Een Mimic van de tumor micro: Een eenvoudige methode voor het genereren van verrijkte celpopulaties en Onderzoeken intercellulaire communicatie
September 20th, 2016
We hebben een permeabele microporeuze membraaninzet aangepast om het tumormicro-omgeving (TME) te imiteren. Het model bestaat uit een gemengde celcultuur, maakt een vereenvoudigde generatie van sterk verrijkte individuele celpopulaties mogelijk zonder het gebruik van fluorescente markering of celsortering, en maakt het mogelijk om intercellulaire communicatie binnen het TME te bestuderen onder normale of stressomstandigheden.
Het algemene doel van dit eenvoudige in vitro cocultuurmodel is om de kenmerken van een in vivo tumoromgeving na te bootsen, individuele celpopulaties te verrijken en verschillende vormen van intercellulaire communicatie te onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken op het gebied van kanker en radiobiologie, met name met betrekking tot de factoren die ten grondslag liggen aan het ontstaan van kanker-geassocieerde fibroblasten en de reacties op therapeutische middelen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de generatie van individuele celpopulaties uit een gemengde celcultuur mogelijk maakt zonder stress-inducerende fluorescentiemarkering of celsorteringen.
Begin met het wassen van de celcultuur van belang twee keer met vijf milliliter PBS. Na de tweede wassing, los de cellen los met één milliliter trypsin-EDTA op kamertemperatuur gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Quench vervolgens de reactie met negen milliliter compleet groeimedium, en pipet het medium voorzichtig 10 keer over het oppervlak van de flacon om de cellen te dissociëren.
Na het tellen, verdun de cellen tot een concentratie van 2,5 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter in vers medium en breng de cellen over naar een steriele 15 milliliter centrifugeerbuis. Centrifugeer de cellen neer en resuspendeer de pellet in vers groeimedium, aangevuld met 50% foetaal bovien serum bij een concentratie van 2,5 keer 10 tot de vijfde cellen per 70 microliters medium. Breng vervolgens inserts van de juiste experimentele poriëngrootte van hun verpakking over in individuele putjes van een multi-well plaat en bedek de plaat.
Houd de plaat vervolgens met beide handen vast, draai de plaat voorzichtig om zodat de onderkanten van de inserts omhoog komen te staan. Verwijder de bodem van de plaat. Houd met steriele pincetten in de ene hand een insert op zijn plaats en gebruik de andere hand om langzaam 70 microliters cellen in een micropipettip te aspireren.
Dispenseer vervolgens de cellen langzaam over het oppervlak van wat nu de bovenkant van het insert is. Na het zaaien van elk van de inserts, plaats de bodem voorzichtig weer op de plaat en incubeer de omgekeerde plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolzuurgas met vochtigheid gedurende 30 tot 45 minuten. Aan het einde van de incubatie, draai in een biologische veiligheidskast met laminaire luchtstroom de plaat voorzichtig weer om zodat de onderkanten van de inserts nu naar beneden staan.
Dompel vervolgens langzaam en voorzichtig de bodem van elk insert in twee milliliter voorverwarmd compleet medium en plaats de plaat terug in de bevochtigde incubator. Na 48 uur, vervang het medium in de bodem van elke put met twee milliliter vers groeimedium. Wanneer al het medium is ververst, zaai 2,5 keer 10 tot de vijfde cellen van de tweede populatie van belang op de bovenkant van de inserts in één milliliter vers medium en plaats de plaat terug in de incubator.
24, 48 en 96 uur later, vervang het medium bovenop elke insert met één milliliter vers compleet medium. En het medium op de bodem van elke put met twee milliliter vers compleet medium. Na 120 uur cocultuur, breng één insert per keer over in individuele 35-millimeter celcultuurschalen met één milliliter PBS.
En was de bodems en bovenkanten van de inserts met één milliliter PBS. Om de cellen die op de bodem van het insert zijn gekweekt te verzamelen, plaats de inserts met de bodem naar beneden in 200 microliters roomtemperatuur trypsin-EDTA. Na twee minuten bij kamertemperatuur, stop de reactie met 800 microliters compleet groeimedium.
Houd het insert vervolgens in een lichte hoek en pipet de supernatant voorzichtig 10 keer over het oppervlak van de cellen, waarbij de cellen in de plaat worden verzameld. Wanneer alle inserts zijn verwijderd, resuspendeer de cellen in een concentratie van twee keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter groeimedium. En voeg 250 microliters cellen toe aan steriele individuele glazen dekglasjes.
Plaats de dekglasjes in de bevochtigde incubator gedurende één uur. Aan het einde van de incubatie, voeg in een biologische veiligheidskast met laminaire luchtstroom voorzichtig twee milliliter compleet groeimedium toe aan de plaat en incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolzuurgas met vochtigheid gedurende 48 uur. Was vervolgens de cellen drie keer met PBS.
Na de derde wassing, fixeer de cellen in 4% formaldehyde in PBS gedurende tien minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door vijf wasbeurten met Tris-gebufferd zout. Na de laatste wassing, permeabiliseer de cellen met 0,25% Triton X-100 aangevuld met 0,1 saponine gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door incubatie in blokkeringsoplossing gedurende één uur bij kamertemperatuur. Label vervolgens de monsters met het primaire antilichaam van belang in blokkeringsoplossing bij vier graden Celsius gedurende een nacht.
De volgende ochtend, verwijder het ongebonden antilichaam met drie minuut wasbeurten in wasoplossing, gevolgd door een uur incubatie bij kamertemperatuur in de juiste secundaire antilichaam in blokkeringsoplossing. Aan het einde van de incubatie, was het ongebonden secundaire antilichaam zoals net gedemonstreerd en monteer de dekglasjes op individuele slides met antifade montagemedium dat DAPI bevat. Verzegeld de randen van de dekglasjes met heldere nagellak.
Beeld vervolgens de cellen af onder 63x olieverspreiding op een omgekeerde microscoop uitgerust met een externe lichtbron voor fluorescentie-excitatie. Dit systeem maakt het mogelijk om ten minste 120 uur twee verschillende celpopulaties te laten groeien aan weerszijden van de poreuze membranen van celcultuurinserts, met een zuiverheid van meer dan 99% in de celpopulaties aan weerszijden van het membraan, wanneer inserts met 0,4 of één micron poriën worden gebruikt. Inserts met drie micron poriën zijn echter groot genoeg om de cellen toe te laten om over het membraan te migreren, zoals waargenomen in dit experiment met een GFP-positieve humane borstkankercellijn.
Inserts met 0,4 micron poriën beperken ook de vorming van functionele gap junctions tussen de celculturen
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een eenvoudig in vitro cocultuurmodel dat is ontworpen om de tumormicro-omgeving (TME) te repliceren. Het model vergemakkelijkt de verrijking van individuele celpopulaties en maakt de onderzoeking van intercellulaire communicatie onder verschillende omstandigheden mogelijk.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Kankerbiologie
- Radiobiologie
- Celcultuurtechnieken
Achtergrond
- De tumormicro-omgeving speelt een cruciale rol in de progressie van kanker.
- Begrip van intercellulaire communicatie is essentieel voor therapeutische vooruitgang.
- Traditionele methoden omvatten vaak stress-inducerende technieken.
- Deze studie heeft tot doel het proces van het bestuderen van celinteracties te vereenvoudigen.
Doel van het onderzoek
- Om de in vivo kenmerken van de TME na te bootsen.
- Om individuele celpopulaties uit gemengde culturen te verrijken.
- Om modi van intercellulaire communicatie te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een permeabele microporeuze membraaninzet.
- Gemengde celcultuurbenadering.
- Detachering van cellen met behulp van trypsin-EDTA.
- Stoppen van de reactie met compleet groeimedium.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van verrijkte individuele celpopulaties.
- Facilitering van intercellulaire communicatiestudies.
- Reductie van stress geassocieerd met fluorescente tagging.
- Inzichten in het gedrag van kanker-geassocieerde fibroblasten.
Conclusies
- Het model bootst effectief de TME na.
- Het biedt een waardevol hulpmiddel voor kankeronderzoek.
- De methode versterkt het begrip van celinteracties bij kanker.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This in vitro tumor microenvironment model enables biopharma R&D teams to study early cancer-stroma interactions without perturbing cell physiology, supporting mechanistic de-risking in target validation. By generating highly enriched cancer-associated fibroblast populations and controlling intercellular communication modes, the method provides quantitative insights into stromal modulation of tumor behavior and therapeutic response. It addresses a critical gap in preclinical models by allowing isolation of viable, functional cell populations for downstream analysis, thereby improving predictive confidence in early discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by elucidating heterotypic signaling between carcinoma cells and stromal precursors.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional validation of stromal targets without fluorescent tagging or cell sorting artifacts.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by identifying stromal mediators that influence cancer cell responses to therapeutic agents.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening by maintaining physiologically relevant co-culture conditions over extended periods.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled pore-size selection that defines communication modes (secreted factors vs. gap-junction).
- Scalability: Enables platform reuse across multiple cancer-stroma pairings for consistent intercellular communication studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by modeling early TME evolution using human breast carcinoma and normal diploid fibroblasts.
- Operational Value: Provides continuity from discovery to preclinical validation by yielding harvestable, high-purity cell populations for protein expression, migration, and drug response assays.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports advancement criteria by quantifying stromal impact on tumor cell behavior under therapeutic pressure.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for stroma-modulating therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled co-culture of cancer and stromal cells to isolate communication-dependent phenotypes.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via enriched cell populations suitable for immunoblotting, immunofluorescence, and functional assays after 120-hour co-culture.
- Analytics: Generates measurable readouts such as caveolin-1 downregulation in fibroblasts, enabling statistical comparison of stromal activation states.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing stromal cells that reflect in vivo-like activation states for drug response studies.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular platform adaptable to various cancer types and stromal lineages, reducing redundant model development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cancer-stroma signaling.
- Operational Value: Delivers standardization and scalability through defined pore-size parameters and stress-free cell harvesting.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing stromal-mediated resistance or sensitivity early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their modulation by tumor-associated stroma.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile cell culture techniques and microporous membrane handling.
- Depends on access to multi-well dishes, cell culture inserts with defined pore sizes (0.4, 1, 3 μm), and standard incubation equipment.
- Necessitates cross-team standardization of co-culture duration, medium composition, and insert orientation for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending to non-fibroblastic stromal cells or alternative cancer models.
- Limited by the inability to study direct cell migration unless using inserts with pore sizes ≥3 μm, as smaller pores restrict physical cell movement.
