Name: Een alternatief en gevalideerd injectiemethode voor toegang tot de Subretinal Space via Een Transcleral Posterior Approach (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Leer een nieuwe subretinale injectietechniek voor therapeutische toediening bij muizen met minimale schade en snel herstel. Deze methode ondersteunt onderzoek naar retinale degeneraties en gentherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken voor de steun van de Harold en Pauline Price Chair in Ophthalmology en het Jules Stein Eye Institute aan MBG, de NEI Core-subsidie (EY00331-43) aan SN. Het onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door een genereuze gift van de familie Sakaria aan SN en MGB, en door een onbeperkte subsidie van Research to Prevent Blindness aan het Department of Ophthalmology. We danken Charlotte Yiyi Wang van de Berkeley School of Optometry voor het verkrijgen van de eerste OCT-beelden van subretinale injecties.

Dieren: Wild-type C57BL / 6J muizen gekweekt aan de Universiteit van Californië in Los Angeles (UCLA). Alle dieren waren tussen 11-17 weken oud, en omvatte mannelijke en vrouwelijke muizen. Alle muizen werden in groepen te huisvesten, onderhouden in een 12:12 licht / donker-cyclus met voedsel en water ad libitum. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen van UCLA en de Vereniging voor Onderzoek in Visie en Oogheelkunde Verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Vision Research. LET OP: Alle drugs en injecteerbare agenten zijn United States Pharmacopeia (USP) rang. 1. Chirurgische Voorbereiding <ol><li> Verdoven de muis met een intraperitoneale injectie van 100 mg / kg ketamine en 8 mg / kg xylazine in een zoutoplossing mix. Dien anesthesie tot een diepte zodanig dat de muis heeft geen teen knijpen of hoornvlies aanraking reflexen. </li><li> Handhaaf de lichaamstemperatuur bij 37,0 ° C met een circulerend water pad. </li><li> Verwijden leerlingen met 2,5% fenylefrine eye drops en trim snorharen om visualisatie te vergemakkelijken. Bakkebaarden bieden significante sensorische input voor de muis derhalve whisker trimmen mag alleen het gedeelte te verwijderen die blokkeert goed toegankelijk voor het oog, en niet aan de basis van de whisker. In onze ervaring, muizen tonen normaal herstel na deze procedure. Solliciteer methylcellulose oogdruppels tot droog te voorkomen en te minimaliseren verdoving geïnduceerde voorbijgaande cataract 13. </li><li> Steriliseren instrumenten voorafgaand aan de operatie (dwz betadine en ethanol of warm kralen). </li><li> Bereid verdunde fluoresceïne (0,01% met behulp van 0,9% zoutoplossing) in een steriele omgeving (dat wil zeggen, bioveiligheid kast) of visualisatie wordt uitgevoerd (zie punt 3 hieronder). </li></ol> 2. Injectie Site Voorbereiding <ol><li> Bereid een injectiespuit (bijvoorbeeld 5 gl spuit) gepaste injectievolume (bijvoorbeeld 0,3 tot 1,0 gl). </li><li> Plaats de muis, zodat het oog naar boven en duidelijk zichtbaar in de dissecting microscoop. </li><li> Knijp de temporele bindvlies met fijne getipt pincet. Maak een omtrek incisie van ongeveer 90 graden met behulp van gebogen Vannas schaar. </li><li> Herhaal stap 2.3 met capsule de onderliggende Tenon. </li><li> Resect het omringende bindweefsel met fijne getipt pincet tijdens het draaien van de hele wereld nasaal. Werken aan de injectieplaats ongeveer 0,5 mm tijdelijk aan de oogzenuw. Gebruik grote zorg om te voorkomen dat het verstoren van de retro-orbitale sinus. </li></ol> 3. sclerotomie en Subretinal Injection OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat de injectie van 0,01% fluoresceïne in 0,9% zoutoplossing worden gebruikt om te helpen met visualisatie tijdens het leren van deze procedure. De topografische distributie van fluoresceïne kan effectief worden gedocumenteerd met fundus beeldvorming (zie punt 4 hieronder). <ol><li> Maak een kleine sclerale incisie op de injectieplaats door zachtjes krassen op de oogschelp met een 22,5 graden oogheelkundige mes. Deze incisie shouLD alleen groot genoeg om de punt van de naald door de sclera te passeren. </li><li> Plaats de afgeschuinde 33 G naald (hoek 5 -. 10 ° in de sclerotomie de afschuining gericht en hoekig evenwijdig aan het netvlies Injecteer gewenste volume (bijvoorbeeld 0,3 tot 1,0 ui van 0,01% Fluoresceïne voor leerdoeleinden). OPMERKING: Handhaaf steriliteit van de injectiespuit door het grondig reinigen met opeenvolgende wassingen van een geschikt oplosmiddel en DI-water voor elke injectie. </li><li> Druk de zuiger langzaam (meer dan 3 sec) zonder het verplaatsen van de naald en met gelijkmatige druk. LET OP: Als de naald in de subretinale ruimte, zal een lichte weerstand gevoeld worden, terwijl het indrukken van de zuiger. Er zal geen tot minimale weerstand zijn als de naald prikt het netvlies, en een hoge weerstand als de naald de sclera of RPE niet doordringen. </li><li> Wacht enkele seconden voordat de naald terug te trekken om terugstroom te minimaliseren. </li><li> Spoel het oog met steriele zoutoplossing en zorgen voor het oog hals terug naar zijn normale positie geroteerd. </li></ol> 4. Beoordeling van Netvliesloslating van oktober en Fundus Imaging <ol><li> Voer oktober beeldvorming direct na de toediening van de kwaliteit van de injectie te evalueren en op geschikte tijdstippen na injectie als nodig netvliesstructuur evalueren. OPMERKING: Voorbeelden van het gebruik van LGO soortgelijke studies is eerder beschreven 7,14. <ol><li> Pas en lijn beeld oktober naar de plaats van injectie te richten. De injectieplaats moet middellijn en 0,5 mm tijdelijk aan de oogzenuw hoofd. Herhaal dit zo nodig als het detachement is uit frame of niet optimaal gecentreerd. </li></ol></li><li> Visualiseer netvliesloslating en kleurstof injectie met en-gezicht fundus imaging 7,14. LET OP: Als een LGO imaging-systeem niet beschikbaar is, injectie van een kleine hoeveelheid fluoresceïne met een vector voor de praktijk zal visualisatie bij elke fundus camera die fluoresceïne angio presteert toestaanGraphy met dezelfde golflengten en filters blokkeren. Gelokaliseerde gebieden van hyper-fluorescentie zal verschijnen onder het vaatstelsel en het vaatstelsel zullen scherpe en duidelijke grenzen hebben als de subretinale ruimte correct is gericht. De rand van de bleb van de injectie wordt afgebakend door de overgang van hyper- hypo- fluorescentie. Diverse instrumenten voorzien deze mogelijkheid voor de muis; de instrumentatie die hier gebruikt wordt elders 14 beschreven. </li></ol> 5. postoperatieve zorg <ol><li> Breng een dikke laag van triple antibiotica oogheelkundige room aan de cornea oppervlak van de geïnjecteerde oog. </li><li> Plaats muizen in schone eenzame kooien voor herstel. Niet muizen die een operatie hebben ondergaan, totdat ze volledig hersteld te combineren. </li><li> Monitor ademhaling en temperatuur tijdens anesthesie herstel. Monitor dieren totdat ze borstligging kunnen handhaven. </li><li> Voer extra juiste post-operatieve bewakingen behandeling, met een subcutane injectie van carprofen (5 mg / kg) voor post-operatieve pijn. </li></ol> 6. Beoordeling van retinale functie door Electroretinografie (ERG) <ol><li> Voer ERG analyse pre-injectie en op geschikte tijdstippen na de injectie als nodig is om het netvlies functie te evalueren. Als de injectie werd gemaakt in de subretinale ruimte, moet netvliesloslating verdwijnen binnen 72 uur. <ol><li> Gebruik standaard ERG technieken om retinale functie geëvalueerd voor en na de injectie zoals eerder beschreven 14,15. </li></ol></li></ol> 7. 3D Wederopbouw en Bleb Volume kwantificering LET OP: oktober scans met een hoog contrast omvat het gehele detachement in het kader van het uitzicht zijn optimaal voor gebruik. ImageJ / Fiji 17,18 en Imaris werden gebruikt, maar ook andere software kan worden gebruikt. <ol><li> Exporteer de b-scan van belang, de invoer in ImageJ / Fiji en gewas (Afbeelding&gt; Crop) het gedeelte van de oktober sceen te worden gemodelleerd met behulp van de rechthoekige selectie tool. <ol><li> Stel contrast (Afbeelding&gt; Aanpassen&gt; Helderheid / Contrast) en de afbakening van eventuele ontbrekende grenzen door het verbinden van twee delen met een lijn. </li><li> Trek een rechte lijn met de line tool (met shift) dat de RPE aan de fotoreceptor laag overspant. Measure (Analyze&gt; Measure) de lengte van de lijn om de grootte van de maximale onthechting te krijgen voor stap 7.8. </li></ol></li><li> Import bijgesneden frames om de 3D-reconstructie software (zie tabel van materialen) met behulp van de &quot;RGB naar grijs&quot; plugin en MATLAB Compiler Runtime. </li><li> Stel de voxel grootte (onder Eigenschappen afbeelding) met behulp van de kalibratie parameters uit de LGO scan (x, y, z). </li><li> Voer de &quot;RGB Gray&quot; plugin (onder Eigenschappen afbeelding), met gelijke weging voor elk kanaal, een vierde kanaal te maken. Verwijder origineel rood-groen-blauw-kanalen. </li><li> Keren de grijze kanaal met contrast verandering. Store Afbeelding. </li><li> Klik op de &quot;voeg eenew oppervlak &quot;knop in het tabblad 3D-View, en beginnen met de begeleide 4 stap proces van het creëren van het oppervlak. <ol><li> Stel het maaiveld detail (stap 1 van 4). LET OP: In onze ervaring 8,0-12,0 was de meest effectieve bereik. </li><li> Zet de bol grootte (onder Achtergrond Selectie) iets minder dan de maximale grootte detachement gemeten in 7.1.2. Maak het oppervlak en ongedaan te maken grijze kanaal inversie (stap 2 van 4). </li><li> Stel de drempel op de maximale waarde, zodat het oppervlak van de negatieve ruimte buiten het netvlies en de onthechting niet in contact komen (stap 3 of 4). </li><li> Stel het filtertype het aantal voxels en isoleren negatieve ruimte in het losmaken plaats op grootte. Finish het oppervlak (stap 4 van 4). Opmerking: Het volume van de loslating oppervlak onder volume in het tabblad statistieken. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Garoon, R. B., Stout, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+ocular+gene+therapy+and+advances+in+treatment+of+inherited+retinal+diseases+and+exudative+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Update on ocular gene therapy and advances in treatment of inherited retinal diseases and exudative macular degeneration.</a> Curr Opin Ophthalmol. 27 (3), 268-273 (2016).</li>
<li>Pierce, E. A., Bennett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Status+of+RPE65+Gene+Therapy+Trials%3A+Safety+and+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">The Status of RPE65 Gene Therapy Trials: Safety and Efficacy.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 5 (9), a017285(2015).</li>
<li>Tolmachova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+Rab+escort+protein+1+following+AAV2-mediated+gene+delivery+in+the+retina+of+choroideremia+mice+and+human+cells+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo.</a> J Mol Med (Berl). 91 (7), 825-837 (2013).</li>
<li>Nork, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+anatomic+consequences+of+subretinal+dosing+in+the+cynomolgus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).</li>
<li>Ye, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+Biodistribution+Evaluation+in+Cynomolgus+Macaques+of+rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3%2C+a+Recombinant+AAV+Vector+for+Treatment+of+Achromatopsia%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Safety and Biodistribution Evaluation in Cynomolgus Macaques of rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3, a Recombinant AAV Vector for Treatment of Achromatopsia.</a> Hum Gene Ther Clin Dev. , (2016).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-Corneal+Subretinal+Injection+in+Mice+and+Its+Effect+on+the+Function+and+Morphology+of+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina.</a> PLoS One. 10 (8), e0136523(2015).</li>
<li>Engelhardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+analysis+of+the+subretinal+injection+of+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological analysis of the subretinal injection of retinal pigment epithelium cells.</a> Vis Neurosci. 29 (2), 83-93 (2012).</li>
<li>Lambert, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+AAV2.COMP-Ang1+suppresses+choroidal+neovascularization+and+vascular+endothelial+growth+factor+in+a+murine+model+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Subretinal AAV2.COMP-Ang1 suppresses choroidal neovascularization and vascular endothelial growth factor in a murine model of age-related macular degeneration.</a> Exp Eye Res. 145, 248-257 (2016).</li>
<li>Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+technique+for+subretinal+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimized technique for subretinal injections in mice.</a> Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).</li>
<li>Nusinowitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+visual+function+in+the+rd12+mouse+model+of+Leber+Congenital+Amarousis+%28LCA%29+after+gene+replacement+therapy+to+restore+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Cortical visual function in the rd12 mouse model of Leber Congenital Amarousis (LCA) after gene replacement therapy to restore retinal function.</a> Vision Res. 46 (22), 3926-3934 (2006).</li>
<li>Huang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+analysis+of+the+subretinal+injection+of+human+retinal+progenitor+cells+under+Cyclosporin+A+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological analysis of the subretinal injection of human retinal progenitor cells under Cyclosporin A treatment.</a> Mol Vis. 20, 1271-1280 (2014).</li>
<li>Maguire, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+gene+transfer+for+Leber%27s+congenital+amaurosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis.</a> N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).</li>
<li>Ridder, W. 3rd, Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+of+cataract+development+in+anesthetized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Causes of cataract development in anesthetized mice.</a> Experimental Eye Research. 75 (3), 365-370 (2002).</li>
<li>Ridder, W. H. 3rd, Nusinowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+visual+evoked+potential+in+the+mouse--origins+and+response+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">The visual evoked potential in the mouse--origins and response characteristics.</a> Vision Res. 46 (6-7), 902-913 (2006).</li>
<li>Matynia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+are+the+primary+but+not+exclusive+circuit+for+light+aversion%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are the primary but not exclusive circuit for light aversion.</a> Experimental Eye Research. 105, 60-69 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
</ol>

Geen van de auteurs heeft commerciële belangensverstrengeling.

Subretinale injecties zijn de voorkeurswerkwijze voor de afgifte van virale vectoren en stamcellen afgeleide therapie voor het manipuleren fotoreceptoren en RPE zowel fundamenteel onderzoek en klinische behandeling. Bij patiënten, worden subretinale injecties meestal gedaan met een voorste sclerotomie bij de pars plana, een posterior kern vitrectomie en penetratie van het netvlies door de naald met directe visualisatie. Zoals bij de meeste vitrectomie procedures, is het gebruikelijk voor cataract voortijdig plaatsvinden...

Subretinale injecties zijn het belangrijkste middel van het leveren van cellulaire en virale middelen om de netvliezen van muizen om hun effecten op fotoreceptoren en de onderliggende RPE 1,2 bestuderen. Meest subretinale injectie protocollen muizen hebben een transcorneal of transcleral injectieplaats juist voor de evenaar (figuur 1). Deze benadering kan leiden tot inherente nevenschade die knikken en resulterende vertroebeling van de lens, verstoring van de integriteit van het glasachtig lichaam binnendringen van de neurosensorische retina en iris, retinale bloeding, netvliesloslatingen aanzienlijke en blijvende subretinale oedeem 3-9 omvat. Experimentele manipulaties moeten deze effecten om de effecten van therapeutische interventies 3,7,10,11 evalueren overwinnen. Deze studie geeft een gedetailleerde beschrijving en validatie van een posterior transcleral injectie methode die deze complicaties vermijdt, minimaliseert trauma en heeft een hoog slagingspercentage van gericht op de subretinale ruimte. Injecties gericht op de subretinale ruimte in muizen vaak zeer moeilijk uit te voeren en de meeste onderzoekers geconfronteerd met een hoge frequentie van mislukte pogingen waarbij de vector een onjuiste locatie wordt geleverd of er significante schade aan het netvlies, bijvoorbeeld in een volledige netvliesloslating 6. Het aantal ogen uitgesloten van de analyse door de injectie complicaties is meestal niet gemeld in de muis studies, maar in onze eigen ervaring en in overleg met andere onderzoekers, kan het aantal mislukte injecties zo hoog als 50% zijn en variëren afhankelijk van de ervaring en de capaciteiten van de onderzoeker die het uitvoeren van de injecties. Het succes van de injectie wordt typisch bepaald door directe fundus beeldvorming en / of optical coherence tomography (OCT) 7,9. Een gemakkelijk onder de knie methode met een hoge slagingspercentages voor subretinale injecties in muizen kunnen experimenteren bespoedigen en de kosten van preklinische studies van treatments voor retinale ziekten die belangrijkste oorzaken van blindheid in de Verenigde Staten. De achterste, transcleral subretinale injectie techniek die hier beschreven is een aanpassing van de klinische en preklinische protocollen 9,12. De niet-invasieve diagnostische evaluaties uitgevoerd in geïnjecteerde muizen tonen mild en zeer plaatselijk schade en het gebrek aan aanvullende zekerheden lens, het netvlies en RPE letsel. Bovendien, met relatief weinig praktijk, een experimentator kan deze resultaten met een hoog slagingspercentage te bereiken (80 - 90% of beter), waardoor de kosten in verband met dergelijke studies verminderen. Deze procedure kan worden gebruikt om cellulaire, virale of farmacologische therapeutische interventies fotoreceptoren en / of RPE leveren preklinische studies en experimentele ingrepen gemakkelijk evalueren.

<table><tbody><tr><td>Hamilton Model 62 RN SYR</td><td>Hamilton</td><td>87942</td><td>Spuit x 1</td></tr><tr><td>Hamilton Needle 33 G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 roestvrij staal)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>Naalden x 6</td></tr><tr><td>Vannas Gebogen Schaar</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>1347</td><td>5 mm Blad</td></tr><tr><td>22.5 Graad Microchirurgie Mes</td><td>Wilson Ophthalmic Corp.</td><td>91204</td><td></td></tr><tr><td>Ketaject&nbsp;</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-609-02</td><td>Ketamine</td></tr><tr><td>Anased</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>NDC 61311-482-10</td><td>Xylazine</td></tr><tr><td>Fluoresceïne 10% AK-Fluor</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-253-10</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>0.9% Saline USP</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-4888-50</td><td>0.9% NaCl</td></tr><tr><td>Antibioticumzalf</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>Oogmedicijn</td></tr><tr><td>Watercirculatiepomp</td><td>Gaymar</td><td>TP-500 T/Pump&nbsp;</td><td>P/N 07999-000</td></tr><tr><td>sd-OCT</td><td>Bioptigen</td><td>R-Series</td><td>Commercieel</td></tr><tr><td>Fundus Camera</td><td>Phoenix Research Laboratories</td><td>MICRON III</td><td></td></tr><tr><td>Pincet Type 3</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>5385-3SU</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Fenylephrine</td><td>Paragon BioTeck</td><td>NDC 42702-102-15</td><td>Oogmedicijn</td></tr><tr><td>IMARIS8</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Versie 8.1.2</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>V1.8.0_77</td></tr><tr><td>Hypromellose&nbsp;2.5%</td><td>Goniovisc</td><td>AX0401</td><td>Methylcellulose</td></tr><tr><td>Oogdruppels (spoelen)</td><td>Bausch &amp; Lomb</td><td></td><td>Zoute oplossing</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>Microscoop</td></tr><tr><td>Lichtbron</td><td>Fostec</td><td>P/N 20520</td><td>Lichtbron</td></tr></tbody></table>

een alternatief en gevalideerd injectiemethode voor toegang tot de subretinal space<i&gt; via</i&gt; een transcleral posterior approach

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinale injecties zijn met succes gebruikt bij zowel mensen als knaagdieren therapeutische interventies van eiwitten, virale middelen, en cellen leveren aan de interphotoreceptor / subretinale ruimte die directe blootstelling aan de fotoreceptoren en retinaal pigmentepitheel (RPE) heeft. Subretinale injecties van plasminogeen en recente preklinische en klinische onderzoeken hebben aangetoond veiligheid en / of werkzaamheid van het leveren van virale vectoren en stamcellen voor personen met gevorderde ziekte van het netvlies. Muismodellen van het netvlies en vaatziekten, in het bijzonder erfelijke retinale dystrofie, zijn van essentieel belang voor het testen van deze therapieën. De meest voorkomende injectieprocedure bij knaagdieren is om kleine transcorneal of transcleral incisies gebruiken met een anterieure benadering van de retina. Met deze aanpak, de injectienaald dringt de neurosensorische retina het verstoren van de onderliggende RPE en bij het inbrengen kan gemakkelijk nick de lens, waardoor de lens vertroebeling en bijzondere waardevermindering van niet-invasieve Imaging. Toegang tot de subretinale ruimte via een transcleral, posterior aanpak vermijdt deze problemen: de naald steekt de sclera ongeveer 0,5 mm van de oogzenuw, zonder retinale penetratie en voorkomt het verstoren van het glasvocht. Nevenschade wordt beperkt tot die welke samenhangt met de focale sclerotomie en de effecten van een voorbijgaande sereuze netvliesloslating. De eenvoud van de methode minimaliseert oculaire verwonding, zorgt voor een snelle retinale herbevestiging en het herstel, en heeft een laag uitvalpercentage. De minimale schade aan het netvlies en RPE maakt een goede evaluatie van de werkzaamheid en de directe effecten van de therapeutische middelen zelf. Dit manuscript beschrijft een nieuwe subretinale injectie techniek die kan worden gebruikt om te richten virale vectoren, farmacologische middelen, stamcellen of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen aan de subretinale ruimte in muizen met hoge efficiëntie, minimale schade en snel herstel.

Postérieure benadering transcleral subretinale injecties werden uitgevoerd op 31 gezonde ogen van 16 wildtype muizen injecties van 0,3 ui (n = 18), 0,5 ui (n = 8) en 1,0 ui (n = 5) van 0,01% fluoresceïne. Eén oog werd uitgesloten van injectie door een bestaand hoornvlies dat structurele en functionele analyse voorkomen. Elk geïnjecteerd oog is opgenomen in dit rapport. Geen onbedoelde netvliesloslatingen, puncties van de neurosensorische retina, of lekkage in het glasvocht werden ontdekt...

Subretinale injecties zijn de meest gebruikte techniek voor het afleveren van grote therapeutische middelen zoals eiwitten en virale vectoren aan fotoreceptoren en het retinale pigmentepitheel. Hier wordt een alternatieve methode bij muizen beschreven die met succes de subretinale ruimte target met minimale nevenschade en snelle hersteltijden.

Een alternatief en gevalideerd injectiemethode voor toegang tot de Subretinal Space<i&gt; via</i&gt; Een Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

Het hoofddoel van deze studie is het beschrijven van een nieuwe techniek voor subretinale injectie die kan worden gebruikt om virale vectoren, farmacologische middelen of induceerde pluripotente stamcellen in de subretinale ruimte van muizen te brengen. Deze methode kan sleutelvragen in de visuiewetenschap en oogheelkunde beantwoorden, zoals het beoordelen van de effectiviteit van nieuwe therapeutische interventies voor retinale degeneraties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden gebruikt om materiaal met hoge efficiëntie in de subretinale ruimte af te leveren, met minimale schade en een snel herstel van de retinale structuur en functie.De procedure zal worden gedemonstreerd door Sachin P, een technicus uit mijn laboratorium. Trim ter voorbereiding op deze procedure de snorharen van een geanestheseerde muis om de visualisatie te vergemakkelijken, en houd de lichaamstemperatuur van het dier op 37 °C met een circulerend waterkussen. Dilateer vervolgens de pupillen met 2,5% fenylefrine-oogdruppels.Smeer vervolgens methylcellulose-oogdruppels toe om uitdroging te voorkomen en om kortstondige cataract door anesthetica te minimaliseren. Steriliseer de instrumenten voorafgaand aan de operatie. Bereid daarna de verdunde fluoresceïne voor in een veiligheidskast.Vul de spuit met de juiste hoeveelheid fluoresceïne. Voer vervolgens een knijptest in de teen uit om te bevestigen dat het dier diep onder narcose is, en positioneer de muis zodanig dat het oog dat geïnjecteerd moet worden naar boven is gericht en duidelijk zichtbaar is in de dissectiemicroscoop. Knijp voorzichtig in de temporale conjunctiva met een pincet met fijne punten.Maak vervolgens een circumferentiële incisie van ongeveer 90 graden met de gebogen Vannas-schaar. Herhaal deze procedure op het onderliggende kapsel van Tenon. Resecteer daarna het omringende bindweefsel met fijne pincetten, terwijl de oogbol neusaartoe wordt gedraaid.Werk richting de injectieplaats, ongeveer 0,5 millimeter verwijderd van de nervus opticus, en wees zeer voorzichtig om beschadiging van de sinus retroorbitalis te vermijden. Een cruciale stap is het blootleggen van de injectieplaats, waarvoor rotatie van het oog vereist is zonder het oog zelf of bijbehorende structuren te beschadigen, waarbij in het bijzonder schade aan de orbitale bloedzak moet worden voorkomen. Maak bij deze procedure een kleine incisie in de sclera op de injectieplaats door de oogbeker voorzichtig te bekrassen met een oogheelkundig mesje van 22,5 graden.Deze incisie moet net groot genoeg zijn om de punt van de naald door de sclera te laten passeren. Voer vervolgens de schuine 33 gauge naald in de sclerotomie in, waarbij de schuinte parallel aan en in de richting van het netvlies is geplaatst. Injecteer de gewenste hoeveelheid 0,01% fluoresceïne door de zuiger langzaam met een gelijkmatige druk in te drukken.Let op dat er een lichte weerstand gevoeld zal worden bij het indrukken van de zuiger wanneer de naald zich in de subretinale ruimte bevindt. Er zal geen weerstand zijn als de naald de retina doorboort, maar een hoge weerstand als de naald de sclera of het RPE niet penetreert. Een andere kritische stap is de injectie gericht op de subretinale ruimte.Dit moet worden uitgevoerd zonder door de neurosensitieve retina heen te dringen tot in de glasvochtruimte. Wacht enkele seconden voordat de naald wordt teruggetrokken om terugstroom te minimaliseren. Spoel het oog vervolgens schoon met steriele zoutoplossing en zorg ervoor dat het oog is teruggedraaid naar de normale positie.Breng vervolgens een dikke laag triple antibioticum-oogzalf aan op het hoornvlies van het geïnjecteerde oog. Plaats de muis daarna in een schone individuele kooi om te herstellen. Bewaak de ademhaling en temperatuur tijdens het herstel van de anesthesie en controleer of het dier in sternale ligging kan blijven.Voer aanvullende passende postoperatieve monitoring en behandeling uit, inclusief een subcutane injectie van carprofen voor de beheersing van postchirurgische pijn. Hier is een 3D-reconstructie van de koepelvormige bleb op de injectieplaats. De koepelvormige bleb is vervolgens wit ingekleurd om de omvang en marges van de netvliesloslating aan te geven.Retinale dwarsdoorsneden uit de OCT zijn in het wit te zien, terwijl de met vloeistof gevulde ruimte op het niveau van het RPE en de fotoreceptoren zwart verschijnt. In deze figuur worden de representatieve OCTB-scans op de plaats van de maximale retinale loslating getoond voor de injectie, 10 minuten na de injectie en vier weken na de injectie. Deze afbeelding toont de vorming en resolutie van een vlakke bleb na een injectie van 0,3 µL.En deze afbeelding toont de vorming en resolutie van een koepelvormige bleb na een injectie van 0,5 µL, terwijl deze afbeelding de vorming en resolutie van een koepelvormige bleb toont na een injectie van 1 µL. Tot slot is hier een voorbeeld van ernstige choroïdale littekenvorming en retinaal uitdunning op de injectieplaats. Retinae behouden hun normale functie na de resolutie van de bleb.Bij negen verlichtingsintensiteiten worden de golfvormen voor scotopische, door staafjes gemedieerde responsen getoond voor vóór de injectie en vier weken na de injectie voor injecties van 0,3 microliter, 0,5 microliter en 1 microliter. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 10 tot 15 minuten per oog worden voltooid. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de gezondheid van de ogen te evalueren voordat men begint.Sluit ogen uit met hoornvlies- of lensopaciteiten, of diepliggende ogen waarbij deze procedure zeer moeilijk zou zijn. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals OCT en fundusfotografie, worden uitgevoerd om de kwaliteit van de injectie te evalueren.

an-alternative-validated-injection-method-for-accessing-subretinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze chirurgische techniek illustreert de injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de subretinale ruimte van de muis oog.

Subretinale Injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de Mouse Eye

Source: Park, S. W., et al. Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (2015)The video describes the method for subretinal injection of viral vectors into the retinal pigment epithelium (RPE) in a mouse model. It details the procedure from anesthesia and eye preparation to precise lentiviral vector delivery, ensuring gene integration and expression in the RPE.

Subretinal Injection of Viral Vectors into the Retinal Pigment Epithelium in a Mouse Model

Source: Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the procedure for delivering a fluorescent dye into the subretinal space of a mouse. The process involves anesthetizing the mouse, preparing the eye, making precise incisions to access the subretinal space, and injecting the dye to create a controlled retinal detachment. This technique allows for targeted...

Delivery of a Fluorescent Dye into the Subretinal Space of a Mouse

Hier presenteren we een door de gemeenschap geaccepteerd protocol in multimedia-formaat voor het subretinaal injecteren van een bolus RPE-cellen bij ratten en muizen. Deze aanpak kan worden gebruikt voor het bepalen van reddingspotentieel, veiligheidsprofielen en overlevingscapaciteiten van getransplanteerde RPE-cellen bij implantatie in diermodellen van retinale degeneratie.

Presterende Subretinal Injecties in Knaagdieren om retinale pigment epitheel cellen leveren in Suspension

Subretinale injectie is een chirurgische techniek voor effectieve genoverdracht naar het retinale pigmentepitheel in het oog van de muis. Hier beschrijven we een eenvoudige en reproduceerbare methode voor subretinale injectie van virale vectoren naar het retinale pigmentepitheel bij experimentele muizen.

Limbale Aanpak-Subretinal injectie van virale vectoren voor gentherapie in Muizen retinaal pigment epitheel

Subretinal injectie is veel toegepast in preklinische studies van stamcel substitutietherapie voor leeftijdsgebonden maculaire degeneratie. In dit gevisualiseerde artikel beschrijven we een minder riskant, reproduceerbaar zijn en juist gewijzigd subretinal injectietechniek via de trans-scleral-benadering te leveren van cellen in de ogen van de rat.

Ontwikkeling van een verfijnde Protocol voor Trans-scleral Subretinal transplantatie van menselijke retinale Pigment epitheliale cellen in de ogen van de Rat

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de bereiding van post-gecryopreserveerde hESC-afgeleide fotoreceptor-voorlopercellen en de subretinale afgifte van deze cellen in rd10-muizen .

Subretinale toediening van van menselijke embryonale stamcellen afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen bij RD10-muizen

Dit protocol beschrijft een techniek voor intracamerale injectie bij ratten met behulp van een centrale incisie in het hoornvlies en een lange tunnel in de voorste oogkamer. Deze injectiemethode minimaliseert het risico op het veroorzaken van onbedoelde weefselbeschadiging en verbetert daardoor de precisie en reproduceerbaarheid.

Intracamerale injectie bij ratten met een laag risico op bijwerkingen

Dit artikel beschrijft methoden voor subretinale injectie bij ratten, waarbij gebruik wordt gemaakt van intraoperatieve visualisatie om zowel de injectieplaats als het gebied van netvliesloslating te controleren.

Intraoperatieve visualisatie van subretinale injectie en netvliesloslating bij ratten

Deze studie presenteert een methodologie voor de toediening van therapieën in het netvlies en de oogzenuwen van de volwassen rat. Daarnaast wordt een unieke methode voor weefselverzameling geïntroduceerd voor een top-down en bloc verzameling van de oogzenuw en het netvlies bij een volwassen rat.

Oculaire therapeutische toediening en geavanceerde weefselafname bij volwassen ratten

Subretinale injecties zijn een onmisbare techniek voor de preklinische ontwikkeling van therapieën voor fotoreceptor- en RPE-ziekten. We beschrijven een geoptimaliseerde transsclerale subretinale injectietechniek bij muizen die de intraoperatieve slagingspercentages verbetert en schade aan het netvlies minimaliseert.

Geoptimaliseerde minimaal invasieve transsclerale subretinale injectietechniek bij muizen

Leer een nieuwe subretinale injectietechniek voor therapeutische toediening bij muizen met minimale schade en snel herstel. Deze methode ondersteunt onderzoek naar retinale degeneraties en gentherapie.

Een alternatief en gevalideerd injectiemethode voor toegang tot de Subretinal Space

Meer video's verkennen