Live beeldvorming en karakterisering van microglia-dynamica en interacties met synapsen in een zieke muisnetvlies

De reikwijdte van het onderzoek van ons laboratorium is het bestuderen van de onderliggende mechanismen van glaucoom en microglia bij synapsherstructurering tijdens de ontwikkeling. De huidige experimentele uitdagingen draaien om de vraag of microglia actief synapsen van retinale ganglioncellen ontmantelen of dat ze gewoon passief puin verwijderen. Begin met muisnetvlies op een filterpapier en droog het met een laboratoriumdoekje.

Draai het netvlies om op een MatTek petrischaal. Verzwaar het netvlies met metalen kralen of een ring. Voeg vervolgens drie tot vijf druppels kunstmatig hersenvocht toe.

Plaats het monster onder een draaiende schijf confocale microscoop en pas de instellingen aan om het netvlies te bekijken. Verzamel beelden langs de Z-as op een totale diepte van 10 tot 20 micrometer met een stapgrootte van 0,3 micrometer. Houd het tijdsinterval tussen frames op 20 tot 30 seconden om betrouwbare celtracking mogelijk te maken.

Om oppervlakterendering van de microglia uit te voeren, converteer je het timelapse-bestand naar IMS-formaat met behulp van de bestandsconvertersoftware. Voer de voxelgroottes in op basis van de eerder verkregen beeldeigenschappen. In de analysesoftware-arena klik je op de observe map om het geconverteerde bestand te openen en te controleren of de afbeelding in 3D-weergave is.

Om individuele microglia te detecteren, klik je op het icoon 'nieuw oppervlak toevoegen' in de objectwerkbalk. Selecteer segment alleen een interessegebied, volg oppervlakken in de tijd, classificeer oppervlakken en object-objectstatistieken onder algoritme-instellingen. Klik vervolgens op de blauwe afspeelknop om verder te gaan.

Kies het kanaal voor surface rendering. Optioneel kunt u 'glad' inschakelen om de oppervlaktecreatie glad te maken en de oppervlaktedetails in te voeren. Kies onder het drempelen machine learning-segmentatie voor het detecteren van cellen.

Gebruik tijdens de trainingsgegevens de achtergrond- en voorgrondpenseeltools. Teken penseelstreken door het gewenste penseel te selecteren en de shift plus linkermuisknop te gebruiken. Zorg dat interpolatieweergave is ingeschakeld, selecteer vervolgens trainen en voorspellen.

Gebruik de gele aanwijzer in het midden om over de Z-as te navigeren. Teken meerdere lijnen over de X-, Y- en Z-vlakken, en over een paar tijdsbestekken. Gebruik drie tot vijf korte slagen per invoer, en pas iteratief aan totdat er een nauwkeurig oppervlak is gemaakt.

Gebruik de gele rechthoek om te schakelen tussen het trainingsdisplay en het daadwerkelijke oppervlak dat is aangemaakt als laatste controle. Controleer ook in de timelapse of het oppervlak overeenkomt met de celmorfologie. Als dat klaar is, selecteer je split-objecten uit.

Pas de voxelhistogramdrempel aan om kleine, niet-verbonden objecten te verwijderen die geen deel uitmaken van het primaire oppervlak. Bewerk vervolgens handmatig het oppervlak om overbodige objecten te verwijderen of randen te knippen met het schaargereedschap. Indien gewenst, stel een drempel in van toegestane gaten voor het object en selecteer het tracking-algoritme voor de bewegende cel.

Filtertrackobjecten die niet aan het hoofdoppervlak zijn gekoppeld. Zodra je klaar bent, stel je het moving cells-display in op een transparant profiel om de puncta voor de volgende stappen te visualiseren. Om individuele PSD95-punten te detecteren, klik je op het blauwe oppervlak-icoon in de objectwerkbalk.

Selecteer vervolgens trackspots over tijd, classificeer spots en object-objectstatistieken en druk op play. Selecteer het bronkanaal voor de synaptische marker. Zet slicer en andere kanalen uit om alleen PSD95 te visualiseren.

Gebruik de bedieningsknop en het pointerselectiegereedschap om de XY-diameter van de puncta te schatten. Kies een paar felle puncta die over de frames blijven bestaan en zet achtergrondaftrekking uit. Voeg vervolgens een filter toe op basis van spotkwaliteit.

Pas het histogram aan om nauwkeurige PSD95-puncta over alle tijdsbeurten te vermelden. Verwijder de vals-positieve plekken via bewerking. Schakel tussen de kubus of cirkelcursor om plekken te verwijderen die maar één of twee frames duren.

Indien gewenst, stel een drempel in van toegestane gaten en kies het trackingalgoritme voor synaptische vlekken. Filter spotsporen die niet aan echte puncta zijn gekoppeld met behulp van een histogramdrempel om kleine objectsporen uit te sluiten. Definieer classificaties met behulp van de kortste afstand tot oppervlakteclassificatie.

Ingesloten als elke puncta kleiner dan nul micrometer, gecontacteerd ongeveer tussen nul en 0,5 micrometer van het oppervlak, en ongecontacteerd als 0,5 plus micrometer. Wijs labels toe aan gebeurtenissen met behulp van de hierboven genoemde classificaties. Zodra de oppervlakken en vlekken microglia en punta correct vertegenwoordigen, exporteer je alle statistieken onder het tabblad statistieken.

Microglia vertoonden een verhoogde procesverplaatsingslengte na laser-geïnduceerde oculaire hypertensie in vergelijking met de controlegroep. De microgliale snelheid was significant hoger in laserbehandelde ogen dan bij controles. Het aantal contactgebeurtenissen tussen microglia en PSD95 puncta nam toe na laserbehandeling.

Timelapse-opnames toonden aan dat laserbehandelde netvliezen een grotere microgliale motiliteit vertoonden en meer interacties met PSD95 puncta verlieten dan controleretinas. Onze belangrijke bevindingen hebben aangetoond dat er een toename is van het aantal microglia, de complexiteit en de motiliteit, en synaptische colokalisatie na een tijdelijke verhoging van de intraoculaire druk bij muizen. Ons protocol biedt ex vivo beeldvorming, wat helpt om problemen met staar en hoornvliesdichtheid te voorkomen, waardoor de installatie van snellere experimenten en een hogere doorvoersnelheid wordt gemakkelijker.

Onze bevindingen bevorderen het onderzoek door visualisatie mogelijk te maken van microglia-neuroninteracties, cellulaire communicatie en dynamiek met behulp van transgene fluorescentielijnen, evenals high-resolution time-lapse imaging.