Een alternatief en gevalideerd injectiemethode voor toegang tot de Subretinal Space via Een Transcleral Posterior Approach
December 7th, 2016
Subretinale injecties zijn de meest gebruikte techniek voor het afleveren van grote therapeutische middelen zoals eiwitten en virale vectoren aan fotoreceptoren en het retinale pigmentepitheel. Hier wordt een alternatieve methode bij muizen beschreven die met succes de subretinale ruimte target met minimale nevenschade en snelle hersteltijden.
Het algemene doel van dit onderzoek is om een nieuwe subretinale injectietechniek te beschrijven die kan worden gebruikt om virale vectoren, farmacologische middelen of geïnduceerde pluripotente stamcellen naar de subretinale ruimte bij muizen te richten. Deze methode kan sleutelvraagstukken beantwoorden op het gebied van de oogheelkunde en de oogheelkunde, zoals het beoordelen van de effectiviteit van nieuwe therapeutische interventies voor retinale degeneraties. Het grote voordeel van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om materiaal naar de subretinale ruimte te brengen, met hoge effectiviteit, minimale schade en snelle herstel van retinale structuur en functie.
Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Sachin P, een technicus uit mijn laboratorium. Om deze procedure te beginnen, trimmen van de snorharen van een anesthetisch muis om visualisatie te vergemakkelijken, en houd de lichaamstemperatuur van het dier op 37 graden Celsius met een circulerende waterpad. Vervolgens verwijd de pupillen met 2,5% phenylephrine oogdruppels.
Breng vervolgens methylcellulose oogdruppels aan om droogheid te voorkomen en minimaliseer anesthesie geïnduceerde tijdelijke cataracten. Steriliseer de instrumenten vóór de operatie. Bereid daarna de verdunde fluoresceïne in een bioveiligheidskabinet voor.
Vul de spuit met de juiste hoeveelheid fluoresceïne. Voer vervolgens een teenprik uit om er zeker van te zijn dat het dier diep verdoofd is, en plaats de muis zodat het te injecteren oog omhoog wijst en duidelijk zichtbaar is in de dissectiescoop. Knijp voorzichtig in de temporale conjunctiva met een tang met fijne punten.
Maak vervolgens een omtreksnede van ongeveer 90 graden met de gebogen Vannas' schaar. Herhaal de procedure op de onderliggende Tenon-capsule. Vervolgens resecteer het omliggende bindweefsel met fijne punten tang, terwijl het oogbol naar binnen gedraaid wordt.
Werk naar de injectieplaats op ongeveer 0,5 millimeter van de optische zenuw en wees voorzichtig om de retro-orbitale sinus niet te verstoren. Een cruciale stap is het blootleggen van de injectieplaats, wat vereist dat het oog gedraaid wordt, zonder het oog zelf of aangrenzende structuren te beschadigen, met name zonder schade aan de orbitale bloedzak. In deze procedure maakt u een kleine incisie in de sclera van de injectieplaats, door het oogglas voorzichtig te krabben met een 22,5 graden oftalmisch mes.
Deze incisie moet net groot genoeg zijn om de punt van de naald door de sclera te laten passeren. Steek vervolgens de geslepen 33 gauge naald in de sclerotomie met de snede gericht en schuin parallel aan de retina. Injecteer de gewenste hoeveelheid 0,01% fluoresceïne door de zuiger langzaam met gelijkmatige druk in te drukken.
Merk op dat wanneer de naald in de subretinale ruimte is, een lichte weerstand wordt gevoeld tijdens het indrukken van de zuiger. Er zal geen weerstand zijn als de naald de retina doorboort, maar hoge weerstand als de naald de sclera of RPE niet doorboort. Een andere cruciale stap is de injectie gericht op de subretinale ruimte.
Dit moet worden bereikt zonder door de neurosensorische retina te dringen, naar de glasvochtholte. Wacht enkele seconden voordat u de naald terugtrekt, om de terugstroom te minimaliseren. Spoel vervolgens het oog met steriel zoutoplossing en zorg ervoor dat het oog terug in zijn normale positie is geroteerd.
Breng vervolgens een dikke laag drievoudige antibiotische oogzalf aan op het hoornvliesoppervlak van het geïnjecteerde oog. Plaats de muis vervolgens in een schone solitaire kooi voor herstel. Controleer zijn ademhaling en temperatuur tijdens de herstelperiode na anesthesie en controleer of hij in staat is om sternal recumbency te handhaven.
Voer aanvullende geschikte postoperatieve monitoring en behandeling uit, inclusief een subcutane injectie van carprofen, voor pijnbestrijding na de operatie. Hier is een 3D-reconstructie van de koepelvormige blaar op de injectieplaats. De koepelvormige blaar wordt vervolgens in dicht wit gevuld om de omvang en randen van de retinale loslating te tonen.
Retinaal dwarsdoorsneden van de OCT zijn te zien in wit, terwijl de vloeistof gevulde ruimte op het niveau van de RPE en fotoreceptoren zwart lijkt. En in deze figuur zijn de representatieve OCTB-scans op de plaats van maximale retinale loslating weergegeven voor vóór injectie, 10 minuten na injectie en vier weken na injectie. Deze afbeelding toont de vorming en resolutie van een platte blaar van een 0,3 microliter injectie.
En deze afbeelding toont de vorming en resolutie van een koepelvormige blaar van een 0,5 microliter injectie, terwijl deze afbeelding de vorming en resolutie van een koepelvormige blaar van een 1 microliter injectie toont. Ten slotte is hier een voorbeeld van ernstige choroïdale littekenvorming en retinale verdunning op de injectieplaats. Retina's behouden normale functie na resolutie van de blaar.
Bij negen verlichtingsintensiteiten worden de golfvormen voor scopische staafgemedieerde reacties getoond voor vóór injectie en vier weken na injectie voor 0,3 microliter, 0,5 microliter en 1 microliter injecties. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in 10 tot 15 minuten per oog worden voltooid. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de gezondheid van de ogen te evalueren voordat u begint.
Sluit ogen met hoornvlies- of lensopaciteiten of diepliggende ogen uit voor welke deze procedure erg moeilijk zou zijn. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals OCT en fundusbeeldvorming worden uitgevoerd om de kwaliteit van de injectie te evalueren.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie beschrijft een nieuwe subretinale injectietechniek voor het afgeven van therapeutische middelen in de subretinale ruimte bij muizen. De methode is bedoeld om zijschade te minimaliseren en tegelijkertijd een snel herstel van de retinale structuur en functie te waarborgen.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Visiewetenschap
- Oftalmologie
Achtergrond
- Subretinale injecties worden vaak gebruikt voor therapeutische afgifte.
- Bestaande methoden kunnen zijschade veroorzaken en langere hersteltijden.
- Deze studie presenteert een alternatieve techniek met verbeterde resultaten.
Doel van het onderzoek
- Om een nieuwe techniek voor subretinale injecties te beschrijven.
- Om de effectiviteit van therapeutische interventies voor retinale degeneraties te beoordelen.
- Om de afgifte van virale vectoren en farmacologische middelen te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Trim de snorharen van een verdovde muis voor visualisatie.
- Houd de lichaamstemperatuur op 37 graden Celsius met behulp van een circelende waterpad.
- Verwijd pupillen met 2,5% phenylephrine oogdruppels.
- Demonstreer de procedure door een getrainde technicus.
Belangrijkste resultaten
- De techniek maakt een hoge effectiviteit mogelijk bij het afgeven van materialen.
- Minimale schade aan retinale structuren wordt waargenomen.
- Snel herstel van de retinale functie wordt bereikt.
Conclusies
- Deze nieuwe subretinale injectietechniek is effectief voor onderzoek.
- Het belooft vooruitgang in therapeutische strategieën in de oftalmologie.
- Verdere studies kunnen de toepassingen ervan in retinale degeneraties verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This transcleral posterior subretinal injection method addresses a key challenge in preclinical ophthalmology: delivering therapeutic agents to the subretinal space while minimizing surgical trauma and preserving retinal integrity. By avoiding retinal penetration and vitreous disruption, the technique enables more accurate assessment of drug efficacy in rodent models of retinal degeneration. This supports de-risking of target validation and lead identification efforts in vision science pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise delivery of viral vectors, pharmacological agents, or stem cells to the subretinal space for functional target validation in retinal disease models.
- Operational Value: Minimizes confounding tissue damage, allowing clearer interpretation of therapeutic effects on photoreceptors and RPE.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces consistent, reproducible subretinal delivery with quantifiable outcomes via OCT and fundus imaging.
- Operational Value: Standardizes injection depth and location (0.5 mm from optic nerve), reducing variability across experiments and operators.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports longitudinal assessment of retinal structure and function due to rapid retinal reattachment and minimal chronic scarring.
- Operational Value: Compatible with postoperative monitoring using OCT, fundus imaging, and ERG to evaluate therapeutic durability.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling reliable delivery of candidate therapeutics to the subretinal space, a critical step before efficacy testing in degenerative retinal models.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by allowing targeted delivery of agents to interrogate retinal pathways and cell-specific functions.
- Screening: Enables standardized preparation of disease models for compound screening with minimal procedural failure.
- Analytics: Generates clear OCT- and fundus-based readouts to quantify retinal detachment resolution and functional recovery over time.
- Translational Research: Supports continuity from discovery to preclinical validation by preserving retinal architecture for accurate biomarker and functional assessments.
- Enterprise Reuse: Reusable across studies involving viral vectors, proteins, or cell-based therapies for retinal degeneration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing surgical artifacts that could mask or mimic therapeutic effects.
- Operational Value: Short procedure time (10–15 minutes per eye) and low failure rate improve throughput in preclinical studies.
- Strategic Value: Reduces biological noise in efficacy data, supporting better go/no-go decisions in target prioritization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of retinal therapeutics by providing cleaner preclinical data on mechanism and durability.
Implementation Considerations
- Requires microsurgical expertise and fine motor control for sclerotomy and needle placement.
- Dependent on specialized instrumentation including Vannas scissors, 22.5° ophthalmic blade, and 33-gauge beveled needle.
- Necessitates standardized postoperative care including antibiotics, analgesics, and monitoring for retinal reattachment.
- Adaptation to other model systems may require adjustment of incision size and needle angle based on ocular anatomy.
- Limited to posterior segment access; not suitable for anterior segment or intravitreal delivery applications.
