Imaging neurale activiteit in de primaire somatosensorische Cortex met behulp van Thy1-GCaMP6s transgene muizen

Deze methode maakt het mogelijk de neurale activiteit gedurende een langere periode in vivo vast te registreren en te kwantificeren in bilaterale corticale regio's van de muis. De twee foton techniek heeft het voordeel van het detecteren van activiteit tegelijkertijd in grote of verspreide neuronale bevolking over een langere periode. De implicaties van deze techniek uitgebreid naar het onderzoek van activiteitspatronen in gedefinieerde neuronale populaties in verschillende regio's van de levende hersenen.

12 uur voor aanvang van de procedure, verwarm de optische ramen op 50 graden Celsius in 70%ethanol. Een optisch venster bestaat uit een ronde vijf-millimeter diameter bovendeksel glas en een onderste gedeelte met een ronde drie-millimeter diameter deksel glas. Bevestig aan het einde van de opwarmings incubatie een gebrek aan respons op teenknijpen op een verdoofde 20 tot 25-gram 1 1/2 tot 2 1/2 maand oude Thy1 GCaMP6s muis, en breng zalf toe op de ogen van het dier.

Plaats de muis op een verwarmingskussen bedekt met een steriele gordijnen en gebruik een head-holding adapter voor muizen om het hoofd te stabiliseren. Scheer het grootste deel van de hoofdhuid met een scheermes met twee randen en maak de blootgestelde huid schoon met sequentiële steriele alcoholbereidingskussens en povidone-jodiumoplossingsscrubs. Gebruik dan een schaar om een rechthoekige twee bij drie millimeter gesneden in de hoofdhuid aan de rechterkant van de schedel te maken.

Met behulp van een wattenstaafje, duw de huid opzij om een blootstelling gebied van meer dan drie millimeter in diameter te creëren, en gebruik een stomp microchirurgisch blad om voorzichtig te verwijderen van het bindweefsel aan de schedel. Met een tandboor, voorzichtig markeren een drie millimeter diameter cirkel rond de S1 gebied. Na het maken van een soortgelijke cirkel aan de linkerkant van de schedel, breng een dunne laag cyanoacrylaat superlijm aan beide zijden van het bot om een basis voor een tandheelkundige cement toepassing te bieden.

Gebruik onder een ontledende microscoop een snelle microboor om een cirkelvormige groef aan de rechterkant van de schedel rond het S1-gebied te verdunnen om een gladde rand te creëren, waarbij het botpuin met een vacuüm wordt gebruikt als dat nodig is. Na een ongeveer 2/3 botdiepte is bereikt, langzaam en zorgvuldig dun de resterende 1/3 van het bot tot een cirkelvormige botflap volledig is bevrijd van de omliggende schedel. Gebruik een paar 5/45 tangen om langzaam en voorzichtig het ronde stuk bot te verwijderen om de dura bloot te leggen, waarbij u ervoor zorgt dat de pialvaten niet beschadigd worden.

Na het verwijderen van een botflap van de linkerkant van de schedel op dezelfde manier, spoel het optische venster voor de rechterkant van de schedel met steriele zoutoplossing, en controleer op onvolkomenheden onder een stereomicroscoop. Installeer het optische venster over de craniotomie regio met het bovenste gedeelte van het raam rustend op de schedel en het onderste gedeelte binnen de craniotomized opening, rustend op de dura, in aanwezigheid van cerebrale spinale vloeistof. Gebruik de cyanoacrylaat superlijm om het bovenste gedeelte van de optische vensterrand aan de schedel te verzegelen.

Wanneer de lijm is gedroogd, breng zwarte tandcement aan op de rand van het glas, de rest van de rechterkant van de blootgestelde schedel, en de wondmarges om het licht te blokkeren. Installeer vervolgens het linker optische venster en laat het dier herstellen met controle tot volledige recumbency. Zeven tot 10 dagen na de procedure, plaats het verdoofde dier in de hoofd-holding adapter op een verwarmingskussen onder een twee-foton microscoop, oppassen dat het optische venster en de rechterkant van de schedel zijn loodrecht georiënteerd op de optische as van de microscoop.

Verwerf een eerste referentiekaartafbeelding van het schedelvenster met behulp van heldere veldverlichting bij de viervoudige vergroting. Na het verwerven van meerdere beelden van dezelfde regio van belang, beeld de calcium dynamiek binnen de S1 gebied in de linker hersenhelft en bereken de veranderingen in de fluorescentie van elk gebied van belang aan beide zijden van de schedel. In deze representatieve beelden werden dendrieten en een bloedvat binnen een EGFP-uitdrukkende muis gevisualiseerd op verschillende diepten in laag twee van het S1-gebied een dag na de installatie van het optische venster.

De Z-projectiebeelden werden op dag één en zeven na de optische raamimplantatie vastgelegd, wat een opmerkelijk stabiel aantal en de locatie van dendritische takken en stekels in de experimentele periode illustreert. Meting van de intracellulaire calciumtransiënt in Thy1 GCaMP6s transgene muizen maakt de kwantificering van spontane calciumactiviteit en populaties van laag vijf piramidale neuronen zo diep als groter dan 500 micrometer onder de pia, alsmede de berekening van het gemiddelde aantal spontane reacties in de tijd mogelijk. Een onderzoeker getraind in zowel craniale venster voorbereiding en in vivo twee-foton calcium imaging technieken moeten in staat zijn om opnames van 100 tot 200 neuronen aan beide zijden van de schedel te verkrijgen in een tot twee dieren per dag.

Met een open optisch venster aan elke kant van de schedel, de methode maakt het mogelijk de opname van de neurale activiteit in symmetrische zoogdier hersengebieden voor langdurige en stabiele calcium beeldvorming in vivo. Deze methode kan ook worden gebruikt om corticale activiteit en plasticiteit te bestuderen na eenzijdige schade aan de perifere of het centrale zenuwstelsel. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe bilaterale craniale ramen te installeren voor het meten van calcium dynamiek met behulp van twee-foton microscoop in Thy1 GCaMP6s transgene muizen.