Een alternatief en gevalideerd injectiemethode voor toegang tot de Subretinal Space

Het hoofddoel van deze studie is het beschrijven van een nieuwe techniek voor subretinale injectie die kan worden gebruikt om virale vectoren, farmacologische middelen of induceerde pluripotente stamcellen in de subretinale ruimte van muizen te brengen. Deze methode kan sleutelvragen in de visuiewetenschap en oogheelkunde beantwoorden, zoals het beoordelen van de effectiviteit van nieuwe therapeutische interventies voor retinale degeneraties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden gebruikt om materiaal met hoge efficiëntie in de subretinale ruimte af te leveren, met minimale schade en een snel herstel van de retinale structuur en functie.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Sachin P, een technicus uit mijn laboratorium. Trim ter voorbereiding op deze procedure de snorharen van een geanestheseerde muis om de visualisatie te vergemakkelijken, en houd de lichaamstemperatuur van het dier op 37 °C met een circulerend waterkussen. Dilateer vervolgens de pupillen met 2,5% fenylefrine-oogdruppels.

Smeer vervolgens methylcellulose-oogdruppels toe om uitdroging te voorkomen en om kortstondige cataract door anesthetica te minimaliseren. Steriliseer de instrumenten voorafgaand aan de operatie. Bereid daarna de verdunde fluoresceïne voor in een veiligheidskast.

Vul de spuit met de juiste hoeveelheid fluoresceïne. Voer vervolgens een knijptest in de teen uit om te bevestigen dat het dier diep onder narcose is, en positioneer de muis zodanig dat het oog dat geïnjecteerd moet worden naar boven is gericht en duidelijk zichtbaar is in de dissectiemicroscoop. Knijp voorzichtig in de temporale conjunctiva met een pincet met fijne punten.

Maak vervolgens een circumferentiële incisie van ongeveer 90 graden met de gebogen Vannas-schaar. Herhaal deze procedure op het onderliggende kapsel van Tenon. Resecteer daarna het omringende bindweefsel met fijne pincetten, terwijl de oogbol neusaartoe wordt gedraaid.

Werk richting de injectieplaats, ongeveer 0,5 millimeter verwijderd van de nervus opticus, en wees zeer voorzichtig om beschadiging van de sinus retroorbitalis te vermijden. Een cruciale stap is het blootleggen van de injectieplaats, waarvoor rotatie van het oog vereist is zonder het oog zelf of bijbehorende structuren te beschadigen, waarbij in het bijzonder schade aan de orbitale bloedzak moet worden voorkomen. Maak bij deze procedure een kleine incisie in de sclera op de injectieplaats door de oogbeker voorzichtig te bekrassen met een oogheelkundig mesje van 22,5 graden.

Deze incisie moet net groot genoeg zijn om de punt van de naald door de sclera te laten passeren. Voer vervolgens de schuine 33 gauge naald in de sclerotomie in, waarbij de schuinte parallel aan en in de richting van het netvlies is geplaatst. Injecteer de gewenste hoeveelheid 0,01% fluoresceïne door de zuiger langzaam met een gelijkmatige druk in te drukken.

Let op dat er een lichte weerstand gevoeld zal worden bij het indrukken van de zuiger wanneer de naald zich in de subretinale ruimte bevindt. Er zal geen weerstand zijn als de naald de retina doorboort, maar een hoge weerstand als de naald de sclera of het RPE niet penetreert. Een andere kritische stap is de injectie gericht op de subretinale ruimte.

Dit moet worden uitgevoerd zonder door de neurosensitieve retina heen te dringen tot in de glasvochtruimte. Wacht enkele seconden voordat de naald wordt teruggetrokken om terugstroom te minimaliseren. Spoel het oog vervolgens schoon met steriele zoutoplossing en zorg ervoor dat het oog is teruggedraaid naar de normale positie.

Breng vervolgens een dikke laag triple antibioticum-oogzalf aan op het hoornvlies van het geïnjecteerde oog. Plaats de muis daarna in een schone individuele kooi om te herstellen. Bewaak de ademhaling en temperatuur tijdens het herstel van de anesthesie en controleer of het dier in sternale ligging kan blijven.

Voer aanvullende passende postoperatieve monitoring en behandeling uit, inclusief een subcutane injectie van carprofen voor de beheersing van postchirurgische pijn. Hier is een 3D-reconstructie van de koepelvormige bleb op de injectieplaats. De koepelvormige bleb is vervolgens wit ingekleurd om de omvang en marges van de netvliesloslating aan te geven.

Retinale dwarsdoorsneden uit de OCT zijn in het wit te zien, terwijl de met vloeistof gevulde ruimte op het niveau van het RPE en de fotoreceptoren zwart verschijnt. In deze figuur worden de representatieve OCTB-scans op de plaats van de maximale retinale loslating getoond voor de injectie, 10 minuten na de injectie en vier weken na de injectie. Deze afbeelding toont de vorming en resolutie van een vlakke bleb na een injectie van 0,3 µL.

En deze afbeelding toont de vorming en resolutie van een koepelvormige bleb na een injectie van 0,5 µL, terwijl deze afbeelding de vorming en resolutie van een koepelvormige bleb toont na een injectie van 1 µL. Tot slot is hier een voorbeeld van ernstige choroïdale littekenvorming en retinaal uitdunning op de injectieplaats. Retinae behouden hun normale functie na de resolutie van de bleb.

Bij negen verlichtingsintensiteiten worden de golfvormen voor scotopische, door staafjes gemedieerde responsen getoond voor vóór de injectie en vier weken na de injectie voor injecties van 0,3 microliter, 0,5 microliter en 1 microliter. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 10 tot 15 minuten per oog worden voltooid. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de gezondheid van de ogen te evalueren voordat men begint.

Sluit ogen uit met hoornvlies- of lensopaciteiten, of diepliggende ogen waarbij deze procedure zeer moeilijk zou zijn. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals OCT en fundusfotografie, worden uitgevoerd om de kwaliteit van de injectie te evalueren.