Karakterisering van calcificatie Events met Live optische en elektronenmicroscopie technieken in een Marine tubeworm

Het algemene doel van deze procedure is om de locatie en structuur van calcificatie-gebeurtenissen te bepalen door een combinatie van optische en elektronenmicroscopiemethoden uit te voeren. Dit wordt bereikt door het levende larvale buisworm tijdens metamorfose te monitoren, het levensstadium dat verantwoordelijk is voor calcificatie dat kan worden gedetecteerd met behulp van fluorescente indicatoren die gevoelig zijn voor intracellulair pH en calciumsignalen. Intracellulair pH-beeldvorming stelt ons in staat om de concentratie van protonen in en uit het cytoplasma in het proces van calcificatie te bestuderen.

Om te beginnen, wordt intracellulair pH-beeldvorming in de mariene buiswormlarven uitgevoerd door de competente zwemmende larven te kleuren met de intracellulaire pH-indicatorkleurstof SNARF-1 AM. De larven worden vervolgens overgebracht naar een schaal met IBMX bevattende zeewater met een dun glazen observatievenster en geplaatst op een fluorescente microscoop, waar ze worden bestraald met licht van 488 nanometer in golflengte, dat door de kleurstof wordt geabsorbeerd. Emissiën van 580 nanometer en 640 nanometer van de kleurstof worden verzameld. De waarden van intracellulair pH kunnen worden berekend uit de verhoudingen van deze waarden.

Optische microscopie stelt ons in staat om tijd en weefselgebied te identificeren die geassocieerd zijn met een hoger pH-niveau. Dit is de eerste stap om de tijdstippen van interesse voor verdere analyse te bepalen. In de tweede stap wordt de buisworm met fixeermiddelen bewaard op de relevante tijdstippen voor elektronenmicroscopie.

Een nieuw mineraliserend levensstadium wordt geïdentificeerd met behulp van SEM-EDS-mapping voor calciumsignaal. Vervolgens worden de gebieden met een hoog calciumsignaal gescreend met behulp van SEM/EBSD, waardoor de aanwezigheid van kristallijn mineraal wordt geïdentificeerd. Ten slotte wordt met behulp van een gefocuste ionenstraal het mineraal uitgesneden, een dunne sectie wordt voorbereid voor TEM-observatie.

Deze sectie wordt gebruikt om een selectief gebieddiffractiepatroon te verkrijgen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek of conventionele testmethoden zoals bulk X-ray diffractiespectroscopie is dat het directe observatie biedt van specifieke structuren die zijn waargenomen door optische en elektronenmicroscopiemethoden, dus discrete calcificatiegebeurtenissen kunnen direct op zowel temporele als ruimtelijke niveaus worden bestudeerd. Wanneer calcificatie wordt bestudeerd met calcium- en intracellulaire pH-indicatoren, kunnen we de tijdschaal van deze relevante fysiologische gebeurtenissen identificeren.

Het bewaren van monsters op het juiste moment is cruciaal voor een vruchtbare SEM-analyse. Bij het zoeken naar het eerste gebeurtenis van biologische calcificatie kan SEM/EDX worden gebruikt om de elementaire verdeling van calcium te screenen. Een locatie met meer calcium kan op de aanwezigheid van calciumcarbonaat wijzen, maar alleen de aanwezigheid van een röntgendiffractiepatroon kan bevestigen dat er een kristallijne structuur is.

Dergelijke informatie kan worden verkregen met behulp van EBSD en TEM. Elektronenbackscatterdiffractie is een kristallografische karakteriseringstechniek om kristallijn of polykristallijn materiaal te identificeren, zolang de microstructuur en de elektrodenhoek van de elektronen voldoen aan de Bragg-diffractievoorwaarde. Meestal worden backgescatterde elektronen verzameld op een hoek van 70 graden op een gepolijst specimen met graan- of kristeloriëntatiekaarten.

Voor een ongepolijst monster is het moeilijk om zo'n kaart van deze oneffen oppervlakken te genereren, omdat niet alle serviceseries voldoet aan de EBSD-hoekvereisten. Echter, in de vorm van punt IG kan een Cacucci-diffractiepatroon nog steeds worden verzameld van deze oneffen oppervlakken zolang de EBSD-hoekvereiste wordt vervuld. Het Cacucci-diffractiepatroon biedt ondubbelzinnige bevestiging dat het kristallijne mineraal aanwezig is.

Onze methode is direct en snel, en kan worden toegepast op andere mineraliserende weefsels. Hier wordt een gefocuste ionenstraal gebruikt om een micromonster te fabriceren, wat ook een zeer directe methode is om een TEM-sectie voor te bereiden. Om het metamorfoseproces te onderzoeken, werden buiswormen ongeveer vijf dagen in het laboratorium gekweekt.

De competente larven zullen in een voorwaartse richting zwemmen in plaats van een cirkelvorkige beweging. Dit betekent dat ze klaar zijn voor metamorfose. Competente larven in het fluorescerende oplossing in zeewater incuberen, de containers afdekken met folie om fotobleken te voorkomen en de dieren een nacht lang incuberen.

De buiswormlarven worden tegen het nylon gaas gewassen dat de larven zal vasthouden, maar de oplossing zal laten passeren. Was de larven twee keer met gefilterd zeewater om overtollige kleurstofoplossing te verwijderen. Druk de zeef tegen de petrischaal om een strakke afdichting te maken voordat u de afdichting loslaat om de wasoplossing weg te gooien.

Zorg ervoor dat de larven niet uitdrogen. Plaats vervolgens elk van de 10 tot 20 larven in een dunne, glazen bodemschaal met IBMX en bedek de schaal tot het beeldvormen. Plaats vervolgens de geschikte filterkubussen met de juiste dichroische spiegels om de fluorescente signalen te detecteren.

Optimaliseer de sluitertijd om snel genoeg te zijn om beelden te maken voor een levend organisme. Selecteer vervolgens de optische sectieparameters in de Z-Stack-optie, beweeg de microscopische trap op en neer om de start- en stoppositie van beeldacquisitie te definiëren. Stel een afstand van één micrometer tussen de lagen in.

Na het beeldvormen, exporteert u alle gegevens als grijsschalen TIF-bestanden. Dit kan worden gedaan door Bestand, Exporteren te selecteren. Zorg ervoor dat de bestandstypen verschijnen als TIF-afbeeldingen en klik vervolgens op Start.

De grijsschalenafbeelding in elk kanaal, in elke laag van Z-Stack, zal in dezelfde afbeeldingsmap staan, klaar voor beeldanalyse. Genereer ten slotte een samengestelde afbeelding voor elk van de fluorescente kanalen met behulp van ImageJ. De volgende JoVE-video's laten zien hoe u kalibratie en metingen voor intracellulair pH uitvoert.

Bewaar de buiswormen die metamorfosering ondergaan met behulp van een crosslinkingfixatief, met behulp van een