Name: Analyse van Nephron samenstelling en functie in de Adult zebravis Kidney (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Leer fluorescente labeltechnieken om nefronsegmenten in de nier van volwassen Danio rerio te visualiseren. Deze methoden ondersteunen onderzoek naar nieranatomie, functie en regeneratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de financiering aan RAW uit het volgende: National Institutes of Health verleent K01 DK083512, DP2 OD008470 en R01 DK100237; March of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar subsidie ​​award # 5-FY12-75; opstarten fondsen van de University of Notre Dame College of Science and Department of Biological Sciences; en een gulle gift aan de Universiteit van Notre Dame van Elizabeth en Michael Gallagher namens de Gallagher familie te bevorderen stamcelonderzoek. De financiers hadden geen rol in de onderzoeksopzet, dataverzameling en analyse, besluit tot publicatie, of voorbereiding van het manuscript. Wij danken de medewerkers van de afdeling Biologische Wetenschappen voor hun steun, en het Centrum voor Onderzoek zebravis in Notre Dame voor hun uitstekende inzet in de zorg en het welzijn van onze zebravis kolonie. Tot slot danken wij de leden van onze research lab voor hun opmerkingen, discussies en inzichten over dit werk.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier hebben wij werkwijzen beschreven die de visualisatie van nefron segment componenten in de volwassen zebravissen inschakelen. De injectie van fluorescerende dextran conjugaten maakt preferentiële PCT etikettering vanwege de endocytisch eigenschappen van deze proximale tubulus cellen 30,38. Deze werkwijze kan worden uitgevoerd met een grote flexibiliteit door de aanwezigheid van dextranen die kan worden verkregen met een heel scala aan verschillende fluorescente conjugaten. Bovendien, het gebruik van lysine-fixeerbaar dextranen is een bijzonder gemakkelijke manier om PCT segmenten labelen secundaire labeling procedures niet vereist. Dit is een relatief eenvoudige signaaldetectie en is geschikt voor vele andere fluorescente labels, immunokleuring en het gebruik van transgene reporter lijnen. Alkalische fosfatase etikettering markeert ook de proximale tubulus, met sterke reactiviteit in de PCT en iets zwakkere reactiviteit in de PST. Ten slotte DBA kleuring maakt labeling distale tubulus segmenten die een ch weergevenaracteristic vertakte morfologie. Verschillende lectine moleculen, die suiker bindende eiwitten van immune oorsprong, zijn uitgebreid gebruikt voor zoogdiercellen nefron segmenten 47 onderscheiden. Het is interessant dat DBA in de zebravis correleert met distale tubulus segmenten, zoals het wordt gebruikt om verzamelbuizen markeren zoogdieren nieren 47. Tezamen kunnen deze werkwijzen worden gebruikt in verschillende combinaties renale samenstelling en functie documenteren. Omdat al deze methoden kunnen worden gebruikt geheel nier preparaten, zij instrumenten te nefron structuur en functie gehele orgaan te evalueren zonder geheel te vertrouwen op het gebruik van tijdrovend, vervelend werkwijzen, bijvoorbeeld cryosectie werk en immunokleuring. Echter, de in dit artikel beschreven methoden vlekken levensvatbaar zijn in cryosectie. Cryosectie analyse genereert monsters (in vergelijking met hele mount), dat beter geschikt is voor immunohistochemie specifieke pepti detecteren zijndes, hoewel natuurlijk dit type analyse vereist de beschikbaarheid van passende primaire antilichamen. Er is nog een belangrijke beperking in samenwerking met de zebravis diermodel blijft de slechte beschikbaarheid van antilichamen. Zo WISH blijft de meest gebruikte, dat wil zeggen, &#39;go-to&#39; procedure voor de analyse van genexpressie. WISH met BCIP, NBT, en / of INT substraat reacties op paars of rood neerslag te produceren is niet compatibel met fluorescerende vlekken op vriescoupes. Een mogelijkheid is het gebruik van fluorescente detectie WISH, een procedure die is geoptimaliseerd voor zebravis embryo monsters en kunnen worden aangepast voor gebruik bij een volwassen nier roepen. De beschrijving van de methoden die in deze video artikel moet het mogelijk maken voor verdere experimenten met technieken zoals fluorescerende WISH in combinatie met transgene zebravis lijnen waarin afzonderlijke segmenten zijn voorzien van een verslaggever, zoals eGFP of mCherry. Als alternatief, de methoden hier beschreven Could getest in combinatie met andere vitale kleurstoffen, bijvoorbeeld andere lectinen. Zo kon verdere aanpassing en uitbreiding van de hier beschreven methoden worden ingeroepen om de behoeften van de onderzoeker voor de ganse berg nier voorbereidingen en analyse aan te passen. Als zodanig zijn deze werkwijzen hebben brede mogelijkheden voor de uitvoering van de zebravis model voor continue regeneratie studies en ook genetische ziektemodel. Er is dringend behoefte aan innovatief onderzoek en behandelingen voor nier aandoeningen. Miljoenen mensen lijden aan een vorm van nierziekte elk jaar als gevolg van congenitale, acute en / of chronische oorzaken. Verder is de prevalentie van nierziekte blijft wereldwijd toenemen, waardoor deze ziekten wereldwijd gezondheidsprobleem 14,15. Bewerkingen zoals hemodialyse beschikbaar waarbij een extern dialysemachine dient bloed van metabole afvalstoffen van een patiënt af als hun nieren niet in staat om deze taak. Helaas, Deze ingreep heeft beperkingen, zoals lopende behandeling nodig is om te overleven. Bovendien zullen patiënten uiteindelijk vereisen een niertransplantatie, die jaren kan duren om te ontvangen zodra een patiënt op een wachtlijst wordt geplaatst. Zelfs na het verkrijgen van een niertransplantatie, vele patiënten lijden aantasting als gevolg van de behandeling en moeten deze effecten voor de rest van hun leven vechten. Deze problemen tonen de dringende behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe behandelingen ofwel voorkomen nierziekte of misschien vergroten weefselregeneratie 8,16,52,53. Gezien de duidelijke ethische beperkingen van het gebruik van menselijke proefpersonen in biomedische laboratoria diermodellen essentieel voor de studie van humane pathogenese en het testen van nieuwe behandelingen. Door de anatomische gelijkenis en evolutionaire nabijheid, is de muis de meest algemeen gebruikt model voor humane ziekten 45. Er zijn echter bepaalde beperkingen met dit dier, including onvermogen om orgel ontwikkeling in vivo en de uitvoerbaarheid van de voltooiing van grootschalige genetische screens visualiseren. Zebravis zijn relevant en nuttig modelorganisme voor de studie van orgaanontwikkeling en modellering van menselijke ziekten 45,46. Met betrekking tot ziekten bij de mens, functionele homologen in zebravis bestaan ​​voor bijna 70% van alle menselijke genen 54,55. Recent werk heeft gewezen op het nut van de zebravis voor veel gebieden van onderzoek nier 31,37,56. Studies van regeneratie en reparatie in zebravis na AKI suggereren dat tubulus epitheel regeneratie en neonephrogenesis zijn twee processen die zich voordoen en overlap de hele regeneratie tijdsverloop 30,37. Het gebruik van een aminoglycoside antibioticum gentamicine is gebruikt als een blessure paradigma, waardoor de uitkomsten van AKI studeren in volwassen zebravissen 29,30,37. Meer dan een ongeveer twee weken tijd na letsel door gentamicine, de proximale Tubules regenereren, en ondertussen nieuwe nefronen vormen het hele orgel 29,30,37. In het algemeen zijn de mechanismen die de epitheliale regeneratie reguleren blijven zeer controversieel. In een voorgestelde mechanisme van het herstelproces is er de initiële acute schade event gevolgd door afwerpen van dode cellen in het lumen. Vervolgens is er een aantal de-differentiatie, proliferatie en migratie gebeurtenissen, waarna nieuwe cellen differentiëren herbevolken gewonden basaalmembraan en functieherstel de verwonde plaats. Als alternatief hebben andere studies gesuggereerd dat vervangende cellen ontstaan ​​uit stam / voorlopercellen die binnen nefron buisjes wonen. Met betrekking tot het proces van neonephrogenesis in de zebravis, hebben cellulaire aggregaten waargenomen volgende AKI door gentamicine injectie 29,30. Deze aggregaten later rijpen in nieuwe nefronen die regelrecht in reeds bestaande tubuli 29,30. De rode draad die nefron epitheliale regeneratie en neonephr verenigtogenesis is hun pure mysterie factor: op dit moment zijn er exponentieel meer vragen over hoe deze regeneratieve staaltjes optreden dan er beschikbaar zijn inzichten. Tot op heden, echter, een aantal spannende lijnen van bewijs ondersteunen het idee dat de nieren regeneratie onderzoek met behulp van zebravis inderdaad kan bieden relevante vergelijkende inzichten in de menselijke AKI dat ook kan hebben directe translationeel potentieel 56-58. Chemical screening kleine moleculen die de proliferatie van renale progenitorcellen in de zebravis embryo recent geleid tot de identificatie van de histone deacetylase inhibitor methyl-4-(fenylthio) -butanoate (m4PTB) 56,57 verhogen identificeren. Toediening van deze verbinding bij de zebravis larven met gentamicine geïnduceerde AKI bleek dat larvale overleving stijgt en dat de renale tubulaire proliferatie werd versterkt 56,58. Bij muizen met matige ischemie geïnduceerde AKI werden behandeld met m4PTB, werd hun herstel versneld association met een reductie van zowel tubulaire atrofie en celcyclus van prolifererende renale tubulaire cellen 58. Deze bevindingen suggereren dat de routes die verantwoordelijk zijn voor de normale zebravis nier ontwikkeling en / of de regeneratieve respons op AKI worden geconserveerd met zoogdieren 56. Dus, terwijl verdere studies nodig zijn om te plagen elkaar de mechanismen van regeneratie-namelijk de signaalwegen die betrokken zijn te identificeren en begrijpen van hun interacties-de zebravis biedt een veelbelovende weg om deze belangrijke doelstelling op het gebied nefrologie streven. Instrumenten zoals het nefron cel labels in dit protocol beschreven vertegenwoordigen een groep assays die kunnen worden gebruikt om renale samenstelling en functionaliteit evalueren AKI modellen. Verder, kunnen ze worden toegepast om transgene modellen van nierziekte karakteriseren en kunnen manieren om chemische therapieën kunnen bevorderen herstel van nefron structuur na renale dam te identificerenleeftijd.

De nier is een complex orgaan dat een veelvoud van fysiologische functies in het lichaam vervult. De belangrijkste functie van de nieren is metabolisch afval uitscheiding, en deze taak is nauw verweven met het onderhoud van de vloeistof homeostase. De nier voert deze banen door het filteren van het bloed en de vorming van urine, terwijl gelijktijdig het reguleren van de bloeddruk, elektrolyten en zuur-base-evenwicht. Zeer gespecialiseerde epitheliale tubuli genaamd nefronen dienen als de basis-functionele eenheid van de nier 1,2. Bij volwassen gewervelde dieren, zijn nefronen meestal georganiseerd in een strak opgerold arrangement rondom een ​​centraal afvoersysteem, waardoor voor vele buisjes in te pakken in de vrij kleine orgel. Zo kan elke humane nier meer dan 1 miljoen nefronen 3 bevatten. Andere zoogdieren als de muis te bezitten in de orde van 8-10.000 nefronen per nier 4. De mate van verminderde complexiteit verschilt deze zoogdieren en andere vertwaterdieren gevolg van variaties in totaal nefron aantal en de architectonische ontwerp binnen de nier. Gewervelde species vormen wel drie opeenvolgende nier structuren tijdens de ontwikkeling, en iedere displays toenemende complexiteit wat nefron schenking en opstelling: de pronephros, mesonephros en metanefros. De laatste renale structuur te behouden dient als de volwassen nier orgel-meestal een mesonephros of een metanefros 2. Elke nier vorm, echter, een nefron-gebaseerde samenstelling 2. De nefron is het werkpaard van de nieren en is verantwoordelijk voor bloedfiltratie naast metaboliet secretie en reabsorptie. Nefronen zijn eenvoudige buisvormige structuren bestaat uit epitheliale cellen en hebben een segmentale organisatie, waarbij discrete, zeer gespecialiseerde domeinen van gedifferentieerde epitheel te voeren specifieke taken. In de volgorde van filtraat stroom door het nefron zijn er meestal drie belangrijke onderdelen die comprise elke eenheid: (1) de renale lichaampje, (2) een buisjes met proximale, intermediate, en distale segmenten, en (3) een verzamelen kanaal 1. Het proximale tubulus is verantwoordelijk voor de reabsorptie van organische opgeloste stoffen, met name glucose en aminozuren 1. De tussenliggende tubulus (of lus van Henle) is een belangrijke plaats van zout en water regelgeving 1. Tot slot, fine-tuning van zout en andere ionen optreedt in de distale tubulus en verzamelen van kabelgoten en is sterk gereguleerd door het endocriene systeem 1. Vandaar, het filtraat reist door de ureter en blaas, uiteindelijk verlaten het lichaam als een afvalproduct 1. Het verlies van de nierfunctie kan het gevolg zijn van een veelheid van oorzaken die de normale nefron activiteit te voorkomen. Deze oorzaken kunnen optreden tijdens de ontwikkeling nier, bijvoorbeeld aangeboren afwijkingen die leiden tot misvorming van nefronen 5, of oorzaken van verschillende soorten schade (als gevolg van zowel genetische en environmental afkomst). Verworven letsels zijn over het algemeen gecategoriseerd als acute nierschade (AKI) of chronische nierschade (CKD). AKI gaat een abrupt verlies van de nierfunctie, vaak als gevolg van ischemie of toxine blootstelling 6,7. In zoogdieren, nefron epitheliale reparatie mogelijk na dergelijke verwondingen 8, en veel mensen vertonen een volledig herstel van de nierfunctie na AKI. Echter, AKI ook geassocieerd met hoge morbiditeit en mortaliteit die zijn gerapporteerd over een breed 30 - 70% incidentie bereik 6,7. CKD daarentegen wordt geassocieerd met progressieve verlies van nierfunctie dat resulteert uit jaren langdurige schade doorgaans geassocieerd met fibrose 8,9. Verder bestaat er een wisselwerking tussen AKI en CKD, hetzij als men een individu kan predisponeren tot overige 10-12. Bijvoorbeeld, degenen die hebben geleden onder AKI zijn vatbaarder voor CKD en zelfs de dood 13. De incidentie van een nierziekte, zowel in de VS en wereldwijd, heeft epidemiolo bereiktmic proporties en zal naar verwachting toenemen als de bejaarde populatie breidt-daarom is er een groeiende behoefte aan regeneratieve geneeskunde interventies te identificeren voor de nieren 14,15. Ondanks de wetenschap dat AKI-patiënten kan herstellen, is het al lang gedacht dat de nier is een orgaan zonder aangeboren regeneratieve krachten. Deze traditionele visie is drastisch herzien in de afgelopen jaren 16. Studies die nierbeschadiging in muizen en ratten na AKI gebleken dat nefron tubulus epitheelcellen kunnen prolifereren en herbouwen functionele nefronen 17-20. Hoewel zoogdieren bezitten dit adaptief vermogen om nefronen regenereren, zijn er opvallende beperkingen en maladaptieve reacties kunnen worden veroorzaakt die leiden tot nier fibrose en CKD 21. Bijvoorbeeld, een recente studie heeft aangetoond dat herhaalde epitheelcellen ablatie in murine nefronen werd geassocieerd met verminderde regeneratie en renale fibrose suggereert nefronen havea beperkt regeneratie drempel 22. Er is geen bewijs dat de volwassen zoogdieren nier vormt nieuwe nefronen om verloren of beschadigde te vervangen, waardoor hun vernietiging leidt tot een permanente nefron tekort 8,9. Interessant is dat sommige gewervelde dieren reageren op AKI door regeneratie van nefron epitheel en ook de productie van nieuwe nefronen, een proces dat ook als neonephrogenesis of nefron neogenese 23. Neonephrogenesis komt voor in vis na blootstelling toxine of gedeeltelijke resectie, en letsel modellen hebben in het verleden onder meer de goudvis 24,25, tilapia 26, skate 27, medaka 28, en meer recent, de zebravis 29,30. Van deze zebravis zorgen voor een levensvatbaar genetisch onderzoek model om de cellulaire en moleculaire routes die verantwoordelijk zijn voor renale regeneratie ontdekken. In deze video artikel laten we zien hoe je nefron segmenten labelen in volwassen zebravissen. Kennis van nefron anatomie, moleculaire eigenschappen,en functionele kenmerken zijn essentieel voor een succesvolle toekomst renale studies met behulp van de zebravis. De volwassen zebravissen nier is een mesonephros structuur en is inherent minder complex qua nefron aantal en organisatie dan de metanefros structuur gevonden bij volwassen zoogdieren, avians, en reptielen 31. Echter, zebravis nefron segmentorganisatie is analoog aan zoogdieren, en werd eerst gedocumenteerd in de embryonale nier gebaseerd op genexpressie studies 31-35. Zebravis embryo nefronen bevatten lineaire tubulus segmenten die de proximale tubulus (PCT) bevatten rechte proximale tubulus (PST), distale vroeg (DE) en distale eind (DL) 31-35 (Figuur 1). Zebravis volwassen nefronen bezitten gelijkaardige buisvormige segmenten 30,31,36,37 (figuur 1). De PCT kan ook worden geïdentificeerd door een functionele fenotype: epitheelcellen in de PCT zal fluorescent gelabelde dextran verbindingen (10-70 kDa groot) aanwezig in het verwerkencirculatie, die is gebruikt in zowel de embryonale en volwassen zebravissen nier endocytotische opname bepalen van deze proximale tubulus cellen 38-41 (Figuur 1). Een verschil in nefron segmenten tussen zebravis en zoogdieren is dat de zebravis ontbreekt een intermediaire tubulus of lus van Henle 30-37; aangezien dit segment functies in zoogdieren om water te besparen, en de zebravis zijn een zoetwatervis zonder een dringende noodzaak om hun urine te concentreren, is het niet verwonderlijk dat de zebravis ontbreekt dit segment 32,33. Zo wordt de totale nefron samenstelling grotendeels geconserveerd tussen de zebravis en zoogdieren nier 32,33. Deze overeenkomsten hebben gesteld zebravis een doeltreffend onderzoeksinstrument de functies van renale expressie gebrachte genen te onderzoeken gedurende ontwikkelings nefrogenese 32-35,42 en modelleren vele nierziekten 43,44, nog afgezien van de aanzienlijke lijst van menselijke aandoeningen die kunnen plaatsvindt onderzocht middelszebravis 45,46. Vandaag de dag, de volwassen zebravissen nier is een aantrekkelijk model voor vergelijkende studies van de nierfunctie regeneratie vanwege de genetische volgzaamheid en het uitbreiden van het gehemelte van de beschikbare technologische hulpmiddelen om de functie van genen en signaalwegen ondervragen in deze soort. Verschillende studies hebben de zebravis mesonephros gebruikt om de mechanismen van regeneratie na AKI 29,30,37 onderzoeken. Voor voortgezet AKI onderzoek met behulp van de volwassen zebravissen nier, is het essentieel om verfijnde methoden om verschillende nefron regio&#39;s en methoden te labelen om nefron functionaliteit enquête hebben. Verschillende methoden voor volwassen nier analyse zijn op basis van embryonale nier protocollen. Intraperitoneale injectie van fluorescent gelabelde dextran in de volwassen zebravissen labelt de PCT epitheel in mesonephros nefronen via endocytose 30, zoals zebravisembryo&#39;s 38-41 (Figuur 1). Deze werkwijze is gebruikt om visualize wanneer proximale tubuli weer hun reabsorbing pand volgende AKI, die een beoordeling van de herstelde fysiologische functie 30 (figuur 1) mogelijk maakt. Een ander kenmerk van het nefron proximale tubulus is dat de epitheelcellen in dit segment een borstel rand 37 die hoge niveaus van endogene alkalische fosfatase activiteit toont bezitten. Aldus kan het proximale epitheel visueel worden gelokaliseerd in de volwassen zebravissen nier met een op fluorescentie gebaseerde techniek die ELF- (Enzyme-gelabelde fluorescentie) -97 47. Hier beschrijven we hoe fluorescerende dextran opname assays 30,48 in de volwassen zebravissen nier, teneinde een functionele beoordeling van de proximale tubulus verkrijgen en kaart de grootte en de contouren van de tubulus segment. Vervolgens beschrijven we technieken om de proximale tubulus gebieden van de volwassen nefron voorzien van het fluorescentie merkteken alkalische fosfatase. Ten derde tonen we voor de eerste keer dat de Rhodamine-gemerkte lectine Dolichos biflorus agglutinine (DBA), die is gebruikt als een algemene merker van de verzamelbuizen in de zoogdierlijke nier 49, markeert de distale tubuli van de volwassen zebravissen nier. Als DBA is wederzijds exclusief voor alkalische fosfatase vlekken, deze labels bieden een manier om in grote lijnen te onderscheiden pan-proximale versus pan-distale delen van de volwassen zebravissen nefron. Tijdens de uitvoering van deze fluorescerende vlekken in zowel hele mount en cryostaat histologische coupes, correleren we deze labels met expressie domeinen van opgeloste transporter genen die eigen is aan elke nefron segment. Daarom is dit protocol bevat ook een handleiding voor de gemodificeerde weefselverwerking procedures voor volwassen weefsel ganse berg in situ hybridisatie (WISH)-analyse op basis van onze embryo WISH protocol 50. Deze procedures kunnen worden gebruikt in verschillende combinaties (figuur 2) te documenteren morfologische en functionele of volwassen zebravissen nier nefronen. Aldus kunnen deze protocollen worden toegepast regeneratie studies, de fenotypische karakterisatie van andere nierziekte modellen en zelfs gebruikt om de vorming van de volwassen nier bestuderen.

```html
<table>
 <tbody>
 <tr>
 <td>1X PBS</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Gemaakt door het verdunnen van 10 X PBS in gedistilleerd water.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X PBST</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>0,1% Tween-20 detergent in 1 X PBS.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X PBS met 0,05 % Tween</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>0,05% Tween-20 detergent in 1 X PBS.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>American Bioanalytical</td>
 <td>AB02038</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4% PFA/1X PBS</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Los 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X PBS op, breng aan de kook op een hot plate in een afzuigingskast. Koel en bevries de aliquoten voor opslag in de vriezer op -20°C. Ontdooi net voor gebruik en bevries de voorraad niet opnieuw.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine Forceps</td>
 <td>Roboz</td>
 <td>RS-1050</td>
 <td>Dumont Pincet Patroon #55</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass slide</td>
 <td>Thermo-Fisher</td>
 <td>4445</td>
 <td>White Frost</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass coverslip</td>
 <td>Thermo-Fisher</td>
 <td>12-540A</td>
 <td>18 x 18 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Modeling clay</td>
 <td>Hasbro</td>
 <td>Playdoh</td>
 <td>Ander modelleerklei kan worden vervangen en werkt op dezelfde manier</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slide holder</td>
 <td>Thermo-Fisher</td>
 <td>12-587</td>
 <td>Optioneel: kartonnen lade om dia's plat op te bergen</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bleaching solution</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Bleach mix formule (voor een 20 ml oplossing): 1,6 ml van 10% Kaliumhydroxide oplossing 0,6 ml van 30% Waterstofperoxide oplossing 100 μl van 20% Tween Vul tot 20 ml met gedistilleerd water</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kaliumhydroxide</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>221473</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Waterstofperoxide</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>H1009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Blocking solution</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Blocking Solution (voor een 10 ml oplossing): 8 ml van 1X PBS met 0,05% Tween 2 ml van foetaal runder serum 150 μl van DMSO</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alkaline phosphatase activiteitsdetectie</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>E6601</td>
 <td>We gebruiken de ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit. Om de werkende substraatoplossing voor te bereiden, verdunt u het substraat 20-voudig in de detectiebuffer, volgens de instructies van de fabrikant.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alkaline phosphatase wasoplossing</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Recept voor wasbufferoplossing (voor een 100 ml oplossing): 5 ml van 0,5 M EDTA 120 mg van Levamisol 95 ml van 1X PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran, fluoresceïne, 40.000 MW</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>D1844</td>
 <td>Verdun met gedistilleerd water om een 50 mg/ml stockoplossing te maken, en bewaar aliquoten in de vriezer op -20°C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran, cascade blue, 10.000 MW</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>D1976</td>
 <td>Verdun met gedistilleerd water om een 50 mg/ml stockoplossing te maken, en bewaar aliquoten in de vriezer op -20°C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran, lucifer geel, 10.000 MW</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>D1825</td>
 <td>Verdun met gedistilleerd water om een 50 mg/ml stockoplossing te maken, en bewaar aliquoten in de vriezer op -20°C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran, tetramethylrodamine (fluoro-ruby), 10.000 MW</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>D1817</td>
 <td>Verdun met gedistilleerd water om een 50 mg/ml stockoplossing te maken, en bewaar aliquoten in de vriezer op -20°C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td>
 <td>Vector laboratories</td>
 <td>RL-10-32</td>
 <td>DBA Staining Solution (voor een 100 μl oplossing): 1 μl van DBA 99 μl van 1X PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propidiumjodide</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>E6601</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DAPI</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>P1304MP</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vectashield hard set mounting medium</td>
 <td>Vector laboratories</td>
 <td>H-1400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro cover glass</td>
 <td>VWR</td>
 <td>48393081</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl sulfaat, DMSO</td>
 <td>American Bioanalytical</td>
 <td>67-68-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sucrose</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S0289</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA, 0,5 M oplossing, pH 8,0</td>
 <td>American Bioanalytical</td>
 <td>AB00502</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Levamisol</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L-9756</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue freezing medium</td>
 <td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
 <td>TFM-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10 x 10x 5 mm</td>
 <td>Sakura Finetek</td>
 <td>4565</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TruBond 380 adhesive microscope slides</td>
 <td>Tru Scientific</td>
 <td>0380W</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liquid blocker – super PAP pen</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>71312</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Immuno stain moisture chamber</td>
 <td>Evergreen Scientific</td>
 <td>240-9020-Z10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cryostat</td>
 <td>Therm</td>
 <td>Microm&trade; HM 525 Cryostat</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC;

analyse van nephron samenstelling en functie in de adult zebravis kidney

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

De zebravis model heeft zich ontpopt als een relevant systeem om ontwikkeling nieren, regeneratie en ziekte te bestuderen. Zowel de embryonale en volwassen zebravissen nieren uit functionele eenheden bekend als nefronen die sterk geconserveerd met andere vertebraten, waaronder zoogdieren. Onderzoek in de zebravis heeft onlangs aangetoond dat twee kenmerkende verschijnselen transpireren na volwassen nefronen schade lijden: ten eerste, er is robuust herstel binnen bestaande nefronen dat de vernietigde tubulus epitheelcellen vervangt; tweede, zijn geheel nieuwe nefronen geproduceerd uit renale voorouders in een proces dat bekend staat als neonephrogenesis. Daarentegen, mensen en andere zoogdieren lijken slechts een beperkte vermogen tot nefron epitheliale regeneratie hebben. Tot op heden, de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor deze nier regeneratie verschijnselen blijven slecht begrepen. Omdat volwassen zebravissen nieren ondergaan zowel nefron epitheliale regeneratie en neonephrogenesis, ze bieden een uitstekende experimentele paradigm om deze gebeurtenissen te bestuderen. Verder is er een groot aantal genetische en farmacologische hulpmiddelen op zebravis model dat kan worden gebruikt om de cellulaire en moleculaire mechanismen die nier regeneratie regelen bakenen. Een essentieel aspect van dit onderzoek is de evaluatie van nefron structuur en functie. Dit protocol beschrijft een reeks labeling technieken die kunnen worden gebruikt om renale samenstelling en testen nefron functionaliteit meten in de volwassen zebravissen nier. Aldus zijn deze werkwijzen zijn breed toepasbaar op de toekomst fenotypische karakterisatie van volwassen zebravissen nierschade paradigma, die omvatten maar zijn niet beperkt tot, nephrotoxicant blootstelling regimes of genetische methoden gerichte celdood zoals nitroreductase gemedieerde ablatie techniek. Verder kunnen deze werkwijzen worden gebruikt om genetisch verstoringen bij volwassen nier vorming bestuderen en ook kan worden toegepast op nierstatus tijdens chronische ziektemodel beoordelen.

De zebravis volwassen nier is een uitstekend systeem voor renale regeneratie en ziekte studies. Een essentieel aspect van dit onderzoek is de beoordeling van de nefron structuur en functie. Dit protocol beschrijft een aantal methoden die kunnen worden toegepast om nefron tubule samenstelling te beoordelen en om de renale reabsorptie evalueren.

Analyse van Nephron samenstelling en functie in de Adult zebravis Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de samenstelling en functionaliteit van nefronse segmenten in de nier van volwassen zebravissen te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst fluorescent gelabelde dextrine in een nest te injecteren dat zebravissen vastbindt. De tweede stap is om de nier te verwijderen en te fixeren om weefsel voor volgende labelmethoden voor te bereiden.Vervolgens wordt de nier gebleekt om pigmentatie te verwijderen en vervolgens gekleurd om de gewenste nefronse segmenten fluorescent te labelen. Resultaten worden verkregen met behulp van immunofluorescentie, microscopie en/of helderveld beeldvorming die de visualisatie van de nier anatomie mogelijk maakt op basis van de geselecteerde kleurstof of kleurstoffen. De volgende labelmethoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het niergebied met betrekking tot orgaan anatomie en kunnen worden gebruikt om de nefronse samenstelling te bestuderen en de renale functionaliteit te evalueren, zowel vóór als na een letselgebeurtenis.De implicaties van deze technieken strekken zich uit naar het onderzoek van genetische afwijkingen in de vorming van volwassen nieren en kunnen ook worden toegepast om de renale status te beoordelen tijdens het modelleren van chronische ziekten. Om te beginnen, decant de oplossing van een verdoofde vis en plaats het dier voorzichtig op een natte sponzen mal, buikzijde naar beneden. Vervolgens, vul een insulinespuit met 20 microliters ontdooid dextrine stamoplossing.Plaats de naald zodat de inbreng op een schuine hoek plaatsvindt op de ventrale middenlijn van de buik. Om de organen niet te injecteren, heft de naald net na het injecteren de lichaamswand op en creëert een ruimte waarin de oplossing kan worden geïnjecteerd. Na de injectie, plaats de vis voorzichtig terug in het aquarium om te herstellen van de narcose.Om te beginnen, decant eventuele extra oplossing weg van een verdoofde vis en plaats deze op een doek of papieren handdoek. Na het verwijderen van het hoofd en de inwendige organen, gebruik super fijne dissectie naalden om de lichaamswanden open te spelden. Lokaliseer de nier, die is gehecht aan de dorsale wand van het dier.Gebruik fijne tang om de nier los te maken van de dorsale wand. Plaats de nier voorzichtig in een glazen vijl van vijf milliliter met één XPBS en was drie keer gedurende vijf minuten elk. Verwijder de nier met een transferpipet en plaats deze op een schone glazen plaat met één tot twee druppels één XPBS.Gebruik fijne tang om de nier plat te maken op de plaat, zorg ervoor dat er geen weefsel is gekruld of anderszins op zichzelf is omgedraaid. Een tungsteendraad kan worden gebruikt om kleine sneden in het bindweefsel te maken om de platte positionering van de nier te vergemakkelijken. Plaats vervolgens kleine stukjes modelklei op elke hoek van een 18 bij 18 millimeter glazen deksel.Plaats langzaam het deksel op de nier, met een lichte hoek. Om luchtbellen te minimaliseren, voegt u eventueel een extra druppel één XPBS toe om de ruimte tussen het deksel en de glijbaan te vullen. Een aparte groep zebravissen wordt geëuthanaseerd en overnacht in fixeermiddel gedrenkt.Wanneer u klaar bent, gebruikt u fijne tang om de nier voorzichtig los te maken van de dorsale lichaamswand en plaats het orgaan in een glazen vijl. Was de gedissekteerde nier drie keer met drie tot vijf milliliter één XPBS met 0,05% tween gedurende vijf minuten elk. Vervolgens, verwijder de PBS-oplossing en spoel de nier met drie milliliter van een 5% sucrose-oplossing gedurende 30 minuten.Na deze tijd, vervang de oplossing met drie milliliter van 30% sucrose en bewaar de volgende dag overnacht bij vier graden Celsius. Verwijder de oplossing en was de nier twee keer voordat u drie tot vijf milliliter bleekoplossing toevoegt. Om de melanocyte pigmentatie die op de nier aanwezig is, te verwijderen, plaats de glazen vijl op een rotator en kijk zorgvuldig toe hoe de pigmentatie verdwijnt.Depigmentatie duurt meestal ongeveer 20 minuten, maar kan soms wel 60 minuten duren. Als de bleekoplossing te lang staat, kan desintegratie optreden en het wordt daarom geadviseerd om het monster elke 10 tot 15 minuten te controleren op integriteit wanneer de pigmentatie is verwijderd van de nier, was twee keer en incubeer met 4% PFA-oplossing gedurende één uur bij kamertemperatuur. Vervolgens, verwijder de 4% PFA-oplossing en was de nier drie keer na de laatste was bij drie tot vijf milliliter blokkerende oplossing en incubeer de nier bij kamertemperatuur gedurende twee uur.Wanneer het blokkeren voltooid is, ga direct door naar het geselecteerde kleuringsprotocol. Verwijder de blokkerende oplossing en was de nier drie keer voordat de nier in één XPBS gedurende ten minste 10 minuten wordt gedrenkt. Gedurende deze tijd, breng de nier over naar een 12 well of 24 well kweekschaal.Vervang de één XPBS met voldoende werkende alkalische fosfatas substraat oplossing om het monster te bedekken en plaats het monster op een rotator gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Na deze tijd, stop de reactie door de nier in alkalische fosfatase wasbufferoplossing te wassen. Spoel de nier met drie veranderingen van wasoplossing gedurende 10 tot 15 minuten.Vervolgens, verwijder de wasoplossing en monteer de nier op een schone glas. Schuif in de fosfatase montage medium dat is opgenomen in het labelset. Visualiseer de alkalische fosfatase gekleurde nier met behulp van een stereo microscoop of compound microscoop met een haakje verbonden aan Debbie filter set.Bereid eerst een 200 microliter werkende DBA oplossing door DBA in één XPBS te verdunnen. Vervang de PBS oplossing met 200 microliters van de DBA oplossing en plaats het monster op een rotator gedurende één uur bij kamertemperatuur. Na deze tijd, verwijder de DBA oplossing en was de nier drie keer met drie tot vijf milliliter van één XPBS gedurende vijf minuten elk.Verwijder de één XPBS en monteer de nier op een schone glas schuif. Zoals eerder gedemonstr

analysis-nephron-composition-function-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft een procedure voor het identificeren en ontleden van organen van de volwassen zebravissen.

Dissectie van organen van de Adult zebravis

De zebravis nier is de thuisbasis van zowel de nier-en hematopoietische volwassen stamcellen / progenitorcellen, en vormt een uitstekende gelegenheid om deze celtypen en hun nakomelingen studie in een gewerveld modelorganisme. Hier tonen we een gedetailleerde dissectie procedure die de onderzoeker in staat stelt te identificeren en chirurgisch te verwijderen van de volwassen zebravissen nieren, die kunnen worden gebruikt voor toepassingen zoals celisolatie, transplantatie, en expressie studies...

Dissectie van de Adult zebravis Kidney

Acute nierschade (AKI) bij de mens is een veel voorkomend klinisch probleem wordt veroorzaakt door schade aan de epitheliale cellen die de nieren nefronen bevatten, en de AKI wordt geassocieerd met een hoge sterfte van...

Laser Ablatie van de zebravis Pronephros renale epitheliale regeneratie Study

This video demonstrates the dissection and preparation of a flat mount of the adult zebrafish kidney. The prepared flat mount can be visualized under the microscope for specimen analysis.

Kidney Flat Mount Preparation: A Procedure to Dissect and Prepare a Flat Mount for Microscopic Analysis of Adult Zebrafish Kidney

In this video, we demonstrate the depigmentation of adult zebrafish kidney and its subsequent preparation for staining procedures. Post-staining, the adult zebrafish kidney can be used for studying kidney regeneration, phenotypic characterization of renal disease models, and nephron functionality.

Depigmentation and Prestaining of Zebrafish Kidney: A Technique to Prepare Adult Zebrafish Kidney for Staining

Hier presenteren we een betrouwbare methode om regeneratie van volwassen nieren te bestuderen door acute nierbeschadiging te induceren door gentamicine-injectie. We tonen aan dat de schade afhankelijk is van de gentamicine-dosering en de omgevingstemperatuur door middel van in situ hybridisatie om lhx1a+ zich ontwikkelende nieuwe nephronen te labelen.

Nier Regeneratie in Adult zebravis door Gentamicin geïnduceerd letsel

De zebravis is een populaire tool voor het modelleren chronische nierziekte (CKD). Echter, hun kleine formaat maakt het onmogelijk om de nierfunctie te evalueren met behulp van traditionele methoden. We beschrijven een fluorescerende kleurstof nier speling assay 1 dat kwantitatieve analyse van de zebravis nierfunctie bij CKD maakt.

Evaluatie van de zebravis Kidney Functie Met behulp van een TL-Ontruiming Assay

De hier beschreven methode maakt time-lapse analyse van orgaanontwikkeling in zebravisembryo's met behulp van een fluorescentie microscoop ontleden kan uitvoeren optische sectie en simpele strategieën afstelling van focale vlak drift corrigeren.

Analyse van de zebravis Kidney Development met Time-lapse Imaging Met behulp van een dissectie microscoop Uitgerust voor Optische-Sectie

Renal verwondingen opgelopen van nephrotoxins, die drugs, variërend van antibiotica tot chemotherapeutica omvatten, kan leiden tot complexe aandoeningen waarvan de pathogenese blijft onvolledig begrepen. Dit protocol laat zien hoe zebravis kan worden gebruikt voor ziektemodel van deze aandoeningen, die kunnen worden toegepast voor het identificeren van renoprotectieve maatregelen.

Nefrotoxische substantie Micro-injectie in zebravis tot acuut nierfalen Model

Dit protocol beschrijft de procedures om acute nierschade (AKI) te veroorzaken bij volwassen zebravissen met cisplatine als nefrotoxisch middel. We beschreven de stappen om de reproduceerbaarheid van de techniek te evalueren en twee technieken om respectievelijk ontsteking en celdood in het nierweefsel, flowcytometrie en TUNEL te analyseren.

Acuut nierletselmodel geïnduceerd door Cisplatine bij volwassen zebravissen

De zebravis is een belangrijk model voor het begrijpen van de nierontwikkeling. Hier wordt een in situ hybridisatieprotocol geoptimaliseerd om genexpressie in zebravislarven en juvenielen te detecteren tijdens de ontwikkeling van mesonephros.

In situ Hybridisatie in zebravislarven en juvenielen tijdens mesonephrosontwikkeling

Leer fluorescente labeltechnieken om nefronsegmenten in de nier van volwassen Danio rerio te visualiseren. Deze methoden ondersteunen onderzoek naar nieranatomie, functie en regeneratie.

Analyse van Nephron samenstelling en functie in de Adult zebravis Kidney

Meer video's verkennen