Fluorescentie-gemedieerde tomografie voor de detectie en kwantificering van macrofaag-gerelateerde lymfkliertest darmontstekingen
December 15th, 2017
Doelgroepen gerichte sondes vertegenwoordigen een vernieuwend hulpmiddel voor het analyseren van de moleculaire mechanismen, zoals eiwituitdrukking in verschillende soorten ziekten (b.v., ontsteking, infectie en tumorvorming). In deze studie beschrijven we een kwantitatieve driedimensionale tomografische beoordeling van intestinale macrofaag infiltratie in een lymfkliertest model van colitis met F4/80-specifieke fluorescentie-gemedieerde tomografie.
Het algemene doel van deze doelspecifieke in vivo beeldvormingsaanpak is om moleculaire markers van ziekteactiviteit bij inflammatoire darmaandoeningen te visualiseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van inflammatoire darmaandoeningen en gerelateerde therapeutische onderzoeken over de invloed van experimentele therapieën of specifieke cellulaire gebeurtenissen op ontstekingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de ziekteactiviteit longitudinaal en non-invasief kan worden gemonitord.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in inflammatoire aandoeningen, kan deze ook worden toegepast om andere ziekten te bestuderen, zoals kanker of immuungerelateerde aandoeningen. Om colitis te induceren, vult u de drinkvoorziening van de experimentele muizen met twee gram dextran natriumsulfaat, of DSS, opgelost in 100 milliliter geautoclaveerd drinkwater, waarbij vijf milliliter water per muis per dag wordt geschat. 24 uur voor het scannen, laadt u de cocktail van antilichamen van belang in een steriele spuit beschermd tegen licht en injecteert u de antilichamen intraveneus in de staarsaders van de experimentele dieren.
Op de dag van het experiment, gebruikt u een elektrische scheermachine om de vacht in de buikstreek van de experimentele dieren te scheren om lichtreflectie en absorptie te minimaliseren. Gebruik een weefsel-imiterende phantoom met gedefinieerde dikte en absorptiekarakteristieken, vul de phantoom met een specifiek volume van de oplossing van het antilichaam van belang en meet de fluorescentie op het FMT-apparaat. Klik vervolgens op een veterinaire fluorescentie-gemedieerde tomografie, of FMT-apparaat voor kleine dieren, op Nieuwe Studie en neem de relevante tracers op in de beschrijving van het onderzoek, inclusief de beeldvormingsparameters en doses.
Maak studiegroepen volgens het experimentele ontwerp, voorzie elke groep van het juiste aantal dieren. Wanneer het systeem is gekalibreerd voor de tracerconstructies, plaatst u de eerste geanesthetiseerde muis in rugligging in een verwarmbaar onderzoekscassette. Plaats de cassette in het beeldvormingssysteem en selecteert u het juiste monster uit de bijbehorende studiegroep.
Selecteer de toegediende tracer om ervoor te zorgen dat de waarden van de tracerconcentratie correct worden berekend, en verwerft u het fluorescentiereflectiebeeld bij de juiste golflengte voor de scan. Klik op Afbeelding verkrijgen om het scanveld af te bakenen en bevestig dat het scanveld verschijnt als een overlay op het fluorescentiereflectiebeeld. Pas het scanveld aan totdat het het gebied van belang omringt, zorgvuldig om fouten of gebieden met resterend haar te vermijden.
Afhankelijk van het beelddoel, selecteert u een scanveldresolutie om het aantal beeldgegevenspunten binnen het scanveld in te stellen. Klik vervolgens op Scannen om de beeldacquisitie bij de geselecteerde golflengte te starten. Aan het einde van de scan, verwijdert u het dier uit de cassette om het dier volledig te laten herstellen met begeleiding voordat het terugkeert naar zijn kooi.
De FMT kan vervolgens op verschillende tijdstippen worden herhaald, zoals experimenteel gepast. Om de verworven beelden te analyseren, opent u de geschikte beeldanalysesoftware en selecteert u de ruwe gegevens voor de eerste scan. Gebruik het reconstructiegereedschap om 3D-kaarten van de fluorescentiedistributie te maken.
Wanneer alle scans zijn toegevoegd aan de juiste reconstructiedataset, opent u de eerste dataset van belang. Alle scans die zijn uitgevoerd voor het geselecteerde individuele experimentele dier worden getoond. Selecteer de juiste scan en klik op Laden.
Een 3D-reconstructie van de tracerdistributie verschijnt als een overlay van het aanvankelijk verkregen fluorescentiereflectiebeeld. Identificeer vervolgens de foci van onspecifieke labelaccumulatie op de geconstrueerde 3D-kaarten en gebruik het meetgereedschap om het gebied van belang te selecteren. De software genereert vervolgens een fluorescentie-intensiteit voor het gebied van belang, evenals picomolare hoeveelheidsmetingen van de tracer waarvoor de scan werd gekalibreerd.
In dit experiment werd een fluorescentie-geconjugeerd antilichaam tegen muis F4/80 gebruikt om de geactiveerde macrofagen direct te visualiseren. Een significant verhoogde accumulatie van fluorescerende tracer werd gemeten door middel van fluorescentie-gemedieerde tomografie in de colons van de colitismuizen in vergelijking met de niet-colitis controledieren, wat duidt op een toename van monocytinfiltratie en differentiatie in actieve macrofagen in de colitisdieren. Omgekeerd, deed de toepassing van een niet-specifiek fluorescentie-geconjugeerd IgG-antilichaam geen detecteerbare fluorescentiereactie op in de buik of darm in zowel de colitis als de niet-colitis controlegroep, wat de specificiteit van de probe-target interactie van het F4/80-antilichaam aantoont.
Ex vivo metingen van F4/80-gerichte traceraccumulatie in geëxplanteerde colons bevestigen verder de colonische oorsprong van de in vivo gedetecteerde F4/80-tracersignaalaccumulatie. Inderdaad, berekende hoeveelheden van gebonden antilichaam correleren goed met histologisch bepaalde aantallen van infiltrerende macrofagen, wat bevestigt dat in vivo beeldvorming met specifieke tracers indicatief kan zijn voor lokale ziekteactiviteit. Eenmaal onder de knie, kan dit binnen een paar minuten worden uitgevoerd en geanalyseerd als het goed wordt uitgevoerd.
De voorbereidingsstappen, inclusief de productie van specifieke antilichaam-gebaseerde tracers, duren doorgaans twee tot drie dagen. Bij het plannen van een dergelijk experimenteel proces is het belangrijk om geschikte en betrouwbare controles op te nemen, zowel voor het antilichaam als het diermodel van de ziekte. Na dit proces kunnen andere methoden, zoals colonoscopie of flowcytometrie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden en om de gegevens te valideren en te kwantificeren.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een doelwit-specifieke in vivo beeldvormingsbenadering om moleculaire markeren van ziekteactiviteit bij inflammatoire darmziekte te visualiseren. Door gebruik te maken van een kwantitatieve driedimensionale tomografische beoordeling, richt het onderzoek zich op infiltratie van intestinale macrofagen in een muismodel van colitis.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Immunologie
- Inflammatoire darmziekte
Achtergrond
- Doelwit-specifieke sondes zijn innovatieve hulpmiddelen voor het analyseren van moleculaire mechanismen.
- Ze kunnen worden gebruikt om eiwitexpressie in verschillende ziekten te bestuderen.
- Deze methode maakt longitudinale en niet-invasieve monitoring van ziekteactiviteit mogelijk.
- Het kan worden toegepast op inflammatoire aandoeningen, kanker en immuungerelateerde ziekten.
Doel van de studie
- Om moleculaire markeren van ziekteactiviteit bij inflammatoire darmziekte te visualiseren.
- Om belangrijke vragen in therapeutisch onderzoek gerelateerd aan ontsteking aan te pakken.
- Om de invloed van experimentele therapieën op ontsteking te evalueren.
Gebruikte methoden
- Inductie van colitis met behulp van dextran natriumsulfaat (DSS).
- Toediening van een antilichaamcocktail intraveneus in experimentele muizen.
- Fluorescentie-gemedieerde tomografie voor beeldvorming van macrofageninfiltratie.
- Longitudinale monitoring van ziekteactiviteit in vivo.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van intestinale macrofageninfiltratie.
- Demonstratie van de mogelijkheid om ziekteactiviteit niet-invasief te monitoren.
- Inzichten in de dynamiek van ontsteking bij colitis.
- Mogelijke toepassingen voor het bestuderen van andere ziekten werden geïdentificeerd.
Conclusies
- De doelwit-specifieke beeldvormingsbenadering is effectief voor het bestuderen van inflammatoire darmziekte.
- Deze methode kan het begrip van ziektemechanismen en therapeutische effecten verbeteren.
- Toekomstig onderzoek kan de toepassing ervan uitbreiden naar andere inflammatoire en immuungerelateerde ziekten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Non-invasive longitudinal imaging of macrophage infiltration enables early detection of inflammatory responses in preclinical models, reducing reliance on terminal endpoints and supporting mechanistic de-risking of anti-inflammatory therapeutics. Quantitative 3D fluorescence-mediated tomography provides predictive confidence in target engagement and disease-modifying effects, informing go/no-go decisions in IBD and immune-mediated disease programs. This approach enhances translational continuity by aligning in vivo imaging readouts with histopathological validation, improving portfolio triage and resource allocation in discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing F4/80-positive macrophage accumulation as a functional readout of intestinal inflammation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through specific probe-target interactions, demonstrated by lack of signal with non-specific IgG controls.
- Predictive Value: Correlates in vivo tracer accumulation with ex vivo antibody binding and histologic macrophage counts, strengthening target confidence for immunomodulator screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative 3D fluorescence maps and picomolar tracer measurements, enabling reproducible compound screening in colitis models.
- Scalability: Facilitates longitudinal monitoring across time points, reducing animal use and increasing statistical power in therapeutic efficacy studies.
- Platform Reuse: Compatible with downstream validation via colonoscopy or flow cytometry, supporting integrated workflows for target validation and biomarker alignment.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models intestinal inflammation through DSS-induced colitis, a widely used system for studying IBD pathogenesis and therapeutic response.
- Translational Continuity: Links non-invasive imaging to histologic endpoints, enabling risk-adjusted advancement decisions based on concordant in vivo and ex vivo data.
- Mechanistic De-risking: Tracks monocyte infiltration and macrophage differentiation dynamics, providing insight into cellular mechanisms of action for experimental therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
Fluorescence-mediated tomography fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for immune-modulating compounds in gastrointestinal inflammation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying macrophage infiltration as a pharmacodynamic readout of pathway modulation in colitis models.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (fluorescence intensity, tracer concentration) that enable comparison across treatment groups and time points.
- Analytics: Provides reconstructable 3D datasets and region-of-interest measurements that facilitate statistical analysis of treatment effects on immune cell localization.
- Translational Research: Connects in vivo imaging to ex vivo validation, strengthening biomarker alignment and preclinical continuity for IBD-targeted candidates.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable imaging capability applicable across immune cell tracking, stem cell studies, and oncology models beyond intestinal inflammation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through specific, quantifiable imaging of macrophage activity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via calibrated tracer quantification and longitudinal intra-individual tracking.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on non-invasive disease activity monitoring, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through concordant imaging and histologic data, refining advancement criteria in immunomodulator pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence imaging, tracer preparation, and small animal handling for intravenous injection and anesthesia protocols.
- Dependent on access to a small animal fluorescence-mediated tomography system with appropriate wavelength selection and reconstruction software.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols, tracer dosing, and region-of-interest analysis for consistent data interpretation.
- Involves adaptation considerations across model systems, including fur removal and abdominal imaging optimization to minimize signal interference.
- Includes practical limitations such as the 2–3 day tracer preparation timeline and the need for appropriate isotype and disease controls to ensure specificity.
