Name: Karakterisering van calcificatie Events met Live optische en elektronenmicroscopie technieken in een Marine tubeworm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 39 s
Description: Leer calcificatie-events karakteriseren in mariene buiswormen met levende optische en elektronenmicroscopie. Deze methode onthult biomineralisatieprocessen in Hydroides elegans tijdens metamorfose.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag een groot bedankje sturen naar Clemson Broadcast Productions, audio-opname door J. Bright, Narratio door A. D. McQuiston, Audio sweetening, K. Murphy, videofotografie door G. Spake, Grafische kunsten door T. Messervy, Videobewerking door T. Messervy en E. Rodgers. Technische assistentie en wetenschappelijke adviezen werden geïnspireerd door de adviezen van S. Kawada, S. Kubo, J. Hudson, T. Darroudi, D. Mulwee, H. Qian, Y. W. Lam, M. B. Johnstone, C. Campanati, A. C. Lane en R. Dineshram. Dit onderzoek werd gefinancierd door drie GRF-subsidies van de HKSAR-RGC (Subsidienummers: 705511P, 705112P en 17304914).

<ol><li>Aizenberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeleton+of+Euplectella+sp.%3A+structural+hierarchy+from+the+nanoscale+to+the+macroscale%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Skeleton of Euplectella sp.: structural hierarchy from the nanoscale to the macroscale.</a> Science. 309 (5732), 275-278 (2005).</li>
<li>de Nooijer, L. J., Toyofuku, T., Oguri, K., Nomaki, H., Kitazato, H. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.4319/lom.2008.6.610/abstract">Intracellular pH distribution in foraminifera determined by the fluorescent probe HPTS.</a> Limnol Oceanogr Methods. 6 (11), 610-618 (2008).</li>
<li>de Nooijer, L. J., Langer, G., Nehrke, G., Bijma, J. <a target="_blank" href="http://www.biogeosciences.net/6/2669/2009/">Physiological controls on seawater uptake and calcification in the benthic foraminifer Ammonia tepida.</a> Biogeosciences. 6 (11), 2669-2675 (2009).</li>
<li>Smith, A. M., Riedi, M. A., Winter, D. J. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s00227-013-2210-z">Temperate reefs in a changing ocean: skeletal carbonate mineralogy of serpulids.</a> Mar Biol. 160 (9), 1-14 (2013).</li>
<li>Carpizo-Ituarte, E., Hadfield, M. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/1542509?seq=1#page_scan_tab_contents">Stimulation of metamorphosis in the polychaete Hydroides elegans Haswell (Serpulidae).</a> Biol. Bull. 194 (1), 14(1998).</li>
<li>Bryan, P. J., Kreider, J. L., Qian, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022098197001056">Settlement of the serpulid polychaete Hydroides elegans (Haswell) on the arborescent bryozoan Bugula neritina (L.): evidence of a chemically mediated relationship.</a> J Exp Mar Biol Ecol. 220, 171-190 (1998).</li>
<li>Chan, V. B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+compositional+and+ultrastructural+shifts+during+the+development+of+calcareous+tubes+in+the+biofouling+tubeworm%2C+Hydroides+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence of compositional and ultrastructural shifts during the development of calcareous tubes in the biofouling tubeworm, Hydroides elegans.</a> J. Struct. Biol. 189 (3), 230-237 (2015).</li>
<li>DOE. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbook+of+methods+for+the+analysis+of+the+various+parameters+of+the+carbon+dioxide+system+in+sea+water.+Version+2%22">Handbook of methods for the analysis of the various parameters of the carbon dioxide system in sea water. Version 2</a>. Dickson, A. G., Goyet, C. , ORNL/CDIAC-74 (1994).</li>
<li>Chan, V. B. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.openaire.eu/search/publication?articleId=frontiers___::60dc3ff1cf8480f5672e61caa159856d">Direct deposition of crystalline aragonite in the controlled biomineralization of the calcareous tubeworm.</a> Front Mar Sci. 2, 97(2015).</li>
<li>Bond, J., Varley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+flow+cytometry+and+SNARF+to+calibrate+and+measure+intracellular+pH+in+NS0+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Use of flow cytometry and SNARF to calibrate and measure intracellular pH in NS0 cells.</a> Cytometry A. 64, 43-50 (2005).</li>
<li>Lloyd, G. E. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/249849686_Atomic_Number_and_Crystallographic_Contrast_Images_with_the_SEM_A_Review_of_Backscattered_Electron_Techniques">Atomic number and crystallographic contrast images with the SEM: a review of backscattered electron techniques.</a> Mineral Mag. 51, 3-19 (1987).</li>
<li>Perez-Huerta, A., Dauphin, Y., Cuif, J. P., Cusack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+electron+backscatter+diffraction+%28EBSD%29+data+from+calcite+biominerals+in+recent+gastropod+shells%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">High resolution electron backscatter diffraction (EBSD) data from calcite biominerals in recent gastropod shells.</a> Micron. 42 (3), 246-251 (2011).</li>
<li>Bandli, B. R., Gunter, M. E. <a target="_blank" href="http://ammin.geoscienceworld.org/content/97/8-9/1269">Electron backscatter diffraction from unpolished particulate specimens: examples of particle identification and application to inhalable mineral particulate identification.</a> Am. Mineral. 97, 1269-1273 (2012).</li>
<li>Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHayat%2C+MA+%22Principles+and+techniques+of+electron+microscopy%3A+biological+applications%22">Principles and techniques of electron microscopy: biological applications</a>. , Cambridge University Press. (2000).</li>
<li>Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009254108001940">Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale.</a> Chem Geo. 261, 217-229 (2009).</li>
<li>Volkert, C. A., Minor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+microscopy+and+micromachining%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bull%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam microscopy and micromachining.</a> MRS Bull. 32, 389-399 (2007).</li>
<li>Kudo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtexture+of+larval+shell+of+oyster%2C+Crassostrea+nippona%3A+A+FIB-TEM+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtexture of larval shell of oyster, Crassostrea nippona: A FIB-TEM study.</a> J. Struct. Biol. 169 (1), 1-5 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Live optische beeldvorming is een bruikbare methode voor het observeren van cellulaire gebeurtenissen in een meercellig organisme. Hier werden de interne pH en calciumionen indicatoren gebruikt om de flux van ionen te meten aan de mineralisatie sites. In deze gebieden wordt actieve ionen pompen nodig om pH en Ca2 + -concentratie te verheffen tot calcificatie 2, 3 mogelijk maken. Bij toepassing fluorescerende moleculen aan een organisme te bestuderen, ...

Biomineralization is een complexe reeks gebeurtenissen die een reeks cellen die leiden tot de productie van prachtig bestelde mineralen 1 overbrugt. De uitdaging is om zowel de dynamische celprocessen en de verfijnde mineraalstructuren een combinatie van optische en elektronenmicroscopie werkwijzen te karakteriseren. Een verhoging van de intracellulaire pH bevordert de vorming van CaCO 3 kristallen, dus het identificeren van de levensfase dat een verhoogde pH heeft onthult tijde verkalking wordt waarschijnlijk optreden 2, 3. De tubeworms uit de familie Serpulidae komen vaak kalkvormende in de oceaan 4. Het is ook een populaire ongewervelde model voor marien onderzoek, met name in biofouling 5, 6. In deze studie, het proces van calcificatie in mineralisatie compartimenten During biomineralization wordt waargenomen. De snelle proces van metamorfose omvat het ontstaan van calciumcarbonaat structuren 7, 8. We zien hoe interne pH metingen kunnen worden uitgevoerd op de tubeworm en hoe levensstadia en weefsels relevant voor verkalking kan worden gescreend. Na de levensfase plaats is geïdentificeerd, kan het weefsel belast calcificatie gekarakteriseerd met een hogere resolutie middels elektronenmicroscopie methoden. Middels fluorescentiemicroscopie, we de tijd die calciumcarbonaat verschijnen nadat metamorfe inductie te bepalen. Een vergelijkbare levensfase werd vervolgens zichtbaar gemaakt met SEM-EDS voor elementaire verdeling van de samenstelling en de afgezette minerale werd geanalyseerd met behulp van twee verschillende methoden elektronenmicroscopie, specifiek SEM-EBSD en FIB-TEM.

<table><tbody><tr><td>Hexamethyldisilazane&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16700(EM)</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19192</td><td></td></tr><tr><td>IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHZ1124</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin, Free Acid</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N7143-5MG</td><td></td></tr><tr><td>35 mm diameter dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D110400</td><td></td></tr><tr><td>5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C-1271</td><td></td></tr><tr><td>BDH Potassium Chloride, ACS Grade</td><td>VWR</td><td>BDH0258-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>083-01095</td><td></td></tr><tr><td>0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>199-02185</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>FASW</td><td>Iwaki Co. Ltd.</td><td>Rei-sea Marine</td><td></td></tr><tr><td>Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 &micro;m</td><td>ADVANTEC</td><td>A045A047A</td><td></td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>051-00476</td><td></td></tr><tr><td>Artificial seawater for buffers</td><td></td><td></td><td>by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>039-00475</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Sulfate</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>197-03345</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>089-08415</td><td></td></tr><tr><td>2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris)</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>207-06275</td><td></td></tr><tr><td>2-aminopyridine</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>011-02775</td><td></td></tr><tr><td>Orion 5-star Plus pH meter</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH, Bethesda, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRTEM H500</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU6600 VPSEM</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system</td><td>Hitachi&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

karakterisering van calcificatie events met live optische en elektronenmicroscopie technieken in een marine tubeworm

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

De karakterisering van het eerste biochemische proces van calciumcarbonaatproductie vereist een combinatie van microscopiebenaderingen. Ten eerste kunnen intracellulaire pH-verdeling en calciumionen worden waargenomen met behulp van live microscopie over tijd. Dit maakt het mogelijk om het levensstadium en het weefsel met de gewenste eigenschap te identificeren voor verdere elektronenmicroscopiestudies. Levensstadia en weefsels van belang zijn doorgaans hoger in pH en Ca-signalen.
Hier presenteren we, met behulp van H. elegans, een protocol om de aanwezigheid van calciumcarbonaatstructuren in een biologisch specimen op de rasterelektronenmicroscoop (SEM) te karakteriseren, met behulp van energie-dispersieve röntgenspectroscopie (EDS) om de elementaire samenstelling te visualiseren, met behulp van elektronenbackscatterdiffractie (EBSD) om de aanwezigheid van kristallijne structuren te bepalen, en met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) om de samenstelling en structuur van het materiaal te analyseren. In dit protocol wordt een gefocuste ionenbundel (FIB) gebruikt om monsters te isoleren met een afmeting die geschikt is voor TEM-analyse. Aangezien FIB een plaatsgebonden techniek is, laten we zien hoe informatie van de vorige technieken kan worden gebruikt om het gebied van belang te identificeren, waar Ca-signalen het hoogst zijn.

De volgende zijn enkele opmerkingen van de verkalking proces tijdens de metamorfose van het tubeworm. Figuur 1 toont dat de pH bij de kraag gebied is hoger dan de andere weefsels na metamorfose. Figuur 2i toont een tubeworm met homogene verdeling van Ca, wat suggereert geen grote kalkafzetting gebeurtenissen zijn begonnen; Figuur 2ii toont een tubeworm dat is verkalkt voor een langere periode, wat erop wijst verkalking is verder gegaan d...

We demonstreren het gebruik van verschillende microscopiemethoden die nuttig zijn bij het observeren van de verkalking van een buisworm, Hydroides elegans, evenals het lokaliseren en karakteriseren van het eerste verkalkte materiaal. Live microscopie en elektronenmicroscopie worden samen gebruikt om functionele en materiaalinformatie te verstrekken die belangrijk zijn bij het bestuderen van biomineralisatie.

Karakterisering van calcificatie Events met Live optische en elektronenmicroscopie technieken in een Marine tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Het algemene doel van deze procedure is om de locatie en structuur van een calcificatiegebeurtenis te bepalen door middel van een combinatie van optische en elektronenmicroscopische methoden. Dit wordt bereikt door de levende larvale kokerspanning tijdens de metamorfose te monitoren, de levensfase die verantwoordelijk is voor calcificatie en die kan worden gedetecteerd met behulp van fluorescente indicatoren die gevoelig zijn voor intracellulaire pH en calciumsignalen. Intracellulaire pH-imaging stelt ons in staat om de concentratie van protonen in en uit het cytoplasma tijdens het calcificatieproces te bestuderen.Om te beginnen met de intracellulaire pH-imaging in de larven van de mariene pijpworm, worden de zwemvaardige larven gekleurd met de intracellulaire pH-indicator kleurstof, SNARF-1 AM. De larven worden vervolgens overgebracht naar een schaaltje IBMX met zeewater, voorzien van een dun glazen observatievenster, en geplaatst onder een fluorescentiemicroscoop, waar ze worden bestraald met licht met een golflengte van 488 nanometer, dat door de kleurstof wordt geabsorbeerd. Emissies van 580 nanometer en 640 nanometer van de kleurstof worden verzameld. De waarden van de intracellulaire pH kunnen worden berekend uit de ratio's van deze waarden.Optische microscopie stelt ons in staat om het tijdstip en de weefselregio te identificeren die geassocieerd zijn met een hoger pH-niveau. Dit is de eerste stap om de relevante tijdspunten voor verdere analyse te bepalen. In de tweede stap wordt de kokerworm op de relevante tijdspunten gefixeerd met fixatiemiddelen voor elektronenmicroscopie.Een nieuw mineraliserend levensstadium wordt geïdentificeerd met behulp van SEM-EDS mapping voor het calciumsignaal. Vervolgens worden de regio's met een hoog calciumsignaal gescreend met SEM/EBSD om de aanwezigheid van kristallijne mineralen vast te stellen. Tot slot wordt het mineraal met een gefocuste ionenbundel uitgesneden en wordt er een dunne sectie voorbereid voor TEM-observatie.Deze sectie wordt gebruikt om een selectief gebieddiffractiepatroon te verkrijgen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van conventionele testmethoden, zoals bulk röntgendiffractiespectroscopie, is dat het directe observatie mogelijk maakt van specifieke structuren die zijn waargenomen via optische en elektronenmicroscopische methoden; hierdoor kunnen discrete calcificatiegebeurtenissen direct worden bestudeerd op zowel temporeel als spatieel niveau. Wanneer calcificatie wordt bestudeerd met calcium- en intracellulaire pH-indicatoren, kunnen we de tijdschaal van deze relevante fysiologische gebeurtenissen identificeren.Het fixeren van het preparaat op het juiste tijdstip is cruciaal voor een succesvolle SEM-analyse. Bij het zoeken naar de eerste gebeurtenis van biologische calcificatie kan SEM/EDX worden gebruikt om de elementaire distributie van calcium te screenen. Een locatie met meer calcium kan wijzen op de aanwezigheid van calciumcarbonaat, maar alleen de aanwezigheid van een röntgendiffractiepatroon kan bevestigen dat er sprake is van een kristallijne structuur.Dergelijke informatie kan worden verkregen met behulp van EBSD en TEM. Elektronenbackscatterdiffractie is een kristallografische karakteriseringstechniek om kristallijn of polykristallijn materiaal te identificeren, mits de microstructuur en de elektronen-REM-hoek voldoen aan de Bragg-diffractievoorwaarde. Meestal worden teruggelaaide elektronen verzameld onder een kantelhoek van 70 graad op een gepolijst monster met korrel- of kristaloriëntatiekaarten.Voor een ongepolijst monster is het genereren van een dergelijke kaart vanuit deze ongelijkmatige oppervlakken moeilijk, omdat niet alle oppervlakteseries voldoen aan de EBSD-hoekvereisten. Echter, in de vorm van punt IG kan nog steeds een Cacucci-diffractiepatroon worden verzameld van deze ongelijkmatige oppervlakken, zolang aan de EBSD-hoekvereisten wordt voldaan. Het Cacucci-diffractiepatroon biedt ondubbelzinnige bevestiging dat het kristallijne mineraal aanwezig is.Onze methode is direct en snel, en kan worden toegepast op andere mineraliserende weefsels. Hier wordt een gefocuste ionenbundel gebruikt om een micro-monster te vervaardigen, wat ook een zeer directe methode is voor het prepareren van een TEM-sectie. Om het metamorfoseproces te bestuderen, werden kokersnijwormen gedurende ongeveer vijf dagen in het laboratorium gekweekt.De competente larven zullen in een voorwaartse richting zwemmen in plaats van in een cirkelvormige beweging. Dit betekent dat ze klaar zijn voor metamorfose. Incubeer de competente larven in de fluorescente oplossing in zeewater, dek de containers af met folie om fotobleken te voorkomen en incubeer de dieren gedurende de nacht.De larven van de kokerworm worden gewassen tegen het nylon gaas, dat de larven vasthoudt maar de oplossing doorlaat. Was de larven twee keer met gefiltreerd zeewater om overtollige kleurstofoplossing te verwijderen. Druk de zeef tegen de Petrischaal om een luchtdichte afsluiting te creëren voordat u de afsluiting loslaat om de wasoplossing weg te gooien.Zorg ervoor dat de larven niet uitdrogen. Plaats vervolgens elk van de 10 tot 20 larven in een dunne schaal met glasbodem met IBMX en dek de schaal af tot aan de beeldvorming. Plaats daarna de geschikte filterkubussen met de juiste dichroïsche spiegels om de fluorescentiesignalen te detecteren.Optimaliseer de sluitertijd zodat deze snel genoeg is om beelden van een levend organisme vast te leggen. Selecteer vervolgens de parameters voor optische doorsneding bij de optie Z-Stack en beweeg de microscopietafel omhoog en omlaag om de start- en stoppositie van de beeldacquisitie te bepalen. Stel een afstand van 1 µm tussen de lagen in.Exporteer na het imagen alle gegevens als grijswaarden-TIF-bestanden. Dit kan worden gedaan door Bestand en Exporteren te selecteren. Controleer of de bestandstypen als TIF-afbeeldingen worden weergegeven en klik vervolgens op Start.De grijswaardenafbeelding in elk kanaal, in elke laag van de Z-Stack, bevindt zich in dezelfde afbeeldingsmap en is gereed voor beeldanalyse. Genereer tot slot met ImageJ een samengestelde afbeelding voor elk van de fluorescentiekanalen. De volgende JoVE-video's laten zien hoe kalibratie en metingen voor de intracellulaire pH worden uitgevoerd.Conserveer de kokersnijwormen die een metamorfose ondergaan met een crosslinkend fixatiemiddel, gebruikmakend van een oplossing van 4% paraformaldehyde in zeewater. Meng simpelweg één deel 16% paraformaldehyde met drie delen zeewater en laat de fixatie een nacht lang plaatsvinden. Verwijder het primaire fixatiemiddel en fixeer het specimen gedurende 30 minuten opnieuw in een waterige oplossing van 1% osmiumtetroxide om de weefselstructuren verder te stabiliseren.Zorg ervoor dat u in een zuurkast werkt en over duidelijk gelabelde, aparte afvalflessen beschikt; bereid formaldehyden en osmiumtetroxide voor. Dehydrateer vervolgens de monsters met een graduele ethanolreeks, waarbij tussen elke stap vijf minuten wordt gewacht. De volgende stap is het dehydrateren van de monsters met een 1:1-oplossing van ethanol en HMDS, net genoeg om het specimen te bedekken.Laat het preparaat in de zuurkast volledig indampen en herhaal vervolgens de procedure met puur HMDS. Om een gecontroleerde breuk in het monster te veroorzaken, beweegt u het diamantmes langs de schaal, waarbij u enkele individuen omsluit om een driehoekige inkeping te maken. Plaats de Petri-schaal, terwijl deze bedekt is, tegen een aluminium stub en druk voorzichtig aan om een gecontroleerde breuk te bewerkstelligen.Observeer met een dissectiemicroscoop en pak voorzichtig een fractiestuk op dat enkele intacte buiswormen bevat. Bevestig het monster met zilververf aan de SEM-monsterhouder en schilder de randen met zilververf om oplading te verminderen. Het monster is nu gereed om te worden afgebeeld voor SEM-EDS-analyse.Plaats de samplehouder met de sample in de microscoop. Orienteer de sample en positioneer deze onder de elektronenkolom. Analyseer de sample in de VP SEM-modus.Optimaliseer de focus en het astigmatisme indien nodig. Selecteer de vergroting zodanig dat één enkel organisme het gehele gezichtsveld vult. Analyseer de elementaire distributie van calcium op het monster door een kaart van het gehele gezichtsveld te verkrijgen; laat de mapping 15 minuten of langer lopen, of totdat de gegevens een duidelijke lokalisatie van calcium binnen het organisme vertonen.Om puntkwantificering voor een regio van interesse te verkrijgen, selecteert u de optie Point ID met de tool Single Point. Klik op het gebied van interesse om een scan uit te voeren. Leg de locatie nauwkeurig vast door een reeks afbeeldingen met afnemende vergrotingen op te nemen.Om de monsters voor EBSD voor te bereiden, verwijdert u het monster uit de vlakke SEM-houder en bevestigt u het met zilververf aan een stub die vooraf onder een hoek van 45 graden is gekanteld. Lokaliseer aan de hand van de referentie-SEM-beelden het betreffende dier en de exacte regio van het dier die onderzocht moet worden. Kantel de tafel 25 graden, zodat het monsteroppervlak nu ongeveer 70 graden ten opzichte van de elektronenbundel staat.Verhoog de tafel. Selecteer de EBSD-modus in de AZtec-software. Kies aragoniet als de fasen van belang.Plaats de EBSD-camera en stel de cameraconducties in om een signaal van ongeveer 90% te bereiken. Neem met een snelle bundelrastering een achtergrond op en leg vervolgens een beeld vast in Aztec. Klik met de Spot Analysis-tool op de locatie van het monster waar een hoger calciumsignaal is waargenomen. Scan om te bepalen of Cacucci-patronen worden gedetecteerd.Indien er patronen aanwezig zijn die overeenkomen met een van de geselecteerde fasen in de database, worden deze automatisch geïndexeerd. Bescherm het voorbereide SEM-preparaat met een laag platina door middel van sputter-coating voordat u overgaat tot de microsample-preparatie met een gefocuserde ionenbundaanalysesysteem. Plaats het monster in de FIB-SEM-kamer, positioneer het monster en leg een live, ion-geïnduceerd secundair elektronenbeeld vast.Lokaliseer het gebied van interesse op de referentiebeelden zoals eerder bepaald door EDS-mapping in EBSD. Draai de tafel indien nodig om de kenmerken van interesse in lijn te brengen met het kader van het venster, pas de vergroting aan zodat het gebied de kenmerken van interesse accommodeert, en definieer vervolgens een kader voor de depositie van koolstof en wolfraam. Maak een FIB-momentopname en teken vervolgens een patroon van vier kaders rond de wolfraamkap om de locatie van de microsampling te definiëren.Kantel vervolgens de tafel onder een hoek van 58 graden en snijd door de onderkant van het microsample. Kantel de tafel terug naar nul, voer de wolfraam-microsamplingprobe in en laat deze zakken tot deze het sample raakt. Verbind de wolfraamprobe en het sample door wolfraam af te zetten tussen de punt van de probe en de wolfraambekleding, maak vervolgens de laatste snede, scheid het microsample van de rest van het eiland en til de probe met het bevestigde microsample omhoog.Plaats een TEM koperen halfgrid in een side-entry holder en laat de wolfraamsonde zakken tot het microsample contact maakt met het TEM-grid. Het microsample wordt verder gefreesd tot het elektronentransparant is. Vul vóór de TEM-analyse beide dewars met vloeibare stikstof en stel de versnellingsspanning in op 300 kilovolt.Plaats het halve raster met de bevestigde lamellen in de standaard TEM-houder. Centreer de bundel op het fosforscherm, contracteer en expandeer de bundel en zorg ervoor dat alle bundelbewegingen concentrisch zijn. Gebruik de knoppen voor de tafelverplaatsing om te navigeren en het monster te lokaliseren, vergroot de vergroting op het monster en stel de Z-hoogte in tot het monster in focus is.Gebruik indien nodig de optische oculairs. Plaats de camera en verwijder het fosforscherm. Verbreed de bundel naar behoefte om oververzadiging van de camera te voorkomen.Stel de focus en de cameraparameters in om een afbeelding vast te leggen. Om een diffractiepatroon te verkrijgen, centreert u het object van interesse, verwijdert u de objectiefopening en plaatst u de diffractieopening. Schakel over naar de Diffractie-lensmodus.Plaats de diafragma-stop om te voorkomen dat het centrum van het diffractiepatroon de camera of het fosforscherm beschadigt. Leg een afbeelding van het patroon vast voor kristallografische analyse. Hieronder volgen enkele waarnemingen van het calcificatieproces tijdens de metamorfose van de kokerspanner.De pH-waarden van de kokerswormen stegen na IBMX-stimulatie van de metamorfose en de intracellulaire pH begon na 31 uur boven de acht te stijgen. Het weefsel dat relevant is voor de calcificatie is de kraagregio. Een kaart van de SEM-EDS-signalen laat zien dat de kokersworm van dag één een homogene verdeling van calcium had, wat aangeeft dat het calcificatieproces nog niet was begonnen.Twee dagen na de stimulatie van de metamorfose waren sommige buiswormen al te sterk gekalcitiseerd en waren ze niet langer geschikt voor het observeren van nieuw gekalcitiseerde materialen. Bij een buisworm-specimen, zoals het exemplaar dat in dit voorbeeld is gebruikt, bevindt de calcificatie zich nog in een vroeg stadium, waardoor calciumkwantificering hielp bij het bepalen van het relevante gebied voor het karakteriseren van de aanwezigheid van mineralen. Bij onderzoek met SEM-EBSD vertoonde het gelokaliseerde gebied met het sterke calciumsignaal eveneens een kristallijne structuur van aragoniet.Met behulp van een gefocuste ionenbundel werd het preparaat klaargemaakt voor TEM en werd het diffractiepatroon van het aragonietmineraal in meer kristallografisch detail geanalyseerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een mineralisatiegebeurtenis in een meercellig organisme kunt lokaliseren. Wanneer optische en elektronenmicroscopie samen worden gebruikt, kunnen we een hoog niveau van fysiologisch en materiaalkundig inzicht verkrijgen in het proces van calcificatie.

characterization-calcification-events-using-live-optical-electron

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video introduceert de concepten achter calciumbeeldvorming en bevat een voorbeeldprotocol voor time-lapse beeldvorming van wormen in gegoten agaroseputten.

Calcium imaging: een methode om neurale activiteit in levende C. elegans te visualiseren

Een geïntegreerde suite van beeldvormende technieken is toegepast op poliep morfologie en weefselstructuur in het Caribisch gebied koralen Montastraea annularis en M. te bepalen faveolata. Fluorescentie, serieblok gezicht, en twee-foton confocale laser scanning microscopie hebben lobbige structuur, poliep muren, en de geschatte chromatophore en zoöxanthellen dichtheid en uitkeringen geïdentificeerd.

Multimodale optische microscopie methoden Reveal Poliep Tissue morfologie en structuur in het Caribisch gebied Reef Building Koralen

Het in beeld brengen van gedrag en neurale activiteit over lange tijdschalen zonder het dier te immobiliseren, is een voorwaarde om gedrag te begrijpen. Agarose microfluïdische kamersbeeldvorming (AMI) kan worden gebruikt om neurale activiteit en gedrag voor alle levensfasen van Caenorhabditis elegans in beeld te brengen.

Agarose microkamers naar Lange termijn Calcium Imaging van<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dit protocol beschrijft het gebruik van genetisch gecodeerde Ca2 + verslaggevers om recordwijzigingen in neurale activiteit in gedragen Caenorhabditis elegans wormen.

Ratiometric Calcium beeldvorming van individuele neuronen in gedragen Caenorhabditis Elegans

In dit artikel tonen we live beeldvorming van individuele wormen met een aangepaste microfluidic apparaat. In het apparaat, zijn meerdere wormen individueel beperkt om te scheiden van de kamers, waardoor multiplexed longitudinale toezicht van verschillende biologische processen.

Een Microfluidic Platform voor het longitudinale beeldvorming in Caenorhabditis elegans

Hier worden protocollen voor het uitvoeren van micro focus X-Ray computertomografie (microCT) Imaging van drie mariene ongewervelde dieren gedetailleerd uitgelegd. Deze studie beschrijft stappen zoals monster fixatie, kleuring, montage, Scanning, beeld reconstructie en data-analyses. Suggesties over hoe het protocol kan worden aangepast voor verschillende monsters worden ook verstrekt.

MicroFocus X-Ray CT (microCT) beeldvorming van Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe SP. (Annelida), en xenoturbella japonica (xenacoelomorpha)

Deze methode biedt een manier om te koppel optogenetics en genetisch gecodeerde calcium sensoren om beeld Baseline cytosolische calcium niveaus en veranderingen in opgeroepen calcium transiënten in het lichaam muur spieren van het modelorganisme C. elegans.

In vivo calcium beeldvorming in C. elegans lichaam muur spieren

Hier gerapporteerd is een systeem voor calciumbeeldvorming bij vrij gedragende Caenorhabditis elegans met goed gecontroleerde, niet-gelokaliseerde trillingen. Dit systeem stelt onderzoekers in staat om niet-gelokaliseerde trillingen op te roepen met goed gecontroleerde eigenschappen op nanoschaalverplaatsing en om calciumstromen te kwantificeren tijdens reacties van C. elegans op de trillingen.

Calciumbeeldvorming bij vrij gedragen caenorhabditis elegans met goed gecontroleerde, niet-gelokaliseerde trillingen

Snelle herhalingssnelheid fluorometer (FRRf) is een nuttige methode voor het meten van fotosysteem II fotofysiologie en primaire productiviteit. Hier beschrijven we een protocol om PSII-fotofysiologie van epizoïsche alg, Colacium sp. op substraat zoöplankton te meten met behulp van cuvette-type FRRf.

Het meten van fotofysiologie van attached stage van Colacium sp. door een Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Hart- en vaatziekten zijn wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak. Vasculaire verkalking draagt substantieel bij aan de last van cardiovasculaire morbiditeit en mortaliteit. Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om vasculaire gladde spiercel-gemedieerde calciumprecipitatie in vitro te kwantificeren door fluorescentie beeldvorming.

Een semi-geautomatiseerde en reproduceerbare biologische methode om calciumdepositie in vitro te kwantificeren

Hier presenteren we protocollen en hulpmiddelen voor het visualiseren van calcium tijdens bevruchting en vroege embryogenese met behulp van een genetisch gecodeerde calciumreporter die tot expressie komt in de kiembaan van de modelnematode C. elegans.

In vivo visualisatie van calciumtransiënten tijdens bevruchting en vroege ontwikkeling in C. elegans

Leer calcificatie-events karakteriseren in mariene buiswormen met levende optische en elektronenmicroscopie. Deze methode onthult biomineralisatieprocessen in Hydroides elegans tijdens metamorfose.

Karakterisering van calcificatie Events met Live optische en elektronenmicroscopie technieken in een Marine tubeworm

Meer video's verkennen