Name: Karakterisering van Thymic Settling voorouders in de Mouse Embryo behulp In Vivo En In Vitro Testen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Leer de karakterisering van thymische settelende voorouders in muizenembryo's met in vivo- en in vitro-technieken. Deze methode analyseert de kinetiek, fenotype en T-celproductie van deze progenitorcellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ondersteund door het Instituut Pasteur, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant &#39;lymfopoiese&#39;), de Revive Future Investment Program en &quot;La Ligue contre le Cancer&quot;.

Ethiek statement: alle experimenten werden uitgevoerd volgens het Pasteur Instituut Ethic Charter, door het Franse ministerie van Landbouw goedgekeurd en aan de EU-richtlijnen. Een manipulator met een opleiding op kleine knaagdieren chirurgie, gecertificeerd door het Franse ministerie van Landbouw, voert alle chirurgische ingrepen. OPMERKING: Zie bijlage Tabel 1 toont het 5-stappenplan procedure. 1. Selectie van de embryo&#39;s <ol><li> Gebruik 36 C57BL / 6 vrouwtjes CD45.2, CD45.1 12 vrouwen, 12 C57BL / 6 mannetjes en CD45.1 12 C57BL / 6 mannetjes CD45.2. Overschrijding van de vrouwen met mannelijk genotype produceert embryo CD45.1 / 2 en CD45.1 gebruikt als bron van TSP of CD45.2 als bron van ontvanger thymus lobben. House alle mannen afzonderlijk. </li><li> Om embryo&#39;s voor E18 TSP isolatie te verkrijgen, plaatst u 2 vrouwtjes in een kooi met een mannetje CD45.1 om 6 uur, 21 dagen voor het enten experiment. Controleer de aanwezigheid van een vaginale plug de volgende dag, voor de middag. SepaBeoordeel de aangesloten vrouwtjes. </li><li> Om E14 embryo&#39;s te verkrijgen om te worden gekoloniseerd door TSP, herhaalt u de bovenstaande procedure (1.2), het gebruik van mannetjes CD45.2, 17 dagen voor het enten experiment. </li><li> Om embryo&#39;s te isoleren E13 TSP krijgen, herhaalt u de bovenstaande procedure (1.2), met behulp van de mannetjes C57BL / 6 CD45.1, 16 dagen voor het enten experiment. </li></ol> 2. Dissection van de embryo&#39;s onder een horizontale laminaire stroming Hood OPMERKING: Twee dagen voor het enten experiment. <ol><li> Offer de zwangere vrouwtjes door cervicale dislocatie of door progressieve toediening van CO 2 gas gedurende ten minste 5 min, in een verzadigende gesloten kamer. Zorg voor dood door definitieve arrestatie van cardio-respiratoire bewegingen. Bevochtig de buik met 70% ethanol. </li><li> Maak een longitudinale incisie in de huid op de middenlijn buik en openen door aan de huid elkaar. Open het buikvlies met de pincet en een schaar zonder het aanraken van het spijsverteringskanaal. Trek de gespleten uterons scheiden van de vagina met een schaar. </li><li> Plaats de baarmoeder in een 90 x 15 mm petrischaal met 40-50 ml DPBS en snijd dwars tussen decidua elk embryo&#39;s. </li><li> Met de paar fijne tip schaar en een fijne tang verwijder de spier membraan van de baarmoeder, neem de embryo&#39;s door te snijden tussen de placenta en de dooierzak, en verwijder de amnios, die met behoud van de embryo&#39;s. </li><li> Plaats de embryo&#39;s in een petrischaal van 90 x 15 mm bevattende HBSS + 1% foetaal kalfsserum (FCS). Voor embryo&#39;s ouder dan E15, verwijder de hoofden met een schaar voordat eventuele verdere dissectie. </li></ol> 3. Isolatie van de Thymus <ol><li> Onder de verrekijker vergrootglas, plaatst het embryo, liggend in rugligging (ventrale view), op een nat gaasje beddengoed. </li><li> Steek een tang lengterichting langs het kraakbeen van het borstbeen, knijpen en open de thoracale raster. Met gebogen pincet, trek de thoraxwand opzij te visualiseren de thymic lobben aan weerszijden van de trachea. </li><li> Zorgvuldig houdt elke lob van knijpen onderaan met een fijne pincet en plaats ze in een petrischaal met 1 ml HBSS + 1% FCS. Isoleer de lobben en verwijder omliggende bindweefsel met twee 1 ml injectiespuiten + 26 G ⅜ &quot;naalden, zonder schade aan de capsule. </li><li> Was de lobben in 3 ml HBSS + 1% FCS bloedcellen te elimineren. OPMERKING: Voor E15, worden thymus lobben aan weerszijden van de luchtpijp en later zekering in het midden van een bi-dementie orgaan vormen. </li></ol> 4. Cell Schorsingen <ol><li> Tease apart de lobben onder de binoculaire vergrootglas met twee 26 G naalden bevestigd aan 1 ml injectiespuiten, in HBSS + 1% FCS. Filter de celsuspensie door een nylon mesh. </li></ol> 5. kleuring met fluorescerende antilichamen en Cell Sorting LET OP: Alle antilichamen zijn eerder getitreerd om een ​​optimale definitie van de bevolking (de titrat verkrijgenion kan variëren met het antilichaam batch). <ol><li> Incubeer de thymocyten (E13 of E18) gedurende 15-30 min bij 4 ° C met 100 pi van een cocktail van gebiotinyleerde antilichamen tegen lineage positieve cellen te kleuren (anti-CD19, anti-Gr1, anti-TER119, anti-NK1.1 , anti- CD11c, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25). </li><li> Weg te wassen dan antilichamen spin down van de buizen met 4 ml HBSS + 1% FCS bij 280 xg gedurende 7 min, elimineren de supernatant en re-schorsing van de pellet in verse HBSS + 1% FCS. Centrifugeer nogmaals. </li><li> Incubeer de E18-biotine gelabelde cellen met streptavidine microbolletjes gedurende 15 min bij 4 ° C en was de cellen tweemaal in HBSS 1% FCS. Resuspendeer de cellen in 2 ml HBSS + 1% FCS. De meeste E13 thymocyten zijn lineage negatief en dus niet MACS verrijking voorafgaand aan celsortering nodig. </li><li> Laat de cellen in de kolom LS, volgens de instructies van de fabrikant. Wanneer alle celsuspensie ging de kolom toe 2 ml HBSS + 1% FCS. Herstellen van de4 ml van de kolom stromen door en centrifugeer de cellen gedurende 7 minuten bij 280 x g. </li><li> Resuspendeer de pellet van ofwel verarmd E18 of E13 thymocyten in totaal 50 pl van het TSP antilichaam mix (anti-CD117 APC, anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24 FITC, anti-CD44 APCCy7 en streptavidine Pacific Blue ) en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C in het donker. </li><li> Was de cellen met 4 ml HBSS + 1% FCS en resuspendeer de cellen in 1 ml HBSS + 1% FCS met propidium jodide. </li><li> Sorteer de TSP Lin - CD44 + CD117 + CD24 low CD127 + CD135 + cellen in een FACS (met 4 lasers) op een 1,5 ml buisjes met 200 ul compleet medium + 20% FCS. Gate eerst de cellen op basis van hun grootte en de granulariteit van de FSC en SSC kanalen. Elimineren van dode cellen (kleuring met propidiumjodide), poort uit wambuizen en de score van de fluorescentie in exponentiële schalen. Rond 100 of 600 TSP kan worden verkregen van de ene E13 of een E18 thymus, respectively. </li></ol> 6. Kolonisatie van E14 Thymic Lobes met voorouders: Opknoping Drop Techniek <ol><li> Bestralen (30 Grays = 30 Gy) E14 thymus lobben van CD45.2 embryo, 3 uur voor cultuur. OPMERKING: E14 of E15 thymus lobben met succes gebruikt als ontvanger van T-cel voorlopers. Met ontvanger thymus lobben van latere gestational dagen leidt tot voortijdige necrose vanwege de grotere omvang van het orgaan, terwijl thymus lobben in eerdere zwangerschap dagen ontwikkelen slecht, waarschijnlijk door onvolledige ontwikkeling van de epitheelcellen. </li><li> Centrifuge gesorteerd TSP en resuspendeer de cellen in kweekmedium (OPTI-MEM compleet medium met 10% FCS, penicilline (50 eenheden / ml), streptomycine (50 ug / ml) en 2β-mercaptoethanol (50 uM)) dat 35 pi bevatten 500 TSP. </li><li> Plaats een 35 ul druppel celsuspensie elke andere goed van een 60 goed Terasaki plaat. OPMERKING: 35 pl druppels kunnen smelten wanneer zij in aangrenzende putjes geplaatst. </li><li> Plaats een bestraalde kwab op de oppervlakte van elke druppel. Sluit de Terasaki plaat en draai de plaat op zijn kop te laten de cellen bereikt de apicale pool van de daling door de zwaartekracht. </li><li> Raak zachtjes de bovenzijde van de omgekeerde plaat om de lobben te dwingen te schuiven naar de apicale kant van de druppel. Incubeer de omgekeerde Terasaki plaat in een bevochtigde incubator gedurende 48 uur bij 37 ° C + 5% CO2. Na kolonisatie, ofwel cultuur E14 thymi in FTOC 7 of graft onder de nier capsule van een ontvanger volwassen muis 8. </li></ol> 7. Foetale Thymic Organ Cultuur <ol><li> Plaats 3 ml compleet medium op een 35 mm petrischaal. Een isopore membraanfilter drijvend op het medium. Plaats de gereconstitueerde lobben aan de rand van het membraan met een pincet (ten hoogste 8 lobben op een membraan). </li><li> Plaats de platen met de thymus lobben in een 90 mm petrischaal, tezamen met een 35 mm schaal, zonder deksel, bevattende 2 ml water, optimale vochtigheid waarborgen. Incubeer 12 dagen bij 37 ° C + 5% CO2. </li></ol> 8. Enten Onder de Nier Capsule onder steriele omstandigheden OPMERKING: De nierparenchym is omgeven door bindweefsel vormen van een capsule. De sub-capsulaire gebied is bijzonder rijk aan bloed- en lymfevaten waardoor een geschikte omgeving voor de ontwikkeling van transplantaten (bijvoorbeeld thymus lobben, pancreatische eilandjes of pasgeborene harten). Enten wordt meestal op de linker nier omdat het toegankelijker is dan de rechter nier. CD3 - / - mannelijke muizen werden als ontvangers aldus graft versus host reactie veroorzaakt minor histocompatibility antigenen verbonden met het Y-chromosoom voorkomen omdat geslachtsbepaling voordat E15 is niet eenvoudig. <ol><li> Steriliseer de instrumenten en draag steriele handschoenen langs de operatie. Verdoven de muis door intraperitoneale injectie van een oplossing van ketamine 10 mg / ml xylazine + 1 mg /ml verdund in PBS: (50 tot 100 pl per 10 g lichaamsgewicht) met een injectiespuit 1 ml. Controleer anesthesie door het controleren van een gebrek aan interdigitale reflexen. Plaats een druppel van hydro-Optimune gel op elk oog tot droog tijdens anesthesie te voorkomen. NB: De oplossing moet ex tempore worden voorbereid en opgewarmd op kamertemperatuur vóór de injectie. De verdoving duurt tenminste 20 minuten. De mate van anesthesie moet worden gecontroleerd langs de operatie. De anesthesie kan worden verlengd door intraperitoneale injectie van een halve dosis om de 20 min. </li><li> Plaats de muis op zijn rechterzijde, onder een horizontale lamina stroming kap. Steriliseer het chirurgische gebied met 70% ethanol en 10% jodide dermische oplossing. Met een pincet deel van de muis haar langs een 2 cm lengte net boven het gewricht van de achterpoot. Scheer de chirurgische gebied. </li><li> Met een scalpel, maken een incisie van 1,5 cm lengte van de eerste, de huidweefsel, dan met een schaar knippen de spierweefsel. Breng een lichte druk op beide zijden van de incisieDie de nier zal dwingen uit de buikholte. </li><li> Breng een zoutoplossing met een katoenen-knop om de nier vochtig te houden. Als je problemen met het blootstellen van het orgel, met een platte tang te trekken uit de omliggende adipocyte weefsel waarop de nier is bevestigd. Handhaving van de nier uit de retroperitoneale holte door een wattenstaafje aangebracht onder het orgel. </li><li> Met twee fijne tang, maak een 2-3 mm gat in de capsule (vermijd het aanraken van de parenchyma om bloeden te voorkomen). Tijdens de gehele chirurgische procedure houdt de blootgestelde nierkapsel continu bevochtigd. </li><li> Plaats voorzichtig de lobben onder de nierkapsel, door het handhaven van de wand van de capsule geopend en schuif de graft onder de capsule naar de rand paal. Plaats tot 6 lobben per nier. </li><li> Vervang de nier bij de retro-peritoneale holte. Hecht de spier aponeurosen, daarna de huid met individuele chirurg knopen. Bevochtig de wond met 10% jodide povidon oplossing. Plaats de muis op een verwarmde pad bij 37 ° C. </li><li> De enquête van de getransplanteerde muis tot volledig herstel van de anesthesie door het regelen van hart-, ademhalings- en snorhaar bewegingen, mucosale kleuren tot volledig herstel gezien door zelfstandige bewegingen. OPMERKING: Wij raden injectie van pijnstillende oplossing (Buprenorfine, 0,1 mg / kg) intra spieren vlak na de operatie en de 2 dagen na de ingreep om na de ingreep pijn te voorkomen. </li><li> Houd de geopereerde dieren in afzondering tot volledig hersteld. Controleer elke dag de steken van de wond te verifiëren en besmetting te voorkomen. Nooit waargenomen wondinfectie na deze procedure. OPMERKING: Wekelijkse analyse van perifere bloedcellen van de CD3 - / - muizen geënt toelaten de thymus afgeleide populaties afkomstig van ofwel E13 of E18 progenitors met de CD45 marker en allotypische T-cellijn specifieke antilichamen (Figuur 3) te detecteren. </li></ol> 9. Analyse van het TSP nageslacht door flowcytometrie <ol><li&gt; Tease de FTOCs individueel enkele celsuspensies (zie protocol hoofdstuk 4) te verkrijgen. </li><li> Stain celsuspensies van individuele lobben met een antilichaam mengsel dat antilichamen die CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, Vδ1 PE en incubeer zoals beschreven in paragraaf 5. </li><li> Resuspendeer de cellen in HBSS + 1% FCS + propidiumjodide en geanalyseerd in een flowcytometer (zie resultaten in Figuur 2). </li></ol>

<ol><li>Rodewald, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymus organogenesis.</a> Annu Rev Immunol. 26, 355-388 (2008).</li>
<li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journey+through+the+thymus%3A+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-positive+epithelium+and+mesenchyme+cells+are+both+required+for+T-cell+development+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus.</a> Nature. 362, 70-73 (1993).</li>
<li>Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+T+cell+precursor+activity+in+the+murine+fetal+thymus%3A+evidence+for+an+input+of+T+cell+precursors+between+days+12+and+14+of+gestation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation.</a> Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).</li>
<li>Calderon, L., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic%2C+context-dependent%2C+and+hierarchical+functions+of+epithelial+components+in+thymic+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments.</a> Cell. 149, 159-172 (2012).</li>
<li>Adolfsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Flt3%2B+lympho-myeloid+stem+cells+lacking+erythro-megakaryocytic+potential+a+revised+road+map+for+adult+blood+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment.</a> Cell. 121, 295-306 (2005).</li>
<li>Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+lymphoid+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow.</a> Cell. 91, 661-672 (1997).</li>
<li>Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commitment+and+developmental+potential+of+extrathymic+and+intrathymic+T+cell+precursors%3A+plenty+to+choose+from%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from.</a> Immunity. 26, 678-689 (2007).</li>
<li>Ramond, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+waves+of+distinct+hematopoietic+progenitor+cells+colonize+the+fetal+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus.</a> Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).</li>
<li>Allison, J. P., Havran, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunobiology+of+T+cells+with+invariant+gamma+delta+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors.</a> Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+thymus+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fetal thymus organ culture.</a> CSH Protoc. , (2007).</li>
<li>Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T+cell+development+from+hematopoietic+progenitor+cells+by+delta-like-1+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro.</a> Immunity. 17, 749-756 (2002).</li>
<li>Barbee, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skint-1+is+a+highly+specific%2C+unique+selecting+component+for+epidermal+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).</li>
<li>Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+earliest+prethymic+bipotent+T%2FNK+progenitor+in+murine+fetal+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver.</a> Blood. 99, 463-471 (2002).</li>
<li>Malissen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+T+cell+development+in+mice+with+a+targeted+mutation+of+the+CD3-epsilon+gene%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene.</a> EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Twee belangrijke testen kunnen worden gebruikt om T-celdifferentiatie ex vivo te analyseren. De laatst gerapporteerde de co-cultuur van hematopoiëtische progenitors met BM stromale cellen, OP9, de uiting van de liganden van Noth1, delta zoals 1 of 4 12. Het 2-D test is gemakkelijk uit te voeren zeer efficiënte en gevoelige, waardoor analyse op de single cell niveau. Echter geen ondersteuning T cel ontwikkeling dan het stadium van DP noch de vorming van γδ DETC 13, die beide vereisen direct...

T-lymfocyten, met het αβ of γδ T-celreceptor (TCR), differentiëren in een gespecialiseerd orgaan, de thymus. De volledig ontwikkelde thymus is georganiseerd in twee verschillende gebieden: de cortex, waar de thymus voorouders ontwikkelen en waar de thymocytes dat productief herschikken de TcR β en α-keten genen worden gered van de dood geprogrammeerd (een proces dat bekend staat als positieve selectie); en het merg, waar de geselecteerde thymocyten met te sterke reactiviteit op self-liganden worden verwijderd (negatieve selectie) 1,2. De thymus is afkomstig van de endodermale laag van het derde faryngeale zak die later wordt omgeven door mesenchymale cellen 3. Het wordt gekoloniseerd door hematopoëtische voorlopercellen vanaf embryonale dag E12 en daarna continu rekrutering vereist voor normale T-cel ontwikkeling 4. Thymus immigranten evolueren door opeenvolgende ontwikkelingsstadia, georkestreerd door een strak gereguleerde programma, geïnitieerd en maintained door de activering van het Notch signaling pathway op thymocyten na interactie met zijn ligand, zoals delta 4, uitgedrukt op thymus epitheelcellen (TEC) 5. Thymocyt ontwikkeling begint bij de zogenaamde CD4 - CD8 - dubbele ontkenning (DN) stadia. DN thymocyten kunnen verder worden onderverdeeld op basis van de expressie van CD25 en CD44 in DN1 (CD25 - CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) en DN4 (CD25 - CD44 -). CD24 (HSA) en CD117 (c-Kit) verdeelt verder de DN1 compartiment in 5 subgroepen, waar DN1a en b overeen met het begin van de thymus voorlopercellen (ETP). Thymocyten herschikken de TcR δ, β en α-ketens in de DN podium en ondergaan vooraf TcR selectie (DN3-DN4 stages). Ze verdere doorvoer naar de CD4 + CD8 + dubbele positieve (DP) compartiment waar de TcR α-keten herschikt voorafgaand aan positieve en negatieve Selectie. In dit stadium meeste thymocyten worden geëlimineerd en slechts een klein percentage (3-5%) bereikt de CD4 + of CD8 + rijpe T cel compartiment. De lymfoïde differentiatie pad vordert door de stadia van HSC dat multipotente voorlopercellen (MPP) en lymfoïde primer multipotente voorlopercellen (LMPP) dat de erytrocyten en megakaryocyt potentiële 6 verloren genereren. LMPP wordt fenotypisch gedefinieerd door de afwezigheid van gedifferentieerde bloedcellen markers (lineage negatief, Lin -), de expressie van c-Kit (CD117), Sca-1 en Flt3 / flk2 (CD135) en de afwezigheid van detecteerbare niveaus van interleukine ( IL) -7 receptor α-keten (IL-7rα of CD127). LMPPs verder te differentiëren in gewone lymfoïde voorlopers (CLP) 7, dat door die fase de capaciteit om myeloïde cellen te genereren hebben verloren. CLP behouden lymfocyten (B- en T-cel), NK cellen, DC en aangeboren lymfoïde cellen (ILC) potentieel en verschillen van LMPP door de expressie van CD127 en de afwezigheid van hoge niveaus van Sca-1. Hoewel de aard van de thymus afwikkeling voorlopers (TSP) is uitvoerig besproken 8, onlangs duidelijk geworden dat TSP verandering fenotype, differentiatiepotentieel en functie, tijdens de ontwikkeling 9. We voerden in vitro en in vivo assays voor het TSP, geïsoleerd door FACS celsortering van ofwel E13 (eerste golf) of E18 (tweede golf) te karakteriseren. Foetale thymus orgel culturen (FTOC) met bestraalde thymus lobben gekoloniseerd door gelijke aantallen van E13 en E18 voorouders, dragen verschillende allotypische markers, mogen na hun nakomelingen in een soortgelijke ontwikkeling milieu en onthulde cel intrinsieke eigenschappen, verschillende tussen beide soorten voorouders. Thymus lobben gekoloniseerd door ofwel E13 of E18 TSP toegestaan ​​ontwikkeling zonder selectie als gevolg van concurrentie tussen beide voorouders. In vivo transplantatie van de gekoloniseerde thymus lobben toonde verder aan dat ook thij volwassen nakomelingen van E13 en E18 TSP hebben verschillende biologische eigenschappen in vivo. TSP uit de eerste golf snel genereren van T-cellen, maar aanleiding geven tot lage aantallen αβ en γδ T-cellen. Onder de laatste detecteerden we Vγ5Vδ1 dendritische epitheliale T-cellen (DETC), dat een invariant TcR, migreren naar de opperhuid waar ze uitoefenen van een functie in wondgenezing en worden alleen geproduceerd tijdens de embryonale ontwikkeling 10. Daarentegen TSP van de tweede fase langer duren om grote aantallen TcR + T-cellen te genereren en niet kunnen DETC genereren.

<table><tbody><tr><td>90 x 15 mm en 35 x 15 mm kunststof weefselkweek Petri schotels.</td><td>TPP</td><td>T93100/T9340</td><td>Sterilisatie</td></tr><tr><td>26 G &frac38;" 0,45 x 10 mm spuiten met naalden</td><td>BD Plastipak</td><td>300015</td><td>Celsuspensie</td></tr><tr><td>Gesteriliseerde nylon gaasboltdoek, 50/50 mm stukken.</td><td>SEFAR NITEX</td><td>03-100/32</td><td>Filtratie van cellen</td></tr><tr><td>Ethanol 70%.</td><td>VWR</td><td>83801.36</td><td>Sterilisatie acties</td></tr><tr><td>Jodide Povidone 10% (Betadine)</td><td>MEDA Pharma</td><td>314997.8</td><td>Sterilisatie acties</td></tr><tr><td>Ketamine 100 mg/ml (stockoplossing)</td><td>MERIAL</td><td></td><td>Anesthesie</td></tr><tr><td>Xylazin 100 mg/ml in PBS (stockoplossing)</td><td>Sigma</td><td>X1251-1G</td><td>Anesthesie en spierverslapper</td></tr><tr><td>Buprenorfin 0,3 mg/ml stockoplossing</td><td>AXIENCE</td><td></td><td>Morfine analgeticum</td></tr><tr><td>Ophtalmisch gel (0,2% cyclosporine)</td><td>Schering-Plough Animal Health</td><td></td><td>Oogbescherming</td></tr><tr><td>DPBS (+ CaCl2, MgCl2)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>14040-174</td><td>om embryo's te isoleren</td></tr><tr><td>HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>24020-091</td><td>om het bloed weg te spoelen en de embryo's te dissekeren</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I GlutaMAX I</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>51985-026</td><td>Medium voor culturen</td></tr><tr><td>Foetaal runder serum</td><td>EUROBIO</td><td>CVFSVF00-0U</td><td>additief voor culturen</td></tr><tr><td>Penicilline en streptomycine</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>15640-055</td><td>Antibiotica voor culturen</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>31350010</td><td>additief voor culturen</td></tr><tr><td>LEICA MZ6 Dissectiemicroscoop</td><td>LEICA</td><td>MZ6 10445111</td><td>Oculaire W-Pl10x/23</td></tr><tr><td>Koudlampbron</td><td>SCHOTT VWR</td><td>KL1500 compact</td><td>Twee aangepaste ganshalsvezels</td></tr><tr><td>Siliconen elastomeer</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Dissectiekussen</td></tr><tr><td>Lepel, rond en geperforeerd</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-18</td><td>Dissectietools</td></tr><tr><td>Fijne irisschaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td>Dissectietools</td></tr><tr><td>Vannas veerschaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td>Dissectietools</td></tr><tr><td>Forceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm</td><td>F.S.T.</td><td>11253-25</td><td>Dissectietools</td></tr><tr><td>2 paren fijne rechte klokkenmakersforceps Dumont #5 11 cm fijne uiteinden.</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-20</td><td>Dissectietools</td></tr><tr><td>Polyamidedraad met naald 6-0 C-3 3/8c</td><td>ETHICON</td><td>F2403</td><td>voor hechtingen</td></tr><tr><td>Naaldhouder</td><td>MORIA/F.S.T.</td><td>12060-02</td><td>voor hechtingen</td></tr><tr><td>Verwarmingskussen</td><td>VWR</td><td>100229-100</td><td>Om de muistemperatuur tijdens anesthesie te handhaven</td></tr><tr><td>Membran Isopore RTTPO2500</td><td>DUTSCHER</td><td>44210</td><td>Voor FTOC</td></tr><tr><td>Terasaki 60 welplaten</td><td>FISHER</td><td>1x270 10318801</td><td>Voor de ophangdruppeltechniek</td></tr><tr><td>Gaasjes, steriele 7,5 x 7,5 cm</td><td>Hydrex</td><td>11522</td><td>Om desinfectieoplossing aan te brengen</td></tr><tr><td>Fluorescentie of biotin gelabelde antilichamen</td><td>BD Biosciences, Biolegend of e-Biocsiences&nbsp;</td><td>Clone Number zie tabel hieronder</td><td>Cellen kleuren</td></tr><tr><td>MACS Columns/Streptavidine Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401/130-048-101</td><td>Celdepletie</td></tr><tr><td>Muizen</td><td>Charles Rivers Laboratories (CD45.1) en Janvier Labs&nbsp; (CD45.2)</td><td>C57BL/6 CD45.1 OF CD45.2</td><td>Bron van cellen en thymuskwabben</td></tr><tr><td>Muizen</td><td>CDTA Orléans, Frankrijk</td><td>CD 3 epsilon Ko CD45.2</td><td>Greftproeferiment</td></tr></tbody></table>

karakterisering van thymic settling voorouders in de mouse embryo behulp<em&gt; in vivo</em&gt; en<em&gt; in vitro</em&gt; testen

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Karakteriseren thymus regelen voorlopercellen van belang te begrijpen van de pre-thymus stadia van T cel ontwikkeling essentieel strategieën voor T-cel vervanging lymfopenische patiënten ontwikkelen. We bestudeerden thymus afwikkeling progenitoren murine embryonale dag 13 en 18 thymi twee complementaire in vitro en in vivo technieken, beide gebaseerd op de &quot;opknoping drop&quot; methode. Deze methode toegestaan ​​koloniseren bestraalde foetale thymus lobben met E13 en / of E18 thymus voorlopers onderscheiden door CD45 allotypische markers en dus na hun nageslacht. Kolonisatie met gemengde bevolking maakt het analyseren cel autonome verschillen in de biologische eigenschappen van de voorouders, terwijl kolonisatie met ofwel bevolking verwijdert mogelijk concurrerende selectieve druk. De gekoloniseerde thymus lobben kan ook geënt in mannelijke immunodeficiënte ontvangende muizen waardoor de analyse van het rijpe T cel nakomelingen in vivo, zoals populatiedynamica van tHij perifere immuunsysteem en kolonisatie van verschillende weefsels en organen. Foetale thymus orgaankweken gebleken dat E13 voorlopers snel ontwikkeld in alle volwassen CD3 + cellen en leidde tot de canonieke γδ T cel subsets, zogenaamde dendritische epitheliale T cellen. Ter vergelijking, E18 voorlopers een vertraagde differentiatie en konden dendritische epitheliale T cellen te genereren. De controle van perifeer bloed-thymus geënte CD3 - / - muizen voorts gebleken dat E18 thymus regelen voorlopers genereren, tijd, grotere aantallen mature T cellen dan hun tegenhangers E13, een eigenschap die niet konden worden gewaardeerd in de foetale thymus korte termijn orgaankweken.

Om een ​​methode thymus lobben van endogene thymocyten waardoor betere ontwikkeling koloniseren progenitors afbrekende kiezen, vergeleken we de niveaus van T-cel reconstitutie thymus lobben gekoloniseerd na bestraling of een 5-daagse deoxy-guanosine (d-Gua) behandeling. De resultaten tonen dat, terwijl er geen verschil op dag 9 van kweek, bestraald kwabben bevatte meer T-cellen dan behandeld met d-Gua, op dag 12. Aldus bestraling geschikter dan d-Gua behandeling om T cel ontwikkeling verzoekt nadat thymus kolonisatie <s...

Dit artikel beschrijft in vivo en in vitro methodologie om de thymische vestigingsprogenitors te karakteriseren door de analyse van de kinetiek van generatie, fenotype en aantallen van hun T-cel nakomelingen.

Karakterisering van Thymic Settling voorouders in de Mouse Embryo behulp<em&gt; In Vivo</em&gt; En<em&gt; In Vitro</em&gt; Testen

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Het algemene doel van deze procedure is om de fenotypekinetiek van de generatie en de aantallen T-cellen te analyseren die geproduceerd worden door thymische settlement-progenitors van E 13 of E 18. Dit wordt bereikt door eerst de thymische lobben te isoleren uit muisembryo's van E 13, E 14 en E 18. In de tweede stap worden de thymische lobben van E 14 bestraald en vervolgens gedurende 48 uur in een hanging drop gekoloniseerd met flow-gesorteerde E 13 of E 18 cellen.In de laatste stap worden de gekoloniseerde lobben getransplanteerd onder het nierkapsel van volwassen CD3-knockoutmuizen. Uiteindelijk kan flowcytometrie worden gebruikt om de aanwezigheid van de nakomelingen van de E13- en E18-thymische nederzettingsprogenitoren in het bloed van de chimerische dieren vast te stellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van onze bestaande methoden, zoals in vitro T-celkweek op feederscellen, is dat deze techniek methoden combineert die volledige T-celrijping vanuit gedefinieerde progenitoren in een driedimensionale assay mogelijk maken met het transplanteren van thymische organculturen in intacte recipientmuizen, waardoor de differentiatie en functie van de thymis

characterization-thymic-settling-progenitors-mouse-embryo-using-vivo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We presenteren stap-voor-stap instructies voor het genereren van neonatale hersenschimmen, alsmede de dissectie en voorbereiding van de thymus voor ex vivo beeldvorming door 2-Photon Microscopie.

In situ beeldvorming van de muis Thymus Met behulp van 2-Photon Microscopie

We hebben nieuwe laboratorium instrumenten en protocollen voor intravitale imaging verkrijging van thymus. Onze techniek zou moeten helpen bij de identificatie van 'niches' in de thymus, waar T-cel ontwikkeling optreedt.

Intravitale Beeldvorming van de Muis Thymus met behulp van 2-Photon Microscopy

This video demonstrates a protocol for generating functional antigen-specific T cells from iPSC-derived immature T cells using a three-dimensional thymic culture system. Co-culturing the iPSC-derived immature T cells with endogenous lymphocyte-depleted mice fetal thymic lobes resulted in successful maturation of the T cells to form CD8αβ+ MHC class I+ iPSC-derived thymic emigrants (iTEs).

Three-Dimensional Thymic Culture System to Generate iPSC-Derived Thymic Emigrants

Muis embryonale stamcellen kunnen in vitro worden gedifferentieerd tot T-cellen met behulp van het OP9-DL1 co-cultuursysteem. Succes bij deze procedure vereist zorgvuldige aandacht voor reagens/celonderhoud en belangrijke techniekgevoelige stappen. Hier bespreken we deze kritieke parameters en bieden we een gedetailleerd protocol om de adoptie van deze technologie te stimuleren.

Afleiding van T cellen In Vitro Van muis embryonale stamcellen

Het bestuderen van medullaire thymische epitheelcellen in vitro is grotendeels onsuccesvol geweest, omdat huidige 2D-kweeksystemen het in vivo scenario niet nabootsen. Het 3D-kweeksysteem dat hierin wordt beschreven - een gemodificeerd organotypisch model voor huidcultuur - heeft zich superieur getoond in het nadoen van mTEC-proliferatie, differentiatie en het behoud van promiscue genregulatie.

3D Organotypische Co-cultuur Model Supporting Medullary Thymic epitheelcelproliferatie, Differentiatie en Promiscuous Gene Expression

Dit protocol geeft een werkwijze kwantitatieve eencellige voeren in situ analyse van eiwitexpressie van afstamming specificatie mouse pre-implantatie embryo bestuderen. De noodzakelijke voor het verzamelen van blastocysten procedures, whole-mount immunofluorescentie detectie van eiwitten, beeldvorming van de monsters op een confocale microscoop, en nucleaire segmentatie en beeldanalyse worden beschreven.

Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo&#39;s

Terwijl infiltrerende macrofagen continu worden aangeworven op volwassen weefsels uit circulerende precursoren, zitten inwendige macrofagen hun weefsel tijdens ontwikkeling, waar ze worden gehandhaafd zonder verdere input van stamvaders. De voorlopers voor ingezette macrofagen werden recent geïdentificeerd. Hier presenteren wij methoden voor de genetische lotvorming van de ingezeten makrofage stamvaders.

Identificatie van Erythromyeloid Progenitors En Hun Nakomelingen In De Muis Embryo Door Flow Cytometry

In deze paper beschrijven we een protocol karakteriseren T-afhankelijke en T-onafhankelijke immunoglobulin (Ig) isotype reacties in muizen met behulp van ELISA. Deze methode gebruikt alleen of in combinatie met stroom cytometry onderzoekers te identificeren van verschillen in de B-cel-gemedieerde Ig isotype reacties in muizen na T-afhankelijke en T-onafhankelijke antigeen immunisatie zal toestaan.

Karakterisering van zwezerik-afhankelijke en Thymus-onafhankelijke Immunoglobulin Isotype reacties in muizen met behulp van Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Het doel van het protocol is te tonen longitudinale intravital real-time tracking van thymocytes door laser scanning microscopie in serie implantaten in de voorste kamer van het oog van de muis. De transparantie van het hoornvlies en vascularisatie van de prothese zorgt voor de continu opname progenitor cel aanwerving en rijpe T-cel-uitgang.

Real-time In Vivo Tracking van Thymocytes in de voorste kamer van het oog door Laser Scanning Microscopie

Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor het genereren van tumor antigeen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige Thymus emigants (iTE) door een driedimensionaal (3D) Thymus cultuur systeem. iET zijn een homogene deelverzameling van T-cellen die nauw verwant zijn aan naïeve T-cellen met de capaciteit voor proliferatie, Geheugenvorming en tumor onderdrukking.

Een driedimensionaal Thymic cultuur systeem voor het genereren van Murine geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige tumor antigen-specifieke Thymic emigranten

Dit artikel bevat een methode voor het isoleren van pure embryonale weefsels van kwartel en kip embryo's die kunnen worden samengevoegd tot ex vivo chimeer organen.

Isolatie van embryonale weefsels en vorming van kwartel-kip chimeer organen met behulp van het voorbeeld van de Thymus

Leer de karakterisering van thymische settelende voorouders in muizenembryo's met in vivo- en in vitro-technieken. Deze methode analyseert de kinetiek, fenotype en T-celproductie van deze progenitorcellen.

Karakterisering van Thymic Settling voorouders in de Mouse Embryo behulp

Meer video's verkennen