Evaluatie van de zebravis Kidney Functie Met behulp van een TL-Ontruiming Assay

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van een kwantitatieve assay voor de nierfunctie bij zebravissen. Dit wordt bereikt door eerst zebravissenembryo's op 72 HPF te anesthetiseren. Vervolgens worden de embryo's overgebracht naar een injectievorm en georiënteerd zodat hun harten zich links van het gezichtsveld bevinden.

Vervolgens wordt de pericardiaalholte geïnjecteerd met een fluorescerende rumine dextran-kleurstof en worden er met een epifluorescentie-dissectiemicroscoop fluorescerende beelden van de hartregio gemaakt. Ten slotte wordt de renale klaring van de fluorescerende kleurstof beoordeeld met behulp van epifluorescentiemicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een kwantitatieve meting van de nierfunctie van zebravis oplevert zonder dat er bloed- of urinestests nodig zijn, aangezien deze bij zebravis niet mogelijk zijn.

Deze methode biedt een krachtig instrument voor het evalueren van de nierfunctie in ziektemodellen van zebravissen. Nadat de naalden zijn verwijderd en een mal is voorbereid volgens het tekstprotocol, wordt de mal gegoten door eerst een 2% aro-oplossing, bereid in viswater, in een petri-schaal van 90 millimeter te gieten. Plaats de mal op de petri-schaal, zodat de gestapelde randen van de objectglaasjes onder een hoek onder het agro-oppervlak onderdompelen.

Laat het 30 minuten uitharden. Verwijder de gietvorm van het objectglas en gebruik vers aquariumwater met trica-anesthesie in een verhouding van 1:25. Bedek het objectglas met afgedrukte vinnen om injecties van fluorescerende kleurstof bij zebravissen uit te voeren.

Gebruik een standaard micro-injectieopstelling bestaande uit een luchtdrukcompressor die is verbonden met een drukregelsysteem, dat vervolgens is aangesloten op een rechte pipethouder voor gebruik met capillairen met een buitendiameter van 1,0. De pipethouder moet zijn ondergebracht in een MN 33 compact. Gebruik een drie-assige micromanipulator, bevestigd aan een stalen basisplaat met een magnetische standaard, en een dissectiemicroscoop om embryo's te visualiseren, te manipuleren en te injecteren, terwijl de zebravis wordt gehouden onder standaardcondities zoals beschreven in het tekstprotocol.

Gebruik wild-type of transgene zebravislijnen, afhankelijk van het experiment. Houd een bezettingsgraad aan van 15 mannetjes en 15 vrouwtjes per aquarium van acht liter om ervoor te zorgen dat er maximaal eieren worden verzameld zonder de vissen te storen. Plaats de kweekbakken de avond voor de verzameling in de wild-type stamaquaria.

Laat de vissen op de dag van collectie 30 tot 40 minuten kaviaren. Gebruik vervolgens een zeef en vers aquariumwater om de eitjes te verzamelen en te spoelen. Plaats de gereinigde eitjes in een Petri-schaal van 90 millimeter met embryonium en incubeer deze bij 28,5 °C om myogenese te remmen.

Na acht uur post-fertilisatie (HPF), worden de levensvatbare embryo's met een minimale hoeveelheid vloeistof overgebracht naar schone petrischalen met embryo-medium dat 1 tot 100 PTU bevat, waarna ze verder worden geïncubeerd bij 28,5 °C.

Gebruik fijne pincetten om het uiteinde van de naald af te breken. Verplaats vervolgens de RD naar de punt van de naald door de pulsduur te maximaliseren naar de minuteninstelling. Wanneer de oplossing de punt bereikt, schakelt u terug naar milliseconden.

Plaats een micrometer op de objecttafel van de microscoop en stel, met behulp van de drukregelaar en fijninstellingen van de naaldpunt, de grootte van de uitstootdruppel vóór injectie in op 100 micron in diameter of een volume van 0,5 nanoliter. Zet twee Petrischalen van 35 millimeter klaar, elk gevuld met vijf milliliter embryo-medium; label de ene als 'trica' en de andere als 'recovery'.

Voeg 200 µL stock trica toe aan de als trica gelabelde schaal. Wanneer u klaar bent om te injecteren, selecteer dan een individueel embryo bij 72 HPF. Breng een minimale hoeveelheid vloeistof over naar de trica-schaal en volg de activiteit van het embryo.

Zodra het embryo is geanestheseerd, wordt het overgebracht naar de injectiemallen en in de goot georiënteerd zodat de linkerzijde naar boven is gericht. Positioneer het hart aan de linkerzijde van het gezichtsveld. Om de RD in het hart te injecteren, wordt de naald gebruikt om het pericard te doorboren, waarna één nanoliter RD in de pericardiale holte wordt geïnjecteerd.

Nadat de naald is teruggetrokken, wordt het geïnjecteerde embryo in een minimale hoeveelheid vloeistof overgebracht naar het herstelschaaltje en gedurende één minuut gemonitord. Breng het individuele embryo vervolgens over naar een 24-wells plaat met één milliliter vers embryo-medium dat PTU bevat en label deze op de juiste wijze. Nadat er ten minste 10 embryo's per experimentele groep zijn geïnjecteerd, worden deze drie uur lang geïncubeerd bij 28,5 °C.

Drie uur na injectie (HPI) werden de embryo's geanestheseerd zoals eerder beschreven. Vervolgens werden ze overgebracht naar een Petri-schaal van 35 millimeter met 3% methylcellulose. Druk de embryo's voorzichtig in de methylcellulose en oriënteer ze zodanig dat de laterale zijde kan worden gefotografeerd.

Leg een afbeelding van het embryo vast met een emissiefilter van 570 nanometer voor UV-licht. Laat het embryo herstellen voordat u het terugplaatst in de daarvoor bestemde well; leg afbeeldingen vast van alle geïnjecteerde embryo's en laat deze vervolgens verder incuberen bij 28,5 °C. Na het vastleggen van een tweede ronde afbeeldingen bij 24 HP gebruik ik ImageJ-software om de fluorescentie-intensiteit van elk geïnjecteerd embryo te kwantificeren door een afbeelding te openen en een region of interest (ROI) te specificeren.

Kies voor 'edit selection', specificeer de selectie en stel de waarde in op 100 vierkante pixels. Positioneer het hart in het midden van de ROI en kies 'analyze', ga naar 'set measurements' en stel de metingen zo in dat de gemiddelde grijswaarde en het oppervlak worden opgenomen. Voer vervolgens de meting uit, kwantificeer de fluorescentie voor elke set afbeeldingen bij 3 HPI en 24 HPI per embryo en draag de gemiddelde grijswaarden over naar een spreadsheet voor verdere verwerking.

Gebruik geschikte software om statistische analyses uit te voeren en groepen te vergelijken op statistische significantie met behulp van de student's T-test, zoals hier wordt getoond. Injectie van RD in bbbs nine Morpho-geïnjecteerde vissen resulteerde erin dat 40% van de embryo's vijf dagen na bevruchting prone fric-cysten ontwikkelde. Daarnaast vertoonden de morphin-vissen een verminderd vermogen om de fluorescerende kleurstof te klaren na 24 HPI in vergelijking met de controles.

Een groep van 10 vissen kan eenmaal binnen 15 minuten worden geïnjecteerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de optische transparantie van zebravissen kunt benutten om de temporele klaring van een micro-geïnjecteerde fluorescerende kleurstof kwantitatief te monitoren als een effectieve readout voor de nierfunctie van de zebravis.