Drie- en vierdimensionale visualisatie- en analysebenaderingen om gewervelde axiale rek en segmentatie te bestuderen

De organogenesestadia in de muizenembryo's blijven slecht bestudeerd, deels als gevolg van de moeilijke visualisatie van de embryocomplexstructuren. Dit protocol beschrijft technieken die 3D- en 4D-visualisatie en analyse van muizenembryo's mogelijk maken tijdens axiale extensie en segmentatie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het onderzoekers in staat stelt om de complexe structuren van het muizenembryo te bestuderen en te tonen als 3D-dynamische objecten.

Dit protocol bevat technieken die kunnen worden gebruikt bij de studie van aangeboren misvormingen die de wervel en het ruggenmerg van zoogdieren aantasten, zoals scoliose. Deze technieken kunnen ook worden gebruikt met in vitro modelsystemen, waardoor de studie van de menselijke embryonale ontwikkeling mogelijk is. Om muizenembryo's tussen embryonale dag 8.25 en embryonale dag 10.5 voor te bereiden op live beeldvorming, ontleedt u de embryo's in voorverwarmd M2-medium bij 37 graden Celsius.

Verwijder de dooierzak voorzichtig met een schone tang en was het embryo eenmaal met vers M2-medium om bloed en vuil te verwijderen dat tijdens de dissectie is geproduceerd. Tijdens de live beeldvormingsprocedure incuberen embryo's in dmem-medium met lage glucose, aangevuld met 10% HyClone gedefinieerde FBS, twee millimolar L-glutamine en 1% penicilline streptomycine in een verwarmde kamer van 37 graden Celsius en een 65% zuurstof met 5% koolstofdioxideomgeving. Om muizenembryo's in een vergelijkbaar stadium voor te bereiden op immunofluorescentiemicroscopie, in plaats van verwarmd M2 te gebruiken, ontleedt u de embryo's in koude PBS en fixeert u in 4% paraformaldehyde.

Na het uitvoeren van het hele mount immunofluorescentiekleuringsprotocol zoals beschreven in het tekstmanuscript, kan weefselklaring worden bereikt met RapiClear. Plaats eerst de embryo's in het midden van een 75 bij 25 millimeter depressie concave glasplaat, verwijder alle PBST in de microscoopdepressieglaas en voeg 200 microliter clearingoplossing toe en bedek vervolgens het diapreparaat met een doos. Na 10 minuten beschermd tegen het licht, wanneer embryo's transparant beginnen te worden, vervangt u de opruimoplossing en wacht u nog eens 20 minuten.

Bedek het embryo met een deklip die van de ene kant begint en zachtjes naar de andere kant beweegt. Het monster is nu klaar voor beeldvorming. Voor het opruimen met methylsalicylaat of BABB, zorg ervoor dat de embryo's volledig zijn uitgedroogd in 100% methanol en start vervolgens de reeks BABB en methanol met 20% opeenvolgende concentratieverhogingen en een incubatie van 20 minuten voor elke stap.

Wanneer de BABB-oplossing 100% bereikt, breng dan twee extra wijzigingen aan voor een nieuwe oplossing. Bereid een glazen schuif van 20 bij 60 millimeter 1,5 afdekglas voor om de embryo's te monteren om te voorkomen dat het monster wordt samengedrukt. Voeg afstandhouders toe die zijn gemaakt van dunne metalen ringen.

Breng de gewiste embryo's over naar de microscoopglaasjes met behulp van een tandenstoker, een fijn wattenpuntje of een Pasteur-pipet. Voeg vervolgens een druppel montagemedium toe, dek af met een ander vergelijkbaar dekglas en sluit af met gesmolten paraffine om het preparaat beter te stabiliseren om bubbels te voorkomen. Plaats de deklip aan één kant en schuif deze vervolgens geleidelijk en voorzichtig zijwaarts, voeg indien nodig meer medium toe.

Het monster is nu klaar om in de microscoop te worden afgebeeld. Gebruik Fiji / ImageJ om het embryo na beeldvorming te herpositioneren in een gestandaardiseerde anterieur-achterste en dorsaal-ventrale aspositie. Verklein de grootte van de gegevensset in de afbeelding van Fiji, schaal en voeg vervolgens de schaalwaarden X, Y en Z in die nodig zijn om de gegevensset te verkleinen tot minder dan 200 megabytes.

Zorg ervoor dat de optie Nieuw venster maken is aangevinkt. Ga vervolgens naar plug-ins en open 3D Viewer. Klik in het 3D Viewer-venster op het embryo om het te selecteren, waardoor een rood 3D-vak verschijnt.

Wanneer u deze modus gebruikt, regelt u de rotatie van de gegevensset met een muis. Nadat u de perfecte positie van het embryo hebt gegarandeerd, selecteert u bewerken, transformeert u de afbeelding en exporteert u de getransformeerde afbeelding in het 3D Viewer-venster. Inspecteer de verschillende orthogonale vlakken, ga vervolgens naar afbeelding, stapel en selecteer orthogonale weergaven.

Wanneer het embryo correct is gepositioneerd, selecteert u het venstermenu van de 3D Viewer en bewerkt, transformeert en slaat u de transformatiematrix op in een tekstbestand met een matextensie. Open het tekstbestand met Fiji/ImageJ, verwijder de eerste twee regels en sla het opnieuw op. Dit creëert een transformatiematrixbestand dat compatibel is met de TransformJ-plug-in.

Schakel over naar de volledige resolutie dataset en voer de bewerkingsplug-ins TransformJ en TransformJ affine uit. Blader in het nieuwe venster om te zoeken naar het matrixbestand dat eerder is opgeslagen, selecteer de cubic B-spline-interpolatie en herhaal isotroop en klik vervolgens op OK. Na het correct herpositioneren van het embryo, trimt u het grootste deel van de gecreëerde lege ruimte. Om een volledig Z-projectiebeeld uit te voeren, klikt u op stapels, Z-project en kiest u maximale intensiteit.

Teken vervolgens de minimale ROI die het hele embryo in X en Y bevat.Schakel over naar de oorspronkelijke afbeeldingsvensters van de dataset door te klikken op bewerken, selecteren, selectie herstellen en bijsnijden door afbeelding te selecteren. Snijd de plakjes in het begin en het einde die embryoweefsels niet kruisen door afbeeldings- en openingsstapels te selecteren, klik op gereedschappen, selecteer de plakverwijderaar en geef het eerste en laatste segment op dat moet worden verwijderd, zorg ervoor dat u de toename in één wijzigt. Voer indien gewenst verdere analyses en 3D-reconstructies uit met behulp van de instructies in het tekstmanuscript.

Om 3D-analyse van meer ontwikkelde embryo's uit te voeren, ontleedt u embryonale dag 18,5 foetussen in koude PBS, verwijdert u alle extra embryonale membranen en wast u de foetussen vervolgens meerdere keren in verse PBS om bloed en puin te verwijderen dat tijdens de dissectieprocedure is geproduceerd. Fix foetussen in 4% PFA gemaakt in PBS bij vier graden Celsius gedurende vijf tot zeven dagen. Na het meerdere malen wassen van het embryo in PBS, droogt u de foetussen uit door te broeden in 10% 10 opeenvolgende verhogingen van methanoloplossingen totdat 100% methanol is bereikt.

Voer elke incubatie gedurende 25 minuten uit op een shaker bij kamertemperatuur. Incubateer vervolgens foetussen afzonderlijk op een shaker eerst gedurende één dag in 5% waterstofperoxide in methanol en vervolgens in 10% waterstofperoxide in methanol gedurende maximaal drie dagen totdat de embryo's alle natuurlijke pigmentatie verliezen. Rehydrateer de embryo's geleidelijk in een omgekeerde methanolreeks in gedemineraliseerd water met elke incubatie gedurende 20 minuten op een shaker bij kamertemperatuur en was de embryo's vervolgens drie keer gedurende 30 minuten per wasbeurt in gedemineraliseerd water.

Om foetussen in 1% agaroseblokken in te bedden, vult u een plastic buis of spuit van 50 milliliter met gesmolten agarose, plaatst u de foetus in de agarose in een verticale positie en behoudt u deze positie met een tang tijdens het stollen van de agarose. Plaats de mal met het blok gedurende 30 minuten op vier graden Celsius zodat de agarose volledig is gejollificeerd, verwijder vervolgens het agaroseblok met de foetus uit de mal en plaats het in een container met gedemoraliseerd water. Voer de uitdroging van de foetus geleidelijk uit met 10% verhoging van de methanolconcentratie verdund in gedemineraliseerd water of PBS, waarbij het monster gedurende ten minste 45 minuten bij kamertemperatuur op een shaker in methanolconcentratie wordt gehouden totdat 100% methanol is bereikt.

Verwijder de foetussen door ze gedurende 2,5 uur in elke concentratie door een reeks BABB-oplossing en methanol te bewegen met 25% toename van de BABB-concentratie totdat 100% BABB wordt bereikt. Vervang de BABB-oplossing elke dag door een nieuwe totdat de foetus volledig transparant is. Dit proces kan drie tot vijf dagen duren.

Gebruik lijm om het gewiste agaroseblok aan de motoras van de OPT-scanner te bevestigen, pas vervolgens de optica aan om een beeld van de hele foetus te verkrijgen en ga verder met het verkrijgen van een volledige projectiedataset. De 4D live imaging techniek maakt de dynamische analyse van LuVeLu reporter expressie en embryonale dag 8.5 Snai1-voorwaardelijke knock-out embryo's mogelijk. Samen met het normale LuVeLu-signaal op het presomitische mesoderm vertonen Snai1-voorwaardelijke knock-outembryo's LuVeLu-expressie in de ectopische uitstulping die ontstaat uit de primitieve streep.

Whole mount immunofluorescentie assays maken de detectie van potentiële NMP's en belangrijke regulatoren van mesoderm differentiatie mogelijk. Witte en gele pijlen markeren verschillen in de embryo's van het gemuteerde en wilde type. 3D-renderisatie van whole mount immunostainings maakt een beter begrip van het weefsel of de structuur in de studie mogelijk.

In dit geval werd de locatie van potentiële NMP's in de staartknop onderzocht. 3D-weefselreconstructies zijn ook belangrijk om morfologische defecten in muizenembryo's te begrijpen en te karakteriseren. Interactieve visualisatie van 3D-reconstructie kan ook worden gebouwd in gebruiksvriendelijke formaten.

Bijvoorbeeld in een PDF-bestand. Deze 3D embryo caudale structuren kunnen worden gebruikt om de kracht van 3D-modellen aan een meer algemeen publiek te illustreren en om te helpen bij de studie bij het aanleren van een gewervelde axiale elongatie en segmentatie. Ten slotte is 3D in toto visualisatie van meer ontwikkelde muizenembryo's mogelijk met behulp van de OTP-microscopietechniek.

Geanimeerde renderings worden hier getoond, met de nadruk op belangrijke plakjes embryonale dag 18,5 foetussen. Het belangrijkste om te onthouden is dat het resultaat een getrouwe weergave moet blijven van wat er in het embryo wordt waargenomen. Onderzoekers kunnen deze methoden gebruiken om verder te gaan dan alleen statische weergave van de afbeeldingen, maar ook video's, driedimensionale reconstructies en zelfs interactieve 3D-modellen van hun gegevens.