Evaluatie van de zebravis Kidney Functie Met behulp van een TL-Ontruiming Assay

Het algemene doel van deze procedure is om een kwantitatief nierfunctieonderzoek bij zebravis te genereren. Dit wordt bereikt door eerst zebravis-embryo's te anesthetiseren bij 72 HPF. Vervolgens worden de embryo's overgebracht naar een injectievorm en georiënteerd zodat hun harten zich links van het gezichtsveld bevinden.

Vervolgens wordt de pericardiale holte geïnjecteerd met een rumine dextra fluorescerende kleurstof en worden fluorescente beelden van het hartgebied vereist met behulp van een epi-fluorescentie dissectiemicroscoop. Uiteindelijk wordt de nierklaring van een fluorescerende kleurstof beoordeeld met behulp van epi-fluorescentiemicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een kwantitatief resultaat van zebravis-nierfunctie produceert zonder dat er bloed- of urinetests nodig zijn, wat bij zebravissen niet mogelijk is.

Deze methode biedt een krachtig hulpmiddel voor het evalueren van nierfunctie in ziektemodellen van zebravis. Nadat de naalden zijn getrokken en een mal is voorbereid volgens het tekstprotocol, giet je de mal door eerst een 2% aro-oplossing gemaakt in vissenwater in een 90 millimeter petrischaal. Plaats de mal op de petrischaal, zodat de gestapelde glijranden onder een hoek onder het agro-oppervlak kunnen worden ondergedompeld.

Laat het 30 minuten stollen. Verwijder de glijvorm en gebruik vers vissenwater met trica-anesthesie in een verhouding van één tot 25. Om de glijvorm te bedekken, wordt een aro-vorm gedrukt om zebravis-injecties van fluorescerende kleurstof uit te voeren.

Gebruik een standaard micro-injectieopstelling bestaande uit een luchtcompressor verbonden met een drukregelaarsysteem dat voeding geeft aan een rechte pipettenhouder voor gebruik met capillairen met een buitendiameter van 1,0. De pipettenhouder moet worden ondergebracht in een MN 33 compact. Drie-as controle micromanipulator bevestigd aan een stalen basisplaat door een magnetische standaard gebruik dissectiemicroscoop om embryo's te visualiseren, manipuleren en injecteren terwijl zebravissen worden gebruikt onder de standaardvoorwaarden zoals beschreven in het tekstprotocol.

Gebruik wildtype of transgene zebravislijnen die geschikt zijn voor het experiment. Handhaaf een vishachtigheid van 15 mannetjes op 15 vrouwtjes per acht liter tank om ervoor te zorgen dat maximaal eieren worden verzameld zonder de vissen te storen. Dompel kweektanks in wilde type kweektanks de avond voor het verzamelen.

Op de dag van verzamelen, geef de vissen 30 tot 40 minuten om te kuit te zetten. Gebruik vervolgens een gaasfilter en vers aquariumwater om de eieren te verzamelen en te spoelen. Deponeer de gereinigde eieren in een 90 millimeter petrischaal met embryomedium en incubeer bij 28,5 graden Celsius om myogenese te remmen.

Na acht uur. Na bevruchting of HPF. Breng de levensvatbare embryo's in minimaal vloeistof over naar verse petrischalen met een tot 100 PTU naar embryomedium en incubeer verder bij 28,5 graden Celsius.

Gebruik een fijne pincet om het uiteinde van de naald te breken. Vervolgens verplaats de RD naar het puntje van de naald door de pulsduur te maximaliseren tot de minuutstand. Wanneer de oplossing het puntje bereikt, schakel terug naar milliseconden.

Plaats een micrometer op de microscooptafel en pas met de drukregelaar en verfijningen aan het puntje van de naald de grootte van de uitgedreven druppel aan op 100 micron in diameter of een volume van 0,5 nanoliters vóór de injectie. Zet 2 35 millimeter petrischalen op. Elk bevat vijf milliliter embryomedium, label één trica en de andere herstel.

Voeg 200 microliter stock trica toe aan de trica gelabelde schaal. Zodra u klaar bent om te injecteren, selecteert u een individueel embryo bij 72 HPF. Breng minimaal vloeistof over naar de trica-schaal en controleer de activiteit van het embryo.

Zodra het embryo is verdoofd, breng het over naar de injectievorm en richt het in de trog zodat de linkerkant naar boven is gericht. Positioneer het hart aan de linkerkant van het gezichtsveld. Om de RD in het hart te injecteren, gebruikt u de naald om het pericardium te doorboren en injecteert u één nanoliter RD in de pericardiale holte.

Na het terugtrekken van de naald, brengt u het geïnjecteerde embryo in minimaal vloeistof over naar de herstelplak en controleert u gedurende één minuut. Breng vervolgens het individuele embryo over naar een 24-wellplaat met één milliliter vers embryomedium met PTU en label op de juiste manier. Na het injecteren van ten minste 10 embryo's per experimentele groep, incubeer gedurende drie uur bij 28,5 graden Celsius.

Bij drie uur na injectie of HPI worden embryo's verdoofd zoals eerder beschreven. En overbrengen naar een 35 millimeter petrischaal met 3%methylcellulose. Duw de embryo's voorzichtig in de methylcellulose en oriënteer ze zodat de laterale kant kan worden afgebeeld.

Met behulp van een emissiefilter van 570 nanometer voor UV-licht, verkrijgt u een afbeelding van het embryo. Laat het embryo herstellen voordat u het in de aangewezen put plaatst, verzamel afbeeldingen voor alle geïnjecteerde embryo's en zet vervolgens de incubatie voort bij 28,5 graden Celsius. Na het verkrijgen van een tweede ronde afbeeldingen bij 24 HP, gebruik ik Image J-software om de fluorescentie-intensiteit van elk geïnjecteerd embryo te kwantificeren door een afbeelding te openen en een interessegebied of ROI op te geven.

Door edit-selectie te kiezen, specificeert u en stelt u de waarde in op 100 vierkante pixels. Plaats het hart in het centrum van de ROI en kies analyseren, stel metingen in en stel de metingen in om gemiddelde grijstinten en oppervlakte te omvatten. Neem vervolgens de meting, kwantificeer de fluorescentie voor elke set afbeeldingen bij drie HPI en 24 HPI per embryo en draag de gemiddelde grijstinten waarden over naar een spreadsheet voor verdere verwerking.

Gebruik geschikte software om statistische analyses uit te voeren en groepen te vergelijken op statistische significantie met behulp van de student's T-test zoals hier getoond. Injectie van RD in bbbs negen Morpho geïnjecteerde vissen resulteerde in 40%