Analyse van Nephron samenstelling en functie in de Adult zebravis Kidney
9 augustus 2014
De zebravis volwassen nier is een uitstekend systeem voor renale regeneratie en ziekte studies. Een essentieel aspect van dit onderzoek is de beoordeling van de nefron structuur en functie. Dit protocol beschrijft een aantal methoden die kunnen worden toegepast om nefron tubule samenstelling te beoordelen en om de renale reabsorptie evalueren.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de samenstelling en functionaliteit van nefronse segmenten in de nier van volwassen zebravissen te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst fluorescent gelabelde dextrine in een nest te injecteren dat zebravissen vastbindt. De tweede stap is om de nier te verwijderen en te fixeren om weefsel voor volgende labelmethoden voor te bereiden.
Vervolgens wordt de nier gebleekt om pigmentatie te verwijderen en vervolgens gekleurd om de gewenste nefronse segmenten fluorescent te labelen. Resultaten worden verkregen met behulp van immunofluorescentie, microscopie en/of helderveld beeldvorming die de visualisatie van de nier anatomie mogelijk maakt op basis van de geselecteerde kleurstof of kleurstoffen. De volgende labelmethoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het niergebied met betrekking tot orgaan anatomie en kunnen worden gebruikt om de nefronse samenstelling te bestuderen en de renale functionaliteit te evalueren, zowel vóór als na een letselgebeurtenis.
De implicaties van deze technieken strekken zich uit naar het onderzoek van genetische afwijkingen in de vorming van volwassen nieren en kunnen ook worden toegepast om de renale status te beoordelen tijdens het modelleren van chronische ziekten. Om te beginnen, decant de oplossing van een verdoofde vis en plaats het dier voorzichtig op een natte sponzen mal, buikzijde naar beneden. Vervolgens, vul een insulinespuit met 20 microliters ontdooid dextrine stamoplossing.
Plaats de naald zodat de inbreng op een schuine hoek plaatsvindt op de ventrale middenlijn van de buik. Om de organen niet te injecteren, heft de naald net na het injecteren de lichaamswand op en creëert een ruimte waarin de oplossing kan worden geïnjecteerd. Na de injectie, plaats de vis voorzichtig terug in het aquarium om te herstellen van de narcose.
Om te beginnen, decant eventuele extra oplossing weg van een verdoofde vis en plaats deze op een doek of papieren handdoek. Na het verwijderen van het hoofd en de inwendige organen, gebruik super fijne dissectie naalden om de lichaamswanden open te spelden. Lokaliseer de nier, die is gehecht aan de dorsale wand van het dier.
Gebruik fijne tang om de nier los te maken van de dorsale wand. Plaats de nier voorzichtig in een glazen vijl van vijf milliliter met één XPBS en was drie keer gedurende vijf minuten elk. Verwijder de nier met een transferpipet en plaats deze op een schone glazen plaat met één tot twee druppels één XPBS.
Gebruik fijne tang om de nier plat te maken op de plaat, zorg ervoor dat er geen weefsel is gekruld of anderszins op zichzelf is omgedraaid. Een tungsteendraad kan worden gebruikt om kleine sneden in het bindweefsel te maken om de platte positionering van de nier te vergemakkelijken. Plaats vervolgens kleine stukjes modelklei op elke hoek van een 18 bij 18 millimeter glazen deksel.
Plaats langzaam het deksel op de nier, met een lichte hoek. Om luchtbellen te minimaliseren, voegt u eventueel een extra druppel één XPBS toe om de ruimte tussen het deksel en de glijbaan te vullen. Een aparte groep zebravissen wordt geëuthanaseerd en overnacht in fixeermiddel gedrenkt.
Wanneer u klaar bent, gebruikt u fijne tang om de nier voorzichtig los te maken van de dorsale lichaamswand en plaats het orgaan in een glazen vijl. Was de gedissekteerde nier drie keer met drie tot vijf milliliter één XPBS met 0,05% tween gedurende vijf minuten elk. Vervolgens, verwijder de PBS-oplossing en spoel de nier met drie milliliter van een 5% sucrose-oplossing gedurende 30 minuten.
Na deze tijd, vervang de oplossing met drie milliliter van 30% sucrose en bewaar de volgende dag overnacht bij vier graden Celsius. Verwijder de oplossing en was de nier twee keer voordat u drie tot vijf milliliter bleekoplossing toevoegt. Om de melanocyte pigmentatie die op de nier aanwezig is, te verwijderen, plaats de glazen vijl op een rotator en kijk zorgvuldig toe hoe de pigmentatie verdwijnt.
Depigmentatie duurt meestal ongeveer 20 minuten, maar kan soms wel 60 minuten duren. Als de bleekoplossing te lang staat, kan desintegratie optreden en het wordt daarom geadviseerd om het monster elke 10 tot 15 minuten te controleren op integriteit wanneer de pigmentatie is verwijderd van de nier, was twee keer en incubeer met 4% PFA-oplossing gedurende één uur bij kamertemperatuur. Vervolgens, verwijder de 4% PFA-oplossing en was de nier drie keer na de laatste was bij drie tot vijf milliliter blokkerende oplossing en incubeer de nier bij kamertemperatuur gedurende twee uur.
Wanneer het blokkeren voltooid is, ga direct door naar het geselecteerde kleuringsprotocol. Verwijder de blokkerende oplossing en was de nier drie keer voordat de nier in één XPBS gedurende ten minste 10 minuten wordt gedrenkt. Gedurende deze tijd, breng de nier over naar een 12 well of 24 well kweekschaal.
Vervang de één XPBS met voldoende werkende alkalische fosfatas substraat oplossing om het monster te bedekken en plaats het monster op een rotator gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Na deze tijd, stop de reactie door de nier in alkalische fosfatase wasbufferoplossing te wassen. Spoel de nier met drie veranderingen van wasoplossing gedurende 10 tot 15 minuten.
Vervolgens, verwijder de wasoplossing en monteer de nier op een schone glas. Schuif in de fosfatase montage medium dat is opgenomen in het labelset. Visualiseer de alkalische fosfatase gekleurde nier met behulp van een stereo microscoop of compound microscoop met een haakje verbonden aan Debbie filter set.
Bereid eerst een 200 microliter werkende DBA oplossing door DBA in één XPBS te verdunnen. Vervang de PBS oplossing met 200 microliters van de DBA oplossing en plaats het monster op een rotator gedurende één uur bij kamertemperatuur. Na deze tijd, verwijder de DBA oplossing en was de nier drie keer met drie tot vijf milliliter van één XPBS gedurende vijf minuten elk.
Verwijder de één XPBS en monteer de nier op een schone glas schuif. Zoals eerder gedemonstr
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het beoordelen van de samenstelling en functionaliteit van nefronsegmenten in de nier van volwassen zebravissen, een waardevol model voor nieronderzoek. De beschreven methodologieën vergemakkelijken de evaluatie van nefronstructuur en renale reabsorptie, en dragen bij aan onderzoek naar nierregeneratie en -ziekten.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Nefrologie
- Regeneratieve Geneeskunde
- Vergelijkende Biologie
Achtergrond
- Zebravissen zijn een modelorganisme voor het bestuderen van nierfunctie en regeneratie.
- Begrip van de nefronstructuur is cruciaal voor nierziekteonderzoek.
- Fluorescentielabelingtechnieken verbeteren de visualisatie van nieranatomie.
- Onderzoeksimplicaties strekken zich uit tot genetische anomalieën en chronische ziektemodellering.
Doel van het onderzoek
- Om de samenstelling van nefronsegmenten in zebravisnieren te beoordelen.
- Om de nierfunctionaliteit vóór en na letsel te evalueren.
- Om methodologieën te ontwikkelen die toepasbaar zijn in nieronderzoek.
Gebruikte methoden
- Injectie van fluorescent gelabeld dextrine in zebravissen.
- Dissectie en fixatie van de nier voor weefselvoorbereiding.
- Depigmentatie en kleuring van nefronsegmenten.
- Visualisatie met behulp van immunofluorescentie en microscopietechnieken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van nefronsegmenten na kleuring.
- Technieken maken een gedetailleerde anatomische beoordeling van de nier mogelijk.
- Resultaten dragen bij aan het begrip van nieranatomie en -functie.
- Methodologieën kunnen worden aangepast voor verschillende nieronderzoektoepassingen.
Conclusies
- Het zebravisniermodel is effectief voor nefronstudies.
- Fluorescentielabelingtechnieken geven inzicht in nierfunctie.
- Onderzoeksresultaten hebben implicaties voor nierziekte en regeneratie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding nephron regeneration mechanisms in zebrafish provides predictive value for identifying compounds that modulate renal repair pathways. This model supports target validation by enabling functional assessment of nephron segment integrity before and after injury. The protocol facilitates mechanistic de-risking in early discovery by linking genetic or pharmacological perturbations to measurable renal phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to renal regeneration pathways through segment-specific labeling.
- Operational Value: Provides reproducible readouts of nephron epithelial integrity and tubular function in adult zebrafish.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing compounds that promote true regeneration versus transient repair.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts for proximal and distal tubule segments to assess compound effects.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and staining workflows for high-content imaging platforms.
- Scalability: Compatible with multi-well plate formats for dose-response screening in renal injury models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage nephron labeling to preclinical evaluation of renal recovery in injury paradigms.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of structural nephron changes with functional dextrin clearance as a translational readout.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by quantifying nephron segment-specific damage and regeneration kinetics.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization by providing functional renal phenotyping capabilities.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of renal regeneration mechanisms via visualization of nephron segment composition.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized kidney preparations with segment-specific fluorescent outputs for compound screening.
- Analytics: Enables quantitative comparison of dextrin uptake and segment intensity across conditions to assess renal functionality.
- Translational Research: Connects structural nephron assessment to functional recovery metrics in chronic disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal renal phenotyping across genetic and pharmacological injury models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in renal target validation through direct visualization of nephron segment integrity.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, bleaching, and multi-step staining protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of nephrotoxic liabilities in lead candidates.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by quantifying regenerative capacity in preclinical renal models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, microsurgery, and fluorescence microscopy.
- Dependent on dextrin labeling reagents, bleaching solutions, and immunofluorescence infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for consistent kidney dissection and mounting procedures.
- Adaptation considerations include species-specific pigmentation and nephron architecture in non-zebrafish models.
- Practical limitations include tissue fragility during dissection and potential dextrin efflux affecting longitudinal studies.
