Name: Karakterisering van calcificatie Events met Live optische en elektronenmicroscopie technieken in een Marine tubeworm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 39 s
Description: Leer calcificatie-events karakteriseren in mariene buiswormen met levende optische en elektronenmicroscopie. Deze methode onthult biomineralisatieprocessen in Hydroides elegans tijdens metamorfose.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag een groot bedankje sturen naar Clemson Broadcast Productions, audio-opname door J. Bright, Narratio door A. D. McQuiston, Audio sweetening, K. Murphy, videofotografie door G. Spake, Grafische kunsten door T. Messervy, Videobewerking door T. Messervy en E. Rodgers. Technische assistentie en wetenschappelijke adviezen werden geïnspireerd door de adviezen van S. Kawada, S. Kubo, J. Hudson, T. Darroudi, D. Mulwee, H. Qian, Y. W. Lam, M. B. Johnstone, C. Campanati, A. C. Lane en R. Dineshram. Dit onderzoek werd gefinancierd door drie GRF-subsidies van de HKSAR-RGC (Subsidienummers: 705511P, 705112P en 17304914).

<ol><li>Aizenberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeleton+of+Euplectella+sp.%3A+structural+hierarchy+from+the+nanoscale+to+the+macroscale%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Skeleton of Euplectella sp.: structural hierarchy from the nanoscale to the macroscale.</a> Science. 309 (5732), 275-278 (2005).</li>
<li>de Nooijer, L. J., Toyofuku, T., Oguri, K., Nomaki, H., Kitazato, H. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.4319/lom.2008.6.610/abstract">Intracellular pH distribution in foraminifera determined by the fluorescent probe HPTS.</a> Limnol Oceanogr Methods. 6 (11), 610-618 (2008).</li>
<li>de Nooijer, L. J., Langer, G., Nehrke, G., Bijma, J. <a target="_blank" href="http://www.biogeosciences.net/6/2669/2009/">Physiological controls on seawater uptake and calcification in the benthic foraminifer Ammonia tepida.</a> Biogeosciences. 6 (11), 2669-2675 (2009).</li>
<li>Smith, A. M., Riedi, M. A., Winter, D. J. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s00227-013-2210-z">Temperate reefs in a changing ocean: skeletal carbonate mineralogy of serpulids.</a> Mar Biol. 160 (9), 1-14 (2013).</li>
<li>Carpizo-Ituarte, E., Hadfield, M. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/1542509?seq=1#page_scan_tab_contents">Stimulation of metamorphosis in the polychaete Hydroides elegans Haswell (Serpulidae).</a> Biol. Bull. 194 (1), 14(1998).</li>
<li>Bryan, P. J., Kreider, J. L., Qian, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022098197001056">Settlement of the serpulid polychaete Hydroides elegans (Haswell) on the arborescent bryozoan Bugula neritina (L.): evidence of a chemically mediated relationship.</a> J Exp Mar Biol Ecol. 220, 171-190 (1998).</li>
<li>Chan, V. B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+compositional+and+ultrastructural+shifts+during+the+development+of+calcareous+tubes+in+the+biofouling+tubeworm%2C+Hydroides+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence of compositional and ultrastructural shifts during the development of calcareous tubes in the biofouling tubeworm, Hydroides elegans.</a> J. Struct. Biol. 189 (3), 230-237 (2015).</li>
<li>DOE. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbook+of+methods+for+the+analysis+of+the+various+parameters+of+the+carbon+dioxide+system+in+sea+water.+Version+2%22">Handbook of methods for the analysis of the various parameters of the carbon dioxide system in sea water. Version 2</a>. Dickson, A. G., Goyet, C. , ORNL/CDIAC-74 (1994).</li>
<li>Chan, V. B. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.openaire.eu/search/publication?articleId=frontiers___::60dc3ff1cf8480f5672e61caa159856d">Direct deposition of crystalline aragonite in the controlled biomineralization of the calcareous tubeworm.</a> Front Mar Sci. 2, 97(2015).</li>
<li>Bond, J., Varley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+flow+cytometry+and+SNARF+to+calibrate+and+measure+intracellular+pH+in+NS0+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Use of flow cytometry and SNARF to calibrate and measure intracellular pH in NS0 cells.</a> Cytometry A. 64, 43-50 (2005).</li>
<li>Lloyd, G. E. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/249849686_Atomic_Number_and_Crystallographic_Contrast_Images_with_the_SEM_A_Review_of_Backscattered_Electron_Techniques">Atomic number and crystallographic contrast images with the SEM: a review of backscattered electron techniques.</a> Mineral Mag. 51, 3-19 (1987).</li>
<li>Perez-Huerta, A., Dauphin, Y., Cuif, J. P., Cusack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+electron+backscatter+diffraction+%28EBSD%29+data+from+calcite+biominerals+in+recent+gastropod+shells%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">High resolution electron backscatter diffraction (EBSD) data from calcite biominerals in recent gastropod shells.</a> Micron. 42 (3), 246-251 (2011).</li>
<li>Bandli, B. R., Gunter, M. E. <a target="_blank" href="http://ammin.geoscienceworld.org/content/97/8-9/1269">Electron backscatter diffraction from unpolished particulate specimens: examples of particle identification and application to inhalable mineral particulate identification.</a> Am. Mineral. 97, 1269-1273 (2012).</li>
<li>Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHayat%2C+MA+%22Principles+and+techniques+of+electron+microscopy%3A+biological+applications%22">Principles and techniques of electron microscopy: biological applications</a>. , Cambridge University Press. (2000).</li>
<li>Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009254108001940">Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale.</a> Chem Geo. 261, 217-229 (2009).</li>
<li>Volkert, C. A., Minor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+microscopy+and+micromachining%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bull%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam microscopy and micromachining.</a> MRS Bull. 32, 389-399 (2007).</li>
<li>Kudo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtexture+of+larval+shell+of+oyster%2C+Crassostrea+nippona%3A+A+FIB-TEM+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtexture of larval shell of oyster, Crassostrea nippona: A FIB-TEM study.</a> J. Struct. Biol. 169 (1), 1-5 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Live optische beeldvorming is een bruikbare methode voor het observeren van cellulaire gebeurtenissen in een meercellig organisme. Hier werden de interne pH en calciumionen indicatoren gebruikt om de flux van ionen te meten aan de mineralisatie sites. In deze gebieden wordt actieve ionen pompen nodig om pH en Ca2 + -concentratie te verheffen tot calcificatie 2, 3 mogelijk maken. Bij toepassing fluorescerende moleculen aan een organisme te bestuderen, ...

Biomineralization is een complexe reeks gebeurtenissen die een reeks cellen die leiden tot de productie van prachtig bestelde mineralen 1 overbrugt. De uitdaging is om zowel de dynamische celprocessen en de verfijnde mineraalstructuren een combinatie van optische en elektronenmicroscopie werkwijzen te karakteriseren. Een verhoging van de intracellulaire pH bevordert de vorming van CaCO 3 kristallen, dus het identificeren van de levensfase dat een verhoogde pH heeft onthult tijde verkalking wordt waarschijnlijk optreden 2, 3. De tubeworms uit de familie Serpulidae komen vaak kalkvormende in de oceaan 4. Het is ook een populaire ongewervelde model voor marien onderzoek, met name in biofouling 5, 6. In deze studie, het proces van calcificatie in mineralisatie compartimenten During biomineralization wordt waargenomen. De snelle proces van metamorfose omvat het ontstaan van calciumcarbonaat structuren 7, 8. We zien hoe interne pH metingen kunnen worden uitgevoerd op de tubeworm en hoe levensstadia en weefsels relevant voor verkalking kan worden gescreend. Na de levensfase plaats is geïdentificeerd, kan het weefsel belast calcificatie gekarakteriseerd met een hogere resolutie middels elektronenmicroscopie methoden. Middels fluorescentiemicroscopie, we de tijd die calciumcarbonaat verschijnen nadat metamorfe inductie te bepalen. Een vergelijkbare levensfase werd vervolgens zichtbaar gemaakt met SEM-EDS voor elementaire verdeling van de samenstelling en de afgezette minerale werd geanalyseerd met behulp van twee verschillende methoden elektronenmicroscopie, specifiek SEM-EBSD en FIB-TEM.

<table><tbody><tr><td>Hexamethyldisilazane&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16700(EM)</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19192</td><td></td></tr><tr><td>IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHZ1124</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin, Free Acid</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N7143-5MG</td><td></td></tr><tr><td>35 mm diameter dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D110400</td><td></td></tr><tr><td>5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C-1271</td><td></td></tr><tr><td>BDH Potassium Chloride, ACS Grade</td><td>VWR</td><td>BDH0258-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>083-01095</td><td></td></tr><tr><td>0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>199-02185</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>FASW</td><td>Iwaki Co. Ltd.</td><td>Rei-sea Marine</td><td></td></tr><tr><td>Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 &micro;m</td><td>ADVANTEC</td><td>A045A047A</td><td></td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>051-00476</td><td></td></tr><tr><td>Artificial seawater for buffers</td><td></td><td></td><td>by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>039-00475</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Sulfate</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>197-03345</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>089-08415</td><td></td></tr><tr><td>2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris)</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>207-06275</td><td></td></tr><tr><td>2-aminopyridine</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>011-02775</td><td></td></tr><tr><td>Orion 5-star Plus pH meter</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH, Bethesda, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRTEM H500</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU6600 VPSEM</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system</td><td>Hitachi&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

karakterisering van calcificatie events met live optische en elektronenmicroscopie technieken in een marine tubeworm

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

De karakterisering van het eerste biochemische proces van calciumcarbonaatproductie vereist een combinatie van microscopiebenaderingen. Ten eerste kunnen intracellulaire pH-verdeling en calciumionen worden waargenomen met behulp van live microscopie over tijd. Dit maakt het mogelijk om het levensstadium en het weefsel met de gewenste eigenschap te identificeren voor verdere elektronenmicroscopiestudies. Levensstadia en weefsels van belang zijn doorgaans hoger in pH en Ca-signalen.
Hier presenteren we, met behulp van H. elegans, een protocol om de aanwezigheid van calciumcarbonaatstructuren in een biologisch specimen op de rasterelektronenmicroscoop (SEM) te karakteriseren, met behulp van energie-dispersieve röntgenspectroscopie (EDS) om de elementaire samenstelling te visualiseren, met behulp van elektronenbackscatterdiffractie (EBSD) om de aanwezigheid van kristallijne structuren te bepalen, en met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) om de samenstelling en structuur van het materiaal te analyseren. In dit protocol wordt een gefocuste ionenbundel (FIB) gebruikt om monsters te isoleren met een afmeting die geschikt is voor TEM-analyse. Aangezien FIB een plaatsgebonden techniek is, laten we zien hoe informatie van de vorige technieken kan worden gebruikt om het gebied van belang te identificeren, waar Ca-signalen het hoogst zijn.

De volgende zijn enkele opmerkingen van de verkalking proces tijdens de metamorfose van het tubeworm. Figuur 1 toont dat de pH bij de kraag gebied is hoger dan de andere weefsels na metamorfose. Figuur 2i toont een tubeworm met homogene verdeling van Ca, wat suggereert geen grote kalkafzetting gebeurtenissen zijn begonnen; Figuur 2ii toont een tubeworm dat is verkalkt voor een langere periode, wat erop wijst verkalking is verder gegaan d...

We demonstreren het gebruik van verschillende microscopiemethoden die nuttig zijn bij het observeren van de verkalking van een buisworm, Hydroides elegans, evenals het lokaliseren en karakteriseren van het eerste verkalkte materiaal. Live microscopie en elektronenmicroscopie worden samen gebruikt om functionele en materiaalinformatie te verstrekken die belangrijk zijn bij het bestuderen van biomineralisatie.

Karakterisering van calcificatie Events met Live optische en elektronenmicroscopie technieken in een Marine tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Het algemene doel van deze procedure is om de locatie en structuur van een calcificatiegebeurtenis te bepalen door middel van een combinatie van optische en elektronenmicroscopische methoden. Dit wordt bereikt door de levende larvale kokerspanning tijdens de metamorfose te monitoren, de levensfase die verantwoordelijk is voor calcificatie en die kan worden gedetecteerd met behulp van fluorescente indicatoren die gevoelig zijn voor intracellulaire pH en calciumsignalen. Intracellulaire pH-imaging stelt ons in staat om de concentratie van protonen in en uit het cytoplasma tijdens het calcificatieproces te bestuderen.Om te beginnen met de intracellulaire pH-imaging in de larven van de mariene pijpworm, worden de zwemvaardige larven gekleurd met de intracellulaire pH-indicator kleurstof, SNARF-1 AM. De larven worden vervolgens overgebracht naar een schaaltje IBMX met zeewater, voorzien van een dun glazen observatievenster, en geplaatst onder een fluorescentiemicroscoop, waar ze worden bestraald met licht met een golflengte van 488 nanometer, dat door de kleurstof wordt geabsorbeerd. Emissies van 580 nanometer en 640 nanometer van de kleurstof worden verzameld. De waarden van de intrace

characterization-calcification-events-using-live-optical-electron

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video introduceert de concepten achter calciumbeeldvorming en bevat een voorbeeldprotocol voor time-lapse beeldvorming van wormen in gegoten agaroseputten.

Calcium imaging: een methode om neurale activiteit in levende C. elegans te visualiseren

Een geïntegreerde suite van beeldvormende technieken is toegepast op poliep morfologie en weefselstructuur in het Caribisch gebied koralen Montastraea annularis en M. te bepalen faveolata. Fluorescentie, serieblok gezicht, en twee-foton confocale laser scanning microscopie hebben lobbige structuur, poliep muren, en de geschatte chromatophore en zoöxanthellen dichtheid en uitkeringen geïdentificeerd.

Multimodale optische microscopie methoden Reveal Poliep Tissue morfologie en structuur in het Caribisch gebied Reef Building Koralen

Het in beeld brengen van gedrag en neurale activiteit over lange tijdschalen zonder het dier te immobiliseren, is een voorwaarde om gedrag te begrijpen. Agarose microfluïdische kamersbeeldvorming (AMI) kan worden gebruikt om neurale activiteit en gedrag voor alle levensfasen van Caenorhabditis elegans in beeld te brengen.

Agarose microkamers naar Lange termijn Calcium Imaging van<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

In dit artikel tonen we live beeldvorming van individuele wormen met een aangepaste microfluidic apparaat. In het apparaat, zijn meerdere wormen individueel beperkt om te scheiden van de kamers, waardoor multiplexed longitudinale toezicht van verschillende biologische processen.

Een Microfluidic Platform voor het longitudinale beeldvorming in Caenorhabditis elegans

Hier worden protocollen voor het uitvoeren van micro focus X-Ray computertomografie (microCT) Imaging van drie mariene ongewervelde dieren gedetailleerd uitgelegd. Deze studie beschrijft stappen zoals monster fixatie, kleuring, montage, Scanning, beeld reconstructie en data-analyses. Suggesties over hoe het protocol kan worden aangepast voor verschillende monsters worden ook verstrekt.

MicroFocus X-Ray CT (microCT) beeldvorming van Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe SP. (Annelida), en xenoturbella japonica (xenacoelomorpha)

Deze methode biedt een manier om te koppel optogenetics en genetisch gecodeerde calcium sensoren om beeld Baseline cytosolische calcium niveaus en veranderingen in opgeroepen calcium transiënten in het lichaam muur spieren van het modelorganisme C. elegans.

In vivo calcium beeldvorming in C. elegans lichaam muur spieren

Hier gerapporteerd is een systeem voor calciumbeeldvorming bij vrij gedragende Caenorhabditis elegans met goed gecontroleerde, niet-gelokaliseerde trillingen. Dit systeem stelt onderzoekers in staat om niet-gelokaliseerde trillingen op te roepen met goed gecontroleerde eigenschappen op nanoschaalverplaatsing en om calciumstromen te kwantificeren tijdens reacties van C. elegans op de trillingen.

Calciumbeeldvorming bij vrij gedragen caenorhabditis elegans met goed gecontroleerde, niet-gelokaliseerde trillingen

Snelle herhalingssnelheid fluorometer (FRRf) is een nuttige methode voor het meten van fotosysteem II fotofysiologie en primaire productiviteit. Hier beschrijven we een protocol om PSII-fotofysiologie van epizoïsche alg, Colacium sp. op substraat zoöplankton te meten met behulp van cuvette-type FRRf.

Het meten van fotofysiologie van attached stage van Colacium sp. door een Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Hart- en vaatziekten zijn wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak. Vasculaire verkalking draagt substantieel bij aan de last van cardiovasculaire morbiditeit en mortaliteit. Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om vasculaire gladde spiercel-gemedieerde calciumprecipitatie in vitro te kwantificeren door fluorescentie beeldvorming.

Een semi-geautomatiseerde en reproduceerbare biologische methode om calciumdepositie in vitro te kwantificeren

De huidige methoden beschrijven een niet-ratiometrische benadering voor hoge resolutie, sub-compartimentale calciumbeeldvorming in vivo in Caenorhabditis elegans met behulp van direct beschikbare genetisch gecodeerde calciumindicatoren.

Subcellulaire beeldvorming van neuronale calciumbehandeling in vivo

Hier presenteren we protocollen en hulpmiddelen voor het visualiseren van calcium tijdens bevruchting en vroege embryogenese met behulp van een genetisch gecodeerde calciumreporter die tot expressie komt in de kiembaan van de modelnematode C. elegans.

In vivo visualisatie van calciumtransiënten tijdens bevruchting en vroege ontwikkeling in C. elegans

Leer calcificatie-events karakteriseren in mariene buiswormen met levende optische en elektronenmicroscopie. Deze methode onthult biomineralisatieprocessen in Hydroides elegans tijdens metamorfose.

Karakterisering van calcificatie Events met Live optische en elektronenmicroscopie technieken in een Marine tubeworm

Meer video's verkennen