Van Voxels to Knowledge: Een praktische gids voor de segmentatie van Complex Electron Microscopy 3D-Data
August 13th, 2014
De bottleneck voor mobiele 3D-elektronenmicroscopie is feature extractie (segmentatie) in zeer complexe 3D-density maps. We hebben een set van criteria, waarin aanbevelingen worden gedaan met betrekking tot welke segmentatie aanpak (handmatig, semi-automatisch of automatisch) is het meest geschikt voor verschillende soorten data ontwikkeld, en zo een uitgangspunt voor effectieve segmentatie.
Het algemene doel van het volgende experiment is om kenmerken van interesse te segmenteren uit complexe 3D-elektronenmicroscopie-datasets van cellen en weefsels voor analyse van hun 3D-organisatie. Dit wordt bereikt door een dataset te verzamelen die bestaat uit individuele elektronenmicroscoopbeelden. De ruwe 2D-gegevens worden vervolgens geconstrueerd in een 3D-volume en gefilterd om ruis te verminderen en kenmerken van interesse te versterken. Als tweede stap worden de objectieve en subjectieve kenmerken van de gegevens beoordeeld om de beste methode voor segmentatie te informeren.
Vervolgens worden handmatig geabstraheerde, modelgeneratie, handmatig traceren van kenmerken van interesse. Geautomatiseerde dichtheid-gebaseerde segmentatie of op maat gemaakte geautomatiseerde segmentatie uitgevoerd om de kenmerken van interesse te extraheren. De resultaten tonen de definitieve 3D-gesegmenteerde modellen van kenmerken van interesse op basis van het triëren van beeldkenmerken en persoonlijke doelen om de optimale segmentatiebenadering te kiezen.
Een vergelijking tussen de verschillende benaderingen voor de verschillende datasets zal helpen bij het selecteren van de juiste segmentatiestrategie. We demonstreren verschillende methoden voor de extractie van kenmerken van interesse. Gezien de complexiteit van subcellulaire elektronenmicroscopie-volumes, heeft elke aanpak zijn voordelen en beperkingen.
Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn in segmentatie worstelen omdat het identificeren van de beste aanpak voor verschillende datasets niet altijd duidelijk is. Samen met het uitlaten van afgestudeerde studenten. Tai die de procedure zal demonstreren, zal BU als een postdoc zijn.
In mijn laboratorium wordt handmatig geabstraheerde modelgeneratie gebruikt wanneer het enige doel is om een geometrisch model te maken om geometrische metingen te doen. Om te beginnen, importeer de gegevensvolume in een geschikt programma. Voor handmatig geabstraheerde modelgeneratie wordt in deze demonstratie kymera-software gebruikt.
Selecteer eerst het bestand en open het om het open bestandsdialoogvenster te openen, navigeer naar de bestandslocatie van de gewenste kaart. Trek vervolgens de volumeviewer omhoog en selecteer functies weergavestijl om gegevens weer te geven met verschillende weergavestijlen. Pas de drempelwaarde voor de weergave aan door de verticale balk op de histogram in het volumeviewer-venster te slepen.
Navigeer door het 3D-volume om een gebied van interesse voor segmentatie te selecteren en een kleiner subvolume uit te knippen indien nodig. In het volumeviewer-dialoogvenster, selecteer functies, subregioselectie, klik en sleep om een rechthoekige doos rond het gebied van interesse te maken. Plaats vervolgens markers langs de functie van interesse en verbind ze met linkers waar dit gepast is totdat het model compleet is.
Om dit te bereiken vanuit de volumeviewer-menubalk, selecteer tools, volumetracer dialoog. Om de volumetracer-dialoog daar te openen, selecteer bestand, nieuw marker.Set. In de volumetracer-dialoog, controleer muis, plaats markers op hoge dichtheid, plaats markers op gegevens, vlakken verplaatsen en ize markers link nieuwe marker naar geselecteerde marker en link achtereenvolgens geselecteerde markers.
Selecteer vervolgens in het volumetracer-venster plaats markers met de rechtermuisknop en voeg radii voor markers en links in. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op de volumegegevens om markeringen te plaatsen. Markers worden automatisch verbonden in het volumetracer-dialoogvenster.
Selecteer bestand, sla huidige marker. Set vervolgens bestand sluiten marker.Set. Open een nieuwe markerset om een model in een tweede gewenst kenmerk van interesse te beginnen bouwen.
Gebruik contrasterende kleuren tussen markersets om verschillen in kenmerken te benadrukken. Handmatig traceren van kenmerken van interesse is een tijdrovende aanpak die wordt gebruikt wanneer de populatiedichtheid relatief klein is en wanneer nauwkeurigheid van functie-extractie van het grootste belang is. Om te beginnen importeer volumegegevens in een programma met handmatige traceeropties.Software.
Met deze mogelijkheid bieden we over het algemeen een basisverfpenseeltool. In deze demonstratie wordt Amira-software gebruikt voor grote tomos. Selecteer open gegevens en klik met de rechtermuisknop op bestandsnaam rec.
Klik vervolgens op formaat, selecteer raw als grote schijfgegevens. Oké, en laad. Selecteer geschikte raw-gegevensparameters van header-informatie en klik op oké.
Schakel en sla op als een nieuwe bestandsnaam. am-bestand. Voor 3D-beeldsequentie, selecteer open gegevens en selecteer bestandsnaam tiff of bestandsnaam dot mrmc.
Schakel vervolgens, klik met de rechtermuisknop en selecteer opslaan als bestandsnaam am. In het 3D-viewer-venster, selecteer ortho slice om het beeldbestand te openen. Gebruik vervolgens een schuifbalk aan de onderkant om door de plakjes te navigeren om grotere gegevens te bijsnijden die zijn geopend als grote schijfgegevens.
Schakel de bestandsnaam in het pool-venster, klik met de rechtermuisknop en selecteer rastertoegang. Voer de gewenste doosgrootte in, verplaats de doos naar het gewenste gebied en klik op toepassen. Sla het nieuwe bestand op.
Maak vervolgens een segmentatiebestand aan door het bestand in het pool-venster om te schakelen. Klik vervolgens met de rechtermuisknop en selecteer labellabelveld labelen. Er wordt een nieuw bestand gemaakt en automatisch geladen in het segmentatie-editortabblad en ook in het objectpool.
Gebruik het verfpensel om de rand van het eerste kenmerk van interesse te traceren. Verander de penseelgrootte naar wens en gebruik vervolgens de muisaanwijzer om de rand van het kenmerk van interesse te traceren. Vul het getraceerde gebied met sneltoets F.Voeg de selectie toe door op de knop met het plussymbool te klikken.
Volg het kenmerk van interesse door alle plakjes heen en herhaal de handmatige traceersegmentatie. Genereer een oppervlakterendering voor visualisatie en basiskwantitatieve of kwalitatieve analyse per softwaregebruikershandleidinginstructie in het objectpool-tabblad, schakel de bestandsnaamlabels am in het pool-venster. Klik vervolgens met de rechtermuisknop en selecteer oppervlaktegen.
Selecteer de gewenste oppervlakte-eigenschappen en klik op toepassen. Er wordt een nieuw bestand met bestandsnaam surf gemaakt in de pool. Om het gesegmenteerde volume te visualiseren, schakel de bestandsnaam surf in het pool-venster.
Klik vervolgens met de rechtermuisknop en selecteer oppervlakkige weergave. Genereer een opperv
Overzicht
Deze studie behandelt de uitdagingen van functie-extractie in 3D elektronenmicroscopiegegevens. Het presenteert een reeks criteria om onderzoekers te begeleiden bij het selecteren van de meest geschikte segmentatiemethode voor verschillende soorten gegevens.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Elektronenmicroscopie
Achtergrond
- 3D elektronenmicroscopie biedt gedetailleerde inzichten in cellulaire structuren.
- Segmentatie is cruciaal voor het analyseren van complexe 3D dichtheidsmappen.
- Verschillende segmentatiemethoden omvatten handmatige, semi-automatische en geautomatiseerde benaderingen.
- Het kiezen van de juiste methode kan uitdagend zijn voor onderzoekers.
Doel van het onderzoek
- Om functies van belang te segmenteren uit complexe 3D elektronenmicroscopie datasets.
- Om de kenmerken van gegevens te beoordelen om segmentatiekeuzes te informeren.
- Om verschillende segmentatiestrategieën te vergelijken voor optimale functie-extractie.
Gebruikte methoden
- Verzameling van individuele elektronenmicroscopie beelden.
- Reconstructie van ruwe 2D gegevens in een 3D volume.
- Filteren om ruis te verminderen en functies te verbeteren.
- Beoordeling van gegevenskenmerken om de selectie van segmentatiemethoden te begeleiden.
Belangrijkste resultaten
- Demonstreerde verschillende methoden voor functie-extractie.
- Toonde de uiteindelijke 3D gesegmenteerde modellen gebaseerd op gekozen segmentatiestrategieën.
- Benadrukte voordelen en beperkingen van elke segmentatiebenadering.
- Biedt begeleiding voor onderzoekers die nieuw zijn in segmentatie.
Conclusies
- Effectieve segmentatie is essentieel voor het analyseren van 3D elektronenmicroscopiegegevens.
- Het kiezen van de juiste methode hangt af van de specifieke kenmerken van de dataset.
- Deze studie biedt een raamwerk voor onderzoekers om hun segmentatiepraktijken te verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
In biopharma R&D, accurate 3D ultrastructural analysis of cellular components is critical for target validation and mechanistic de-risking. This guide provides a decision framework for selecting optimal segmentation strategies based on data characteristics, directly supporting reproducible phenotypic screening and assay development. By enabling precise visualization and quantification of macromolecular complexes and organelles, it enhances predictive confidence in preclinical models and reduces biological ambiguity in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by clarifying 3D organization of adhesion complexes and cytoskeletal structures.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional target validation via direct visualization of macromolecular machines in native context.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by providing quantitative structural data to assess target engagement and mechanism of action.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating reproducible 3D segmented models of organelles and cellular structures.
- Operational Value: Addresses assay standardization and scalability through consistent surface rendering and quantitative analysis outputs.
- Strategic Value: Enables reliable compound evaluation by ensuring segmentation readiness across diverse data sets with varying signal-to-noise ratios and feature densities.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by linking ultrastructural changes in organelles to pathophysiological mechanisms in model systems.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling cross-platform comparison of segmentation outcomes.
- Predictive Value: Focuses on mechanistic de-risking by reducing ambiguity in target pathway interpretation via objective feature extraction.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to lead identification and preclinical validation, supporting data-driven decisions at each stage based on ultrastructural fidelity.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking by enabling direct visualization of feature interactions in 3D space.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs through standardized surface rendering and feature extraction across manual, semi-automated, and automated approaches.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, and statistical outputs such as volume, surface area, and morphological parameters that help teams compare conditions and assess compound effects.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity and biomarker alignment by linking ultrastructural phenotypes to functional outcomes in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, enabling cross-project standardization and knowledge transfer across teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in ultrastructural biology and 3D data interpretation.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including EM imaging platforms and segmentation software (e.g., Amira, Kymera, MATLAB).
- Cross-team standardization requirements for consistent thresholding, tracing, and algorithm application across sites.
- Adaptation considerations across model systems such as cells, tissues, organoids, and model organisms.
- Practical limitations including time investment for manual methods and computational demand for custom automated pipelines.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
4:47
Manual Tracing of Features of Interest
2:04
Manual Abstracted Model Generation
8:10
Automated Density-based Segmentation
9:15
Custom-tailored Automated Segmentation
9:41
Results: Application of Four Segmentation Approaches to Example Data Sets
11:29
Conclusion
