Driedimensionale kwantificering van darmslijm met behulp van beeldvorming van het hele weefsel

Ons onderzoek richt zich op de mechanismen van microbiële injectie met mucosale weefsels, waarbij de cruciale rol van slijm bij het moduleren van deze interacties wordt benadrukt. Traditionele 2D-kwantificatie van slijm mist ruimtelijke en volumetrische details. Ons protocol maakt nauwkeurige 3D-analyse mogelijk, waarbij structurele en distributieveranderingen worden blootgelegd door moleculaire interventies die in bestaande methoden over het hoofd worden gezien.

Dit protocol combineert hormoonbeeldvorming met 3D-kwantificatie en levert robuuste, reproduceerbare metingen van de darmslijmarchitectuur toepasbaar op diverse experimentele omstandigheden en moleculaire interventies die conventionele 2D-beoordeling overtreffen. Om te beginnen plaats je een verdoofde muis van zes tot acht weken oud op een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur te behouden. Desinfecteer het huidoppervlak van de muis met alcohol en maak een incisie in de linker onderbuik om het cekumum bloot te leggen terwijl de verdoving behouden blijft.

Identificeer nu het ileum of de proximale colon. Plaats de darmlus op steriel gaas. Spoel met steriele PBS en sluit beide uiteinden vast met arteriële klemmen om een drie centimeter lange gesloten lus te creëren.

Onder narcose mag niet meer dan 200 microliter steriele PBS of carbamoylcholinechloride-reagens in de geligeerde darmlus worden geïnjecteerd. Na 30 minuten behandeling oogst je de darmlus van het geëuthanaseerde dier. Met een tang houd je de darmlus vast en spoel je deze voorzichtig af met steriele PBS.

Snijd de darmlus in de lengte, met een klein ongesneden deel, open en spoel het weefsel opnieuw af met steriele PBS. Plat het weefsel in een schaaltje van zes centimeter en snijd het resterende deel open. Gebruik koperen draadsegmenten om het aan de agarosebasis te bevestigen.

Voeg nu 10 milliliter 4% paraformaldehydeoplossing toe aan de schaal om het weefsel 12 tot 24 uur vast te zetten. Na de incubatie verwijder je de paraformaldehydeoplossing en was je het weefsel minstens drie keer met PBS om eventueel resterende paraformaldehyde te verwijderen. Dompel vervolgens het weefsel onder in 10 milliliter blokkerende buffer bestaande uit PBS, aangevuld met 0,4% Triton X-100 en 3% BSA, en bewaar het 12 tot 24 uur bij vier graden Celsius.

Verwijder de blokkeringsbeschermer. Kleur het weefsel met een kleurstofoplossing die tarwekiemen, agglutinine en falloïde bevat. In met PBS behandelde dunne darm en colonweefsels was WGA-positief slijm voornamelijk gelokaliseerd in bekercellen aan het epitheeloppervlak.

Na de behandeling met carbamoylcholinechloride nam de hoeveelheid WGA-positief slijm in het darmlumen merkbaar toe in zowel de dunne darm als de dikke darm, maar het slijm werd sporadisch verspreid in plaats van een continue laag te vormen. Het volume van bekercel-geassocieerd WGA-positief slijm was significant verminderd na carbamoylcholinechloridebehandeling in zowel de dunne darm als de colon, wat wijst op actieve secretie. Alle bekercelslijmvolumes in met PBS behandelde weefsels lagen onder de 1.000 kubieke micrometer.

WGA-positieve items die meer dan 1.000 kubieke micrometer waren, werden geclassificeerd als afgescheiden slijm in het lumen. De behandeling met carbamoylcholinechloride verhoogde het totale volume van het uitgescheiden slijm met ongeveer vijf tot twintig keer in zowel dunne darm als colonweefsel.