Fluorescentie-gemedieerde tomografie voor de detectie en kwantificering van macrofaag-gerelateerde lymfkliertest darmontstekingen

Het algemene doel van deze doelspecifieke in vivo beeldvormingsbenadering is het visualiseren van moleculaire markers van ziekteactiviteit bij inflammatoire darmziekten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van inflammatoire darmziekten en gerelateerd therapeutisch onderzoek naar de invloed van experimentele therapieën of specifieke cellulaire gebeurtenissen op ontsteking. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de ziekteactiviteit longitudinaal en non-invasief kan worden gemonitord.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in inflammatoire aandoeningen, kan deze ook worden toegepast bij de studie naar andere ziekten, zoals kanker of immuungerelateerde ziekten. Om colitis te induceren, vult u de drinkwatervoorraad van de experimentele muizen met twee gram dextraannatriumsulfaat, of DSS, opgelost in 100 milliliters gesteriliseerd drinkwater, waarbij wordt uitgegaan van vijf milliliters water per muis per dag. 24 uur voor het scannen vult u een steriele spuit, beschermd tegen licht, met de gewenste antilichaamcocktail en injecteert u de antilichamen intraveneus in de staartvenen van de experimentele dieren.

Scheren op de dag van het experiment de vacht in de buikstreek van de proefdieren met een elektrisch scheerapparaat om lichtreflectie en -absorptie te minimaliseren. Vul een weefenachende fantoom van een gedefinieerde dikte en absorptiekenmerken met een specifiek volume van de betreffende antilichaamoplossing en meet de fluorescentie op het FMT-apparaat. Klik vervolgens op een veterinaire fluorescentie-gemedieerde tomografie- of FMT-apparaat voor kleine dieren op Nieuwe Studie en voeg de relevante tracers toe aan de studiebeschrijving, inclusief de beeldgevingsparameters en doses.

Stel studiegroepen samen volgens het experimentele ontwerp en voorzie elke groep van het juiste aantal dieren. Wanneer het systeem is gekalibreerd voor de tracer-constructen, plaats dan de eerste geanestheseerde muis in rugligging in een verwarmbare onderzoekscassette van 42 °C. Plaats de cassette in het beeldvormingssysteem en selecteer het juiste monster uit de overeenkomstige studiegroep.

Selecteer de toegediende tracer om ervoor te zorgen dat de waarden van de tracerconcentratie correct worden berekend, en neem het fluorescentiereflectiebeeld op bij de juiste golflengte voor de scan. Klik op Acquire Image om het scanveld te omlijnen en bevestig dat het scanveld als een overlay op het fluorescentiereflectiebeeld verschijnt. Pas het scanveld aan totdat het het interessegebied omsluit, waarbij u erop let fouten of gebieden met resterende vacht te vermijden.

Select, afhankelijk van het beelddoel, een scanveldresolutie om het aantal beelddatapunten binnen het scanveld in te stellen. Klik vervolgens op Scan om de beeldacquisitie te starten bij de geselecteerde golflengte. Verwijder aan het einde van de scan het dier uit de cassette, zodat het dier onder monitoring volledig kan herstellen voordat het terugkeert naar de kooi.

De FMT kan vervolgens op verschillende tijdstippen worden herhaald, afhankelijk van wat experimenteel passend is. Om de verkregen beelden te analyseren, opent u de betreffende software voor beeldanalyse en selecteert u de ruwe gegevens van de eerste scan. Maak met behulp van de reconstructietool 3D-kaarten van de fluorescentieverdeling.

Wanneer alle scans aan de juiste reconstructiedataset zijn toegevoegd, opent u de eerste dataset van belang. Alle scans die zijn uitgevoerd voor het geselecteerde individuele experimentele dier worden getoond. Selecteer de juiste scan en klik op Laden.

Een 3D-reconstructie van de tracerdistributie verschijnt als een overlay over de aanvankelijk verkregen fluorescentiereflectantie-afbeelding. Identificeer vervolgens de brandpunten van aspecifieke labelaccumulatie op de gereconstrueerde 3D-kaarten en gebruik het meetinstrument om het interessegebied te selecteren. De software genereert vervolgens een fluorescentie-intensiteit voor het interessegebied, evenals picomolaire hoeveelheidsmetingen van de tracer waarvoor de scan is gekalibreerd.

In dit experiment werd een fluorescentie-geconjugeerd antilichaam tegen murine F4/80 gebruikt om de geactiveerde macrofagen direct te visualiseren. Met fluorescentie-gemedieerde tomografie werd een significant verhoogde accumulatie van de fluorescente tracer gemeten in de colons van de colitische muizen vergeleken met de niet-colitische controledieren, wat wijst op een toename van monocyteninfiltratie en differentiatie naar actieve macrofagen in de colitische dieren. Omgekeerd lokte de toepassing van een niet-specifiek fluorescentie-geconjugeerd IgG-antilichaam geen detecteerbare fluorescentierespons uit in het abdomen of de darmen in zowel de colitische als de niet-colitische controlegroep, wat de specificiteit van de probe-target interactie van het F4/80-antilichaam aantoont.

Ex vivo metingen van de accumulatie van F4/80-gerichte tracers in geëxplante colons bevestigen verder de colonische oorsprong van de in vivo gedetecteerde accumulatie van het F4/80-tracersignaal. Inderdaad correleren de berekende hoeveelheden gebonden antilichamen goed met de histologisch bepaalde aantallen infiltrerende macrofagen, wat bevestigt dat in vivo beeldvorming met specifieke tracers indicatief kan zijn voor lokale ziekteactiviteit. Eenmaal beheerst, kan dit binnen enkele minuten worden uitgevoerd en geanalyseerd, mits het correct wordt uitgevoerd.

De voorbereidingsstappen, inclusief de productie van specifieke antilichaam-gebaseerde tracers, duren doorgaans twee tot drie dagen. Bij het plannen van een experimentele procedure zoals deze is het belangrijk om passende en betrouwbare controles op te nemen, zowel voor het antilichaam als voor het diermodel van de ziekte. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals colonoscopie of flowcytometrie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden en om de gegevens te valideren en te kwantificeren.