ml.Zet indien nodig het droogproces voort met een ongeverwarmde speed vac. Het herstel van IP zeven wordt drastisch verminderd als de monsters volledig uitdrogen. Daarom is het essentieel om het droogproces te beëindigen wanneer de monsters een volume van 100 tot 300 microliters bereiken.Zodra het geïsoleerde IP seven is teruggewonnen, wordt twee tot vijf µL van het monster op een page-gel geladen om de concentratie en zuiverheid te bepalen. Laad verschillende verdunningen van IP six als concentratiestandaarden en vier mol polyp-marker. Visualiseer na het runnen van de gel de initiële pyrofosfaat-isoformen door de gehele gel te kleuren en te ontkleuren met een toluidineblauw-oplossing.Volgens de zojuist beschreven procedure na toluidine-kleuring kunnen de concentraties worden bepaald door de gel te scannen en de verschillen in intensiteit tussen IP zes en IP zeven te vergelijken. Met behulp van beeldbewerkingssoftware zoals Image J kan de preparatieve enzymatische omzetting van IP zes naar IP zeven, met gebruik van IP zes kinase één en VIP één enzymen, eenvoudig worden geanalyseerd via PAGE-analyse.Het laden van IP zes als groottecontrole, samen met toluidineblauw-gelkleuring, maakt de identificatie van de pyrogefosforyleerde derivaten mogelijk. Omdat deze langzamer migreren, afhankelijk van het aantal fosfaatgroepen dat aanwezig is op de initiële stof, resulteerde de hierboven beschreven procedure in een eenvoudige zuivering van IP zeven. Bovendien onthulde analyse van het gezuiverde anatolpyrofosfaat via PAGE de zuiverheid van IP zeven.Interessant genoeg migreert de 1,3-pyrofosfaat IP5-isomeer van het IP7-product van VIP1 iets langzamer dan de 5-pyrofosfaat IP5-isomeer van VIP7 die wordt gegenereerd door IP6-kinase 1. Het gebruik van IP6-standaarden maakt een eenvoudige kwantificering van de concentratie van het gezuiverde IP7 mogelijk voordat IP7 wordt gebruikt. Voor verdere experimenten kan de biologische activiteit ervan worden beoordeeld.Vijf.Pyrofosfaat IP vijf wordt routinematig geïncubeerd met FIP één en met de IP zeven fosfatase DDP één. Het gezuiverde IP zeven wordt door VIP één omgezet in IP acht en door DDP één in IP zes. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals een verlengde tolin-blauw kleuring, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de isolatie van IP acht of andere gefosforyleerde in-isoformen.

preparation-of-quality-inositol-pyrophosphates

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De hierin beschreven protocol heeft tot doel uit te leggen en verkorten de vele obstakels in de weg van de ingewikkelde route die leidt tot gewijzigde nucleosidetrifosfaten. Bijgevolg Dit protocol maakt zowel de synthese van deze geactiveerde bouwstenen en hun beschikbaarheid voor praktische toepassingen.

Nucleosidetrifosfaten - Van Synthese tot biochemische karakterisering

Een protocol voor het diastereoselectieve een-pot bereiding van cis - N-Ts-iodoaziridines wordt beschreven. Het produceren van diiodomethyllithium, behalve N-Ts aldiminen en cyclisatie van de amino gem-jodide gemiddelde tot iodoaziridines wordt aangetoond. Ook inbegrepen is een protocol om de meest geschikte stationaire fase voor de zuivering snel en kwantitatief beoordelen door chromatografie.

Synthese en zuivering van Iodoaziridines betrekken Kwantitatieve Selectie van de optimale stationaire fase voor chromatografie

Phosphoinositides signaleren lipiden waarvan de relatieve abundantie snel verandert in reactie op verschillende stimuli. Dit artikel beschrijft een methode om de overvloed aan phosphoinositides meten door metabolisch labelen van cellen met 3H-myo-inositol, gevolgd door extractie en deacylering. Geëxtraheerd glycero-inositiden omgezet worden vervolgens gescheiden door hoge-prestatie vloeistofchromatografie en gekwantificeerd door flow scintillatieteller.

Radioactief en kwantificering van cellulaire niveaus van fosfoinositiden door High Performance Liquid Chromatography-gekoppeld Flow Scintillation

Vroege endosome functies is afhankelijk van F-actine polymerisatie. Hier beschrijven we een microscopie gebaseerde in vitro -assay die reconstitutes de nucleatie en polymerisatie van de F-actine op vroege endosomal membranen in proefbuizen, waardoor deze complexe reeks reacties vatbaar voor biochemische en genetische manipulaties.

In Vitro Polymerisatie van F-actine op vroege Endosomen

Hier presenteren we een ondersteunde lipid bilayer in het kader van een microfluïdisch platform om eiwit-fosfoinositide interacties te bestuderen met behulp van een etiketvrije methode op basis van pH-modulatie.

PIP-on-a-chip: een labelvrije studie van eiwit-fosfoinositide-interacties

Een protocol voor de synthese van hoge zuiverheid nonsymmetric dialkylphosphinic zure extractants wordt gepresenteerd, nemen (2,3-dimethylbutyl) (2,4, 4'-trimethylpentyl) phosphinic zuur als voorbeeld.

Synthese van hoge zuiverheid Nonsymmetric Dialkylphosphinic zuur Extractants

Deze paper introduceert een procedure voor het onderzoek naar de adsorptie van fosfonaten op ijzer-bevattende filtermaterialen, met name granulaire ijzer(III) hydroxide met weinig inspanning en hoge betrouwbaarheid. In een gebufferde oplossing, is het fosfonaat in aanraking met het absorberend met behulp van een rotator gebracht en vervolgens geanalyseerd via de methode van een verkleinde fosfor sleutelbepaling.

Geoptimaliseerde Procedure voor de bepaling van de adsorptie van fosfonaten op granulaire Ferric Hydroxide met behulp van een methode fosfor sleutelbepaling verkleind

Beschrijven we een eenvoudige methode voor snelle kwantificering van anorganische polyfosfaat in verschillende bacteriën, waaronder mycobacteriële, gram-negatieve en gram-positieve soorten.

Keuring voor anorganische polyfosfaat in bacteriën

Dit protocol richt zich op de identificatie van eiwitten die binden aan inositol fosfaten of fosfoinositides. Het maakt gebruik van affiniteits chromatografie met biotinyleerd inositol fosfaten of fosfoinositides die zijn geïmmobiliseerd via streptavidine aan agarose of magnetische kralen. Inositol fosfaat of fosfoinositide bindende eiwitten worden geïdentificeerd door Western blotting of massaspectrometrie.

Identificatie van inositol fosfaat of Fosfoinositide interactie eiwitten door Affiniteits chromatografie gekoppeld aan Western Blot of massaspectrometrie

Hier beschrijven we sterke anion uitwisseling high-performance vloeibare chromatografie van [3H]-myo-inositol-gelabelde zaailingen die een zeer gevoelige methode is om inositol polyfosfaten in planten te detecteren en te kwantificeren.

Extractie en kwantificering van oplosbare, radiogelabelde Inositol Polyfosfaten van verschillende plantensoorten met SAX-HPLC

Een procedure voor capillaire elektroforese elektrospray ionisatie massaspectrometrie voor de absolute kwantificering van inositolpyrosfaten uit zoogdiercelextracten wordt beschreven.

Absolute kwantificering van inositolpyrosfaten door capillaire elektroforese elektrospray ionisatie massaspectrometrie

Leer de productie en isolatie van inositolpyrofosfaten zoals IP7 via enzymatische reacties en gelelektroforese. Deze methode ondersteunt onderzoek naar signalering in kanker en diabetes.

De voorbereiding van Quality Inositol pyro

Meer video's verkennen