Karakterisering van Thymic Settling voorouders in de Mouse Embryo behulp In Vivo En In Vitro Testen

Het algemene doel van deze procedure is om de fenotypekinetiek van de generatie en het aantal T-cellen geproduceerd door E 13 of E 18 thymische settelingprogenitors te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst de thymische lobben te isoleren uit E 13, E 14 en E 18 muis embryo's. In de tweede stap worden de E 14 thymische lobben bestraald en vervolgens 48 uur gekoloniseerd met flow-gesorteerd E 13 of E 18 cellen in een hangende druppel.

In de laatste stap worden de gekoloniseerde lobben getransplanteerd onder de niercapsule van volwassen CD drie knock-out muizen. Uiteindelijk kan flowcytometrie worden gebruikt om de aanwezigheid van de E 13 en E 18 thymische settelingprogenitor nakomelingen in het bloed van de chimere dieren te beoordelen. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van onze bestaande methoden, zoals in vitro T-celcultuur op ine so cellen, is dat deze techniek de methoden combineert die volledige T-celmaturatie van gedefinieerde progenitors in een driedimensionale assay mogelijk maakt met de transplantatie van thymische orgaanculturen in intacte ontvangende muizen, waardoor de evaluatie van de differentiatie en functie van de thymische slic progenitors en de nakomelingen mogelijk wordt.

Als onderzoeksingenieur met expertise in knaagdierchirurgie, zal ik de procedure demonstreren. Twee dagen voor het transplantatie-experiment in een laminaire stroomkap, desinfecteer wat de buik van een zwangere vrouwelijke muis met 70%ethanol en maak een longitudinale incisie in de huid op de middenlijn, trek de huid uit elkaar om de incisie te openen en gebruik vervolgens forceps en schaar om het buikvlies te openen zonder de spijsverteringskanaal aan te raken. Trek vervolgens de tweehoornige baarmoeder uit en gebruik schaar om deze te scheiden van de vagina. Plaats vervolgens de baarmoeder in een 90 bij 15 millimeter petrischaaltje met 40 tot 50 milliliter DPBS en snijd dwars tussen de decidua van elke embryo.

Gebruik een paar fijne schaar en fijne forceps om het spiermembraan van de baarmoeder te verwijderen, snijden tussen de placenta en de dooierzak om elk embryo te verwijderen. Verwijder vervolgens het amnio dat de embryo's bevat en plaats de embryo's in een nieuwe petrischaal met HBSS plus 1%FCS. Om de thymus te isoleren, plaats de embryo's een voor een in de rugligging onder een binoculair vergrotingsglas.

Plaats vervolgens een forceps longitudinaal langs het kraakbeen van het borstbeen en knijp en open de thoracale rooster met gebogen forceps. Trek de thoracale wand opzij om de thymische lobben aan elke kant van de luchtpijp te visualiseren. Knijp vervolgens onder de thymus met een fijne forceps om elke lob voorzichtig te verwijderen en plaats ze in een petrischaal met één milliliter HBSS plus 1%FCS.

Gebruik vervolgens twee fijne forceps om het omliggende bindweefsel te verwijderen zonder de lobben te beschadigen. Was vervolgens de lobben in drie milliliter HBSS plus 1%FCS om de rode bloedcellen te elimineren om de foetale thymus orgaancultuur te beginnen te bestralen. E 14 thymische lobben geïsoleerd uit CD 45.2 embryo's zoals zojuist gedemonstreerd.

Laat de lobben ongeveer drie uur rusten. Draai vervolgens vers gesorteerd E 13 of E 18 thymisch settelingprogenitors om. Re-suspendeer het pellet in kweekmedium tot een uiteindelijke concentratie van 500 cellen per 35 microliter medium.

Plaats vervolgens een 35 microliter druppel celsuspensie in elke tweede put van een 60-puts terasaki plaat en plaats één bestraalde lob op het oppervlak van elke druppel. Sluit de plaat en draai deze ondersteboven zodat de cellen door middel van zwaartekracht de apicale pool van de druppel bereiken, tik voorzichtig op de bovenkant van de omgekeerde plaat om de lobben naar de apicale rand van de druppel te laten glijden. Incubeer vervolgens de omgekeerde plaat in een bevochtigde incubator gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Nadat de thymische lobben zijn gekoloniseerd, verifieer het niveau van anesthesie van het ontvangende dier door een gebrek aan reflexreactie. Plaats vervolgens een druppel oogzalf op elk oog en plaats de muis op zijn rechterzijde onder een laminaire stroomkap. Scheer vervolgens het chirurgische gebied net boven de gewricht van de achterpoot.

Doe vervolgens een paar steriele handschoenen aan en steriliseer het chirurgische veld met 70%ethanol en een 10%IOD DY DER oplossing. Gebruik een scalpel om een 1,5 centimeter incisie te maken door het cutane weefsel, gevolgd door een incisie door het spierweefsel. Oefen nu een lichte druk uit op beide zijden van de incisie om de nier uit de buikholte te forceren en houd de nier vochtig met zoutoplossing.

Houd de nier met een wattenstaafje buiten de retroperitoneale holte en gebruik twee fijne forceps om een twee tot drie millimeter gat in de capsule te maken. Houd vervolgens de wand van de capsule open en schuif voorzichtig maximaal zes thymische lob transplantaten onder de nier naar de rand van de nierpool en plaats de nier terug in de retroperitoneale holte. Naai de spier een neurose, gevolgd door een huidnaad met individuele chirurgknoopjes.

Bevochtig vervolgens de wond met 10%joodpovidon oplossing en plaats de muis op een 37 graden Celsius verwarmingspad, terwijl u het dier en de chirurgische wond bewaakt totdat ze beide volledig hersteld zijn om de beste methode te bepalen voor het verminderen van endogene thymocyten voor de ontwikkeling van koloniserende progenitors. In dit experiment werden de niveaus van T-celreconstitutie in een gekoloniseerde thymische lob na een bestraling of een vijfdaagse deoxy guine behandeling vergeleken. Hoewel er geen verschil in het aantal koloniserende lymfocyten was op dag negen van de cultuur, bevatten de bestraalde lobben meer T-cellen dan degenen behandeld met deoxy guine op dag 12, waardoor bestraling de voorkeursbehandeling was voor het faciliteren van T-celontwikkeling na thymische kolonisatie om het ontwikkelingspotentieel van E 13 en E