Karakterisering van Thymic Settling voorouders in de Mouse Embryo behulp

Het algemene doel van deze procedure is om de fenotypekinetiek van de generatie en de aantallen T-cellen te analyseren die geproduceerd worden door thymische settlement-progenitors van E 13 of E 18. Dit wordt bereikt door eerst de thymische lobben te isoleren uit muisembryo's van E 13, E 14 en E 18. In de tweede stap worden de thymische lobben van E 14 bestraald en vervolgens gedurende 48 uur in een hanging drop gekoloniseerd met flow-gesorteerde E 13 of E 18 cellen.

In de laatste stap worden de gekoloniseerde lobben getransplanteerd onder het nierkapsel van volwassen CD3-knockoutmuizen. Uiteindelijk kan flowcytometrie worden gebruikt om de aanwezigheid van de nakomelingen van de E13- en E18-thymische nederzettingsprogenitoren in het bloed van de chimerische dieren vast te stellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van onze bestaande methoden, zoals in vitro T-celkweek op feederscellen, is dat deze techniek methoden combineert die volledige T-celrijping vanuit gedefinieerde progenitoren in een driedimensionale assay mogelijk maken met het transplanteren van thymische organculturen in intacte recipientmuizen, waardoor de differentiatie en functie van de thymische slice-progenitoren en hun nakomelingen kunnen worden geëvalueerd.

Als onderzoeksingenieur met expertise in knaagdierchirurgie zal ik de procedure demonstreren. Twee dagen vóór het transplanteerexperiment wordt in een laminaire flowkast de buik van een drachtige vrouwelijke muis ontsmet met 70% ethanol. Maak een longitudinale incisie in de huid op de middellijn, trek de huid uiteen om de incisie te openen en gebruik vervolgens een pincet en een schaar om het peritoneum te openen zonder het spijsverteringskanaal aan te raken. Trek daarna de bifide uterus naar buiten en gebruik een schaar om deze van de vagina te scheiden. Plaats de uterus vervolgens in een Petri-schaal van 90 bij 15 millimeter met 40 tot 50 milliliters DPBS en snijd transversaal tussen de decidua van elk embryo.

Gebruik een fijne schaar en een fijne pincet om het spiermembraan van de uterus te verwijderen door tussen de placenta en de dooierzak te knippen om elk embryo eruit te halen. Verwijder vervolgens het amnion terwijl de embryo's behouden blijven, en plaats de embryo's in een nieuwe Petrischaal met HBSS plus 1%FCS. Om de thymus te isoleren, plaatst u de embryo's één voor één in rugligging onder een binoculair vergrootglas.

Voer vervolgens één pincet in de lengte langs het kraakbeen van het borstbeen in en klem en open de thoraxgrid met een gebogen pincet. Trek de thoraxwand opzij om de thymuslobuli aan weerszijden van de trachea te visualiseren. Klem vervolgens met een fijn pincet onder de thymus om elke lob voorzichtig te verwijderen en plaats deze in een Petrischaal met één milliliter HBSS plus 1% FCS.

Gebruik vervolgens twee fijne pincetten om het omringende bindweefsel te verwijderen zonder de lobben te beschadigen. Was de lobben daarna in drie milliliter HBSS plus 1% FCS om de rode bloedcellen te elimineren om te beginnen aan de fetale thymuskweeksel-bestraling. E 14 thymuskwabben geïsoleerd uit CD 45.2 embryo's zoals zojuist gedemonstreerd.

Laat de lobben ongeveer drie uur rusten. Centrifugeer vervolgens vers gesorteerde E 13 of E 18 thymische settling progenitors. Resuspendeer het pellet in cultuurmedium tot een uiteindelijke concentratie van 500 cellen per 35 µL medium.

Plaats vervolgens een druppel van 35 µL celсусpensie in om en om elke put van een 60-puts Terasaki-plaat en plaats één bestraalde lob op het oppervlak van elke druppel. Sluit de plaat en draai deze ondersteboven zodat de cellen door zwaartekracht de apicale pool van de druppel bereiken; tik voorzichtig tegen de bovenkant van de omgekeerde plaat om de lobben naar de apicale rand van de druppel te dwingen. Incubeer de omgekeerde plaat vervolgens 48 uur in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2.

Nadat de thymuslobben zijn gekoloniseerd, dient het anesthesieniveau van het ontvangende dier te worden geverifieerd door te controleren op de afwezigheid van een reflexrespons. Breng vervolgens een druppel oogzalf aan in elk oog en plaats de muis op haar rechterzijde onder een laminaire flowkast. Scheer daarna het operatiegebied net boven het gewricht van het achterpootje.

Trek vervolgens een paar steriele handschoenen aan en steriliseer het operatieveld met 70% ethanol en een 10% povidonjodiumoplossing. Gebruik een scalpel om een incisie van 1,5 centimeter door het huidweefsel te maken, gevolgd door een incisie door het spierweefsel. Oefen nu een lichte druk uit op beide zijden van de incisie om de nier uit de buikholte te dwingen en houd de nier vochtig met een zoutoplossing.

Houd de nier met een wattenstaafje buiten de retroperitoneale ruimte en maak met twee fijne pincetten een gaatje van twee tot drie millimeter in het kapsel. Houd vervolgens de wand van het kapsel open, schuif voorzichtig tot zes grafts van thymuskwabben onder de rand van de nierpool en plaats de nier terug in de retroperitoneale ruimte. Hecht de spierlaag en vervolgens de huid met individuele chirurgische knopen.

Bevocht vervolgens de wond met een 10% povidonjodiumoplossing en plaats de muis op een warmtemat van 37 graden Celsius; monitor het dier en de chirurgische wond totdat beide volledig zijn hersteld om de beste methode voor het uitputten van endogene thymocyten voor de ontwikkeling van koloniserende progenitoren te bepalen. In dit experiment werden de niveaus van T-celreconstitutie in een gekoloniseerde thymuskwab na bestraling of een vijfdaagse behandeling met deoxyguanosine vergeleken. Hoewel er op dag negen van de cultuur geen verschil in het aantal koloniserende lymfocyten zichtbaar was, bevatten de bestraalde kwabben op dag 12 meer T-cellen dan de kwabben die met deoxyguanosine waren behandeld, waardoor bestraling de voorkeursbehandeling is om de T-celontwikkeling na thymische kolonisatie te faciliteren. Om hier het ontwikkelingspotentieel van thymisch koloniserende progenitoren van E 13 en E 18 te bestuderen, werden bestraalde thymuskwabben van E 14 gekoloniseerd met een gelijk aantal van de twee typen progenitoren; zoals waargenomen gaven de thymisch koloniserende progenitoren van E 13 minder thymocyten en dubbelpositieve T-cellen voort dan de thymisch koloniserende progenitoren van E 18.

De frequentie van mature CD3-positieve cellen was echter verhoogd en de productie van dendritische epitheliale T-cellen werd uitsluitend gedetecteerd in de nakomelingen van de E13 thymische vestigingsprogenitoren. Om het in vivo potentieel van E13 en E18 thymische vestigingsprogenitoren te analyseren, werden thymische lobuli die gekoloniseerd waren met elk type progenitoren getransplanteerd onder het niermapsule van CD3-knockout ontvangers. Zoals zojuist gedemonstreerd en verwacht, gaven de E13 thymische vestigingsprogenitoren sneller aanleiding tot T-cellen dan de E18 progenitoren, hoewel het aantal circulerende T-cellen in de dieren gekoloniseerd met E13 thymische vestigingsprogenitoren overall significant lager was. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de ontwikkelingsimmunologie om de eigenschappen van T-cel subsets te onderzoeken, waarvan sommige een strikt embryonale oorsprong hebben in een zoogdiermodel.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de differentiële en functionele routes van Timex-settling progenitorcellen en hun nakomelingen kunt volgen, zowel in een natuurlijke omgeving als onder competitieve omstandigheden.