Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

Ons protocol maakt de gelijktijdige beeldvorming van microgliadynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen mogelijk. Het kan op grote schaal worden toegepast om het surveillancegedrag van microglia of de interactie met neuronen te onderzoeken. Het voordeel van deze methode is dat bewegingsartefacten beeldgegevens niet gemakkelijk vervuilen vanwege robuuste hoofdfixatie.

Ook stelt herstel na beeldvorming met de hoge framesnelheid ons in staat om bewegingsartefacten uit de gegevens te verwijderen. Bij deze methode zijn de AAV-injectie en de operatie van craniale raamimplantatie technisch veeleisend. Falen komt vaak voor in het begin, dus raak alsjeblieft niet gefrustreerd en oefen meer.

Om het injectieapparaat voor te bereiden, plaatst u een glazen pipet die via een buis is aangesloten op een 26-gauge Hamilton-spuit op een pipethouder van een stereotaxisch instrument. Kantel vervolgens de pipethouder 60 graden ten opzichte van de verticale as. Vul de glazen pipet, de spuit en de verbindingsbuis met vloeibare paraffine en plaats de spuit op een micro-injector.

Dien analgesie toe aan de verdoofde muis en bevestig de hulpoorbalken. Bevestig vervolgens het dier op het stereotaxische instrument met de dorsale kant naar boven. Na het verwijderen van haar van de operatieplaats en het desinfecteren van het chirurgische gebied, maakt u een twee centimeter lange incisie op de hoofdhuid langs de middellijn, waardoor een goede blootstelling van de schedel boven de rechter primaire visuele cortex wordt gegarandeerd.

Gebruik een tang om het botvlies op de blootgestelde schedel te verwijderen. Boor de schedel op de stereotaxische coördinaten drie millimeter lateraal naar de middellijn en 5 milliliter anterieur naar de lambdalijn om een klein gaatje te maken met een diameter van ongeveer 0,5 millimeter. Plaats vervolgens een stuk transparante film van ongeveer twee centimeter bij twee centimeter op de blootgestelde schedel van de muis.

Verwijder een microliter AAV-oplossingsdruppel op de film met behulp van een pipetter. Breng de spuit voor. Plaats een glazen pipetpunt in de druppel AAV-oplossing op de film en trek voorzichtig aan de spuit om de AAV-oplossing op te zuigen.

Plaats vervolgens de glazen pipet tot een diepte van 500 micrometer van het hersenoppervlak door het gat dat in de schedel is gemaakt. Injecteer vervolgens 0,5 microliter AAV-oplossing met behulp van de micro-injector met een injectievolumedebiet van twee microliter per uur. Trek de naald terug en spoel het hersenoppervlak af met een zoutoplossing.

Maak een cirkelvormige groef langs de markering op de schedel door te boren. Reinig het vuil om de zichtbaarheid van de schedel te garanderen en breng zoutoplossing aan om verhitting tijdens het boren te voorkomen. Druk zachtjes op de centrale schedel met een tang.

De boordiepte is voldoende als deze verticaal beweegt met weinig weerstand. Wanneer de groef voldoende diepte bereikt, steekt u de punt van de tang in de onderkant van het centrale schedelfragment. Til het voorzichtig op en verwijder het om het hersenoppervlak bloot te leggen.

Gebruik een naald van 27 gauge en prik en scheur de dura aan de rand van het blootgestelde hersenoppervlak. Steek de punt van de tang door het gat aan de rand van de dura en pel het af om het hersenoppervlak bloot te leggen. Na het één voor één dispergeren van hemostatische vezels in zoutoplossing, plaatst u de hemostatische vezels langs de randen van het gat waarin de getransecteerde dura aanwezig is.

Plaats het schedelvenster op het blootgestelde hersenoppervlak en hecht het vervolgens aan de schedel met instantlijm terwijl u zachtjes op het venster drukt. Breng daarna direct lijm aan op de hele blootgestelde schedel. Bevestig vervolgens voorzichtig een hoofdplaat op de schedel om het schedelvenster in het midden van het vierkante gat van de hoofdplaat te lokaliseren.

Zodra de lijm voldoende is uitgehard, brengt u tandcement aan op de blootgestelde schedel om de aanhechting tussen het hoofd en het hoofdblad te versterken. Om het op maat gemaakte schaduwapparaat en een LCD-monitor voor visuele stimulatie te installeren, plaatst u eerst de lens om scherp te stellen op het hersenoppervlak en stelt u deze lenspositie vervolgens in als de oorspronkelijke Z-positie. Houd de XY-coördinaten constant en verhoog de objectieflens.

Verwijder de muis en het stereotaxische instrument uit de objectieflens. Bevestig een schaduwapparaat aan de bovenkant van de kopplaat met siliconen en zorg ervoor dat de ruimte tussen de kopplaat en het schaduwapparaat goed is afgesloten. Vul het zonweringsapparaat met gedestilleerd water.

Bevestig vervolgens de muis met het stereotaxische frame onder de objectieflens. Reset zorgvuldig het brandpuntsvlak aan het hersenoppervlak en controleer de diepte van de objectieflens. Bedek de objectieflens met zwarte aluminiumfolie om lichtvervuiling van de LCD-monitor te voorkomen.

Stel een 10-inch LCD-monitor in op 12,5 centimeter voor de ogen van de muis om visuele stimuli te presenteren. Configureer de fluorescerende indieningsverzamelingsfilters voor EGFP en R-CaMP en de excitatiegolflengte tot 1.000 nanometer. Verkrijg afbeeldingen met een ruimtelijke resolutie van 0,25 micron per pixel.

Zoek het beeldvormingsgebied waar R-CaMP-positieve neuronen en EGFP-positieve microglia tegelijkertijd in beeld kunnen worden gebracht. In laag 2, 3. Verkrijg afbeeldingen met een framesnelheid van 30 hertz.

Gelijktijdig met de beeldacquisitie, presenteren drijvende rooster visuele stimuli aan de muis in 12 richtingen op zes oriëntaties, van nul tot 150 graden in stappen van 30 graden. Verwijder na de beeldacquisitie de muis uit het microscoopstadium. Maak het schaduwapparaat en het stereotaxische instrument los van de muis en breng de muis terug naar de thuiskooi.

Met behulp van dit protocol werden AAV-injectie en craniale vensterimplantatie uitgevoerd in de primaire visuele cortex van een acht weken oude transgene muis, gevolgd door twee fotonenbeeldvorming van op R-CaMP gebaseerde neurale activiteit en microgliale dynamiek in laag 2, 3. Raspende visuele stimuli werden aan de muis gepresenteerd en de visuele reacties in de adendritische wervelkolom werden geanalyseerd met behulp van calciumsporen. Microgliale processen vertoonden een snelle dynamiek en veranderden hun morfologie binnen 10 seconden.

Met behulp van beeldvorming van twee fotonen in laag 2, 3 van de primaire visuele cortex in een 12 weken oude transgene muis, werd R-CaMP waargenomen in neuronen, hier gezien in magenta. Een EGFP werd waargenomen in microglia, gezien in het groen. Individuele signalen werden ook waargenomen voor EGFP en R-CaMP.

Succesvolle AAV-injectie is van cruciaal belang voor deze methode. De belangrijkste redenen voor mislukte AAV-injectie zijn de glazen pipetten en de weefselschade. Het surveillancegedrag op microglia en de microglia-interactie van de SNAP zijn geïdentificeerd als gangbaar in verschillende pathogene mechanismen, zoals de ziekte van Alzheimer.

Onze methode is gunstig voor het onderzoek gericht op dit veld.