Ontwikkeling van een Direct-Pulp aftopping model voor de evaluatie van pulpal wondgenezing en Reparative Dentin Formation in Muizen
12 januari 2017
We beschrijven een stap voor stap methode om direct pulp aftopping op muizen tanden voor de evaluatie van pulpa wondgenezing en vorming herstellende dentine in vivo.
Het algemene doel van dit protocol is om de directe pulpa-cappingprocedure bij muizen te presenteren. Deze methode kan u helpen antwoorden te geven op belangrijke vragen in de pulpbiologie, zoals hoe pulp geneest, of hoe reparatieve dentine zich vormt, wanneer u gevangen pulpa-cappingmaterialen op de blootgestelde pulp plaatst. Het grote voordeel van deze techniek is dat de eigenlijke directe pulpa-cappingprocedure die bij mensen wordt uitgevoerd, ook bij muizen kan worden uitgevoerd, op precies dezelfde manier.
De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het verbeteren van materiaaleigenschappen om tanden te redden die anders zouden zijn veroordeeld tot meer invasieve behandelingen, zoals wortelkanaalbehandeling. Nadat u de muis goed hebt verdoofd voor de procedure, plaatst u de mondhouder in zijn mond en bevestigt u het andere uiteinde aan de tafel zodat de kop naar boven is gericht. Gebruik goede verlichting en een stereoscoop om de eerste maxillaire kies te observeren.
Gebruik vervolgens de kwart-ronde ronde slijpsteen in een hoogsnelheidshandapparaat met 200.000 tpm om het centrale gebied van het glazuur van de tand te verwijderen totdat het pulp zichtbaar is door het transparante dentine. Wees voorzichtig om niet in het pulp door te dringen. Gebruik vervolgens een nummer.
15 endodontische k-bestand, om het dentine te doorboren en het pulp bloot te leggen. Duw geen puin in het pulp; dit kan worden vermeden door de k-bestand een kwartslag te draaien en vervolgens de k-bestand eruit te trekken. Bereid nu de MTA voor en breng de MTA aan met behulp van de explorer, en vervolgens in het blootgestelde gebied verpakken met behulp van de achterkant van het papierpunt en zachtjes tikken.
Gebruik vervolgens een spuit geladen met 35%fosforzuur etser om de tand te bedekken met de etser, waarbij u het tandvlees vermijdt, en laat de etser 15 seconden werken. Na 15 seconden, zuigt u de etser van de tand en gebruikt u een met water bevochtigde wattenstaafje om eventuele resterende etser af te vegen. Zuig en veeg totdat alle etser is verwijderd.
Breng vervolgens de tandheelkundige kleefstoffen aan met behulp van de achterkant van het papierpunt. Maak de kleurlaag dun door deze enkele seconden met perslucht te blazen. Laat vervolgens de kleefstof 30 seconden uitharden met de juiste lamp.
Plaats nu kleine hoeveelheden composiet op de tand met behulp van de punt van de explorer om het composiet in de groeven van de tand te laten stromen. Na het aanbrengen, laat de composiet 30 seconden uitharden. Na het euthanaseren van de muis en het verwijderen van de gehele maxilla, plaatst u de kaak in 4%paraformaldehyde in PBS bij een pH van 7,4.
Bewaar het weefsel een nacht bij 4 graden Celsius en breng het de volgende ochtend over in 70%ethanol voor opslag tot het kan worden verwerkt. Om een micro CT-scan van de maxilla uit te voeren, bevestigt u deze eerst in gaas gedrenkt in 70%ethanol en vervolgens in een 15 milliliter celcultuurbuisje. Monteer vervolgens de buis op de micro CT-scanfase.
Stel vervolgens de röntgenbron in om een stroom van 145 microamp met 55 piek kilovolt gedurende 200 milliseconden af te geven. Gebruik een 0,5 millimeter aluminium filter om afbeeldingen met een resolutie van 20 micron te verkrijgen. Nadat de scans zijn voltooid, begint u met het ontkalken van de maxilla met 5%EDTA en 4%sucrose in PBS, bij een pH van 7,4.
Laat deze reactie twee weken bij 4 graden Celsius doorgaan. Na het inbedden van de maxilla, maakt u vijf micron dikke plakjes. De pulpa-cappinggebieden vallen meestal samen met de distale palatinale wortel, die als een herkenningspunt kan worden gebruikt.
Bepaal het precieze gebied van belang door de histologie onder de lichtmicroscoop te onderzoeken en de resultaten te vergelijken met de micro CT-scans. Voor H&E-kleuring verwijdert u het paraffine en herhydrateert u de dia's met twee baden in xyleen gedurende enkele minuten elk. Breng ze vervolgens door een reeks stapvoezig verdunde ethanol.
Elk bad moet slechts een minuut worden aangebracht. Volg de herhydratie met een spoeling. En breng vervolgens de hemotoxylin-oplossing gedurende twee en een halve minuut aan.
Verwijder de kleurstof met een spoeling en plaats de dia's vervolgens een minuut in 95%ethanol. Vervolgens worden de dia's gedurende één minuut met eosin-oplossing gekleurd en vervolgens afgespoeld. Draai de hydratatie-stappen om de gekleurde weefsels te dehydrateren, beginnend met ethanol.
Behandel ze vervolgens met xyleen. De dia's kunnen vervolgens worden gemonteerd en geïmagerd. Met behulp van de beschreven procedures werd pulpa-capping uitgevoerd op 8 weken oude muizen.
Zes weken later werden hun maxillae geoogst en onderzocht. Merkwaardig genoeg onthulde H&E-kleuring dentinevorming in de gehele pulpkamer en de wortelkanalen. Ter vergelijking, vertoonde de onbekapselde kies geen gelijkaardige dentinevorming.
In de gekapselde kies waren er kenmerken van zowel dentine-achtige als beenachtige formatie, omdat zowel dentinebuisjes als osteocyten in de reparatieve dentine werden gevonden, wat suggereert dat beschadigd pulp kan worden gemineraliseerd door zowel aanwezige odontoblasten als geïmmigreerde osteoblasten. Het gebruik van DMP1 immunohistochemische kleuring bevestigde verder verhoogde activiteiten van cellen die reparatieve dentine vormen. Net als in echte tandheelkundige klinische praktijken is het hebben van een assistent buitengewoon nuttig.
Met een assistent kan deze techniek bijvoorbeeld in slechts tien minuten worden uitgevoerd, zodra deze is beheerst. Belangrijk is dat u, wanneer u het pulp blootstelt, een endofile moet gebruiken, niet de slijpsteen. En wanneer u de MTA afgeeft, wees voorzichtig.
Vergeet niet dat het werken met fixeermiddelen zoals paraformaldehyde uiterst gevaarlijk kan zijn. Voorzorgsmaat
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van directe pulp capping op muizentanden, gericht op het bestuderen van pulpale wondgenezing en de vorming van reparatief dentine in vivo. De methode stelt onderzoekers in staat om belangrijke aspecten van pulpbiologie te onderzoeken, inclusief genezingsprocessen en materiaalinteracties.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Tandheelkunde
- Neurowetenschappen
- Regeneratieve Geneeskunde
Achtergrond
- Directe pulp capping is een tandheelkundige procedure die gericht is op het behoud van de vitaliteit van de pulp.
- Deze techniek kan worden toegepast in zowel menselijke als muismodellen.
- Het begrijpen van pulpgenezing kan leiden tot verbeterde tandheelkundige behandelingen.
- De studie richt zich op de reactie van de pulp op cappingmaterialen.
Doel van het onderzoek
- Om het genezingsproces van de pulp na directe capping te evalueren.
- Om de vorming van reparatief dentine als reactie op cappingmaterialen te beoordelen.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het bestuderen van pulpbiologie in vivo.
Gebruikte methoden
- Muisanesthesie en positionering voor de procedure.
- Gebruik van een mondhouder om de muis tijdens de procedure te stabiliseren.
- Toepassing van pulp capping materialen op blootgestelde pulp.
- Observatie van de eerste maxillaire kies met behulp van een stereoscoop.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol maakt consistente toepassing van pulp capping bij muizen mogelijk.
- Het biedt inzichten in de genezingscapaciteiten van tandpulp.
- De vorming van reparatief dentine kan effectief worden gemonitord.
- De techniek heeft implicaties voor het verbeteren van tandheelkundige materialen.
Conclusies
- Deze methode is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van pulpbiologie.
- Het overbrugt de kloof tussen menselijke en dierlijke tandheelkundige procedures.
- Toekomstig onderzoek kan de materiaaleigenschappen verbeteren voor betere tandheelkundige resultaten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables mechanistic investigation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in a murine model, supporting target validation in regenerative dentistry. By allowing use of transgenic and knockout mice, it facilitates preclinical screening of biocompatible materials and de-risks translational pathways for pulp-protective therapeutics. The model addresses a key gap in dental R&D by providing an in vivo system to evaluate molecular mechanisms underlying dentin regeneration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cellular and molecular pathways involved in pulp healing and dentinogenesis.
- Operational Value: Supports functional validation of targets using genetic models to assess causal roles in reparative dentin formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized in vivo assay to evaluate biocompatibility and inductive potential of pulp-capping materials.
- Operational Value: Enables quantitative assessment of dentin formation via micro-CT and histology for material screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges ex vivo findings to physiological relevance by modeling human pulp-capping outcomes in mice.
- Operational Value: Supports preclinical evaluation of lead materials for pulp vitality preservation and dentin repair.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing in regenerative dentistry.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on signaling pathways regulating odontoblast and osteoblast recruitment during pulp repair.
- Screening: Enables standardized evaluation of material-induced reparative dentin formation as a functional readout.
- Analytics: Generates quantitative micro-CT and histological outputs to compare material efficacy and healing kinetics.
- Translational Research: Aligns with preclinical validation of pulp-capping agents prior to IND-enabling studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative material optimization and mechanism-of-action studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in material performance by capturing complex tissue-level healing responses.
- Operational Value: Delivers a reproducible, standardized procedure for cross-laboratory material comparison.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing biological uncertainty in pulp-regenerative approaches.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of pulp therapeutics based on in vivo dentin regeneration evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dental procedures, anesthesia, and microsurgical techniques.
- Dependent on access to high-speed handpieces, stereoscopes, micro-CT, and histological processing equipment.
- Necessitates standardization across operators to ensure consistent pulp exposure and material placement.
- Adaptation considerations include variations in mouse strain, age, and pulp-capping material viscosity.
- Practical limitations include technical difficulty due to small murine tooth size and potential variability in healing responses.
