Name: Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-23T13:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Leer gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen met AAV-injectie en craniaal venster. Deze methode minimaliseert bewegingsartefacten en biedt inzicht in hersendynamica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dr. Masashi Kondo en Dr. Masanori Matsuzaki voor het leveren van virusvectoren. Dit werk werd ondersteund door Grants-in-Aid for Scientific Research (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 to S.O.), het Japan Agency for Medical Research and Development (JP19gm1310003 en JP17gm5010003 to S.O. en JP19dm0207082 to H.M.), het UTokyo Center for Integrative Science of Human Behavior (CiSHuB), het Japan Science and Technology Agency Moonshot R&D (JPMJMS2024 to H.M.), Brain Science Foundation (aan H. M.).

Alle experimenten werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee en de Genetic Recombinant Experiment Safety Committee van Graduate School of Medicine en Faculty of Medicine, de Universiteit van Tokio, en uitgevoerd volgens hun richtlijnen.
1. Voorbereiding
<ol><li>Steriliseer alle instrumenten en apparaten die nodig zijn voor de operatie met behulp van autoclaaf of 70% ethanol.</li>
	<li>Voorbereiding van de glazen pipet.<ol><li>Bevestig een gekalibreerd capillair van 75 μL stevig aan de houder van de micropipettrekker. Stel de trekker in op het programma met de aanbevolen parameters als P (druk) = 500, WARMTE = 680, PULL = 30, VEL = 60, TIJD = 180.</li>
		<li>Na het voltooien van het programma (meestal 4,5 tot 5 s), wordt het capillair verdeeld in twee glazen pipetten met taps toelopende staarten. Breek vervolgens het distale deel van de staarten met een pincet om de tipdiameter binnen 30-50 μm te houden. Breek hiervoor de staarten 1 cm distaal tot het einde van het afgeschuinde deel.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid voor craniotomie een schedelvenster voor door een grotere buitenste glazen schijf met een diameter van 4 mm, een dikte van 0,15 ± 0,02 mm te lijmen op een kleinere binnenste glazen schijf, een diameter van 2 mm, een dikte van 0,525 ± 0,075 mm, met behulp van een UV-lichtuithardingsreagens (figuur 2A).</li>
</ol>2. AAV-injectie
<ol><li>Voorbereiding van injectieapparatuur<ol><li>Plaats een glazen pipet die via een buis is aangesloten op een Hamilton-spuit van 26 G op een pipethouder van een stereotaxisch instrument en kantel de pipethouder vervolgens 60° anterieur vanaf de verticale as (figuur 1A,B).</li>
		<li>Vul de glazen pipet, de spuit en de verbindingsbuis met vloeibare paraffine. Plaats de spuit op een micro-injector.</li>
	</ol></li>
	<li>Chirurgische ingreep OPMERKING: De volgende operatie werd uitgevoerd in een gesteriliseerde cabine. Voor de operatie werd indien nodig een stereomicroscoop gebruikt.<ol><li>Verdoof een mannelijke CX3CR1-EGFP-muis (gedetailleerde informatie in de materiaaltabel) van 7 tot 8 weken oud (lichaamsgewicht 22-26 g) met 3% isofluraan in een gasdichte kamer. Haal na 3 minuten de muis uit de kamer wanneer deze de vrijwillige beweging verliest, behalve de ademhaling, en schakel dan over op continue anesthesie door een neussonde met 2% isofluraan. OPMERKING: Van isofluraan is bekend dat het microglia activeert. Omdat beeldvorming echter 4 weken na de operatie wordt uitgevoerd, is er geen effect van isofluraan op de muizen tijdens de beeldvorming. Hoewel isofluraananesthesie gedurende enkele minuten wordt gebruikt wanneer muizen in het stereotaxische instrument worden geplaatst voordat ze in beeld worden gebracht (stap 4.2.1), vonden we dat het effect van deze korte anesthesie verwaarloosbaar is.</li>
		<li>Houd de muis tijdens de operatie warm met een verwarmingskussen op 37 °C om onderkoeling te voorkomen. Breng oogzalf aan op beide ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen en dien een meloxicam-injectie toe, subcutaan (5 mg / kg). Bevestig de muis aan een hulpoorbalk en bevestig de muis vervolgens op het stereotaxische instrument met de dorsale kant naar boven.</li>
		<li>Pas de isofluraanconcentratie tijdens de operatie aan tot een geschikt percentage (1%-2%) terwijl u de ademhaling en hartslag controleert. Verwijder het haar met ontharingscrème en desinfecteer het hoofd meerdere keren in een cirkelvormige beweging met zowel een scrub op basis van jodium of chloorhexidine als alcohol. Injecteer vervolgens 0,1 ml 1% lidocaïne subcutaan en breng steriele gordijnen aan om de operatieplaats te beveiligen.</li>
		<li>Snijd de hoofdhuid open langs de middellijn met een schaar en maak de incisie ongeveer 2 cm lang, om een goede belichting van de schedel boven de rechter primaire visuele cortex te garanderen. Na de incisie van de hoofdhuid, irrigeer het hoofd met zoutoplossing gedurende de hele procedure om te voorkomen dat de blootgestelde schedel en hersenen uitdrogen.</li>
		<li>Verwijder het botysteum op de blootgestelde schedel met een tang. Boor de schedel op de stereotaxische coördinaten: 3 mm lateraal naar de middellijn, 0,5 mm voorzijde naar de lambdalijn, om een klein gat met ongeveer 0,5 mm diameter te creëren. Spoel indien nodig bloed en weefselresten van de boor af.</li>
		<li>Vul de glazen pipet met 1 μL rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07 volgens de volgende procedure bij een titer van 8,3 x 1012 vectorgenomen/ml22.<ol><li>Laat de spuit 1 μl vloeibare paraffine uit de glazen pipet werpen. Plaats een stuk transparante film, ongeveer 2 cm x 2 cm, op de blootgestelde schedel van de muis en verdrijf een druppel van 1 μL AAV-oplossing op de film met behulp van een pipettor.</li>
			<li>Plaats de punt van de glazen pipet in de druppel AAV-oplossing op de film en trek voorzichtig aan de spuit om de AAV-oplossing op te zuigen. Draai na het uitwerpen aan de T-vormige stopkraan om de druk in de buis en de glazen pipet los te laten.</li>
		</ol></li>
		<li>Steek de glazen pipet tot een diepte van 500 μm van het hersenoppervlak door het gat dat in stap 2.2.5 is gemaakt en injecteer vervolgens 0,5 μl AAV-oplossing met behulp van de micro-injector (figuur 1C). Gebruik het injectievolumedebiet van 2,0 μL/h; een injectie van 0,5 μL duurt 15 minuten en wacht vervolgens 5 minuten.</li>
		<li>Trek na de injectie voorzichtig de glazen pipet terug en spoel het hersenoppervlak af met een zoutoplossing.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Craniale raamimplantatie
OPMERKING: Craniale raamimplantatie volgt op de AAV-injectie op dezelfde dag.
<ol><li>Markeer een cirkel met een diameter van 2,5 mm op de schedel, gecentreerd op 3 mm zijdelings van de lambda. Maak een cirkelvormige groef langs de markering op de schedel door te boren. Reinig het puin omdat dit de zichtbaarheid van de schedel nadelig kan beïnvloeden en breng zoutoplossing aan tijdens het boorproces om opwarming te voorkomen.</li>
	<li>Om te controleren of de boordiepte in de cirkelvormige groef voldoende is om het centrale schedelfragment te verwijderen, drukt u voorzichtig met een tang op de centrale schedel. Als het verticaal beweegt met weinig weerstand, is de boordiepte voldoende.</li>
	<li>Wanneer de groef voldoende diep is, steekt u de punt van de tang in de onderkant van het centrale schedelfragment en tilt u deze voorzichtig op en verwijdert u deze om het hersenoppervlak bloot te leggen (figuur 1D).</li>
	<li>Gebruik een naald van 27 G om de dura aan de rand van het blootgestelde hersenoppervlak te prikken en te scheuren. Steek de punt van de tang door het gat aan de rand van de dura. Houd de dura vast en pel deze af om het hersenoppervlak bloot te leggen. OPMERKING: Als er een bloeding optreedt, spoel dan het hersenoppervlak met een zoutoplossing totdat het bloeden stopt.</li>
	<li>Dispergeer met behulp van een tang hemostatische vezels één voor één in zoutoplossing in een schaal van 3,5 mm en plaats vervolgens de hemostatische vezels langs de randen van het gat waarin de doorgesneden dura aanwezig is.</li>
	<li>Plaats een schedelvenster dat is voorbereid in stap 1.3 op het blootgestelde hersenoppervlak en hecht het vervolgens aan de schedel met onmiddellijke lijm terwijl u zachtjes op het venster drukt zodat het venster in nauw contact staat met de schedel.</li>
	<li>Breng daarna direct lijm aan op de hele blootgestelde schedel en bevestig vervolgens voorzichtig een hoofdplaat op de schedel, zodat het venster zich in het midden van het vierkante gat van de hoofdplaat bevindt (figuur 2C). Zorg ervoor dat het oppervlak van de kopplaat evenwijdig is aan het oppervlak van het glazen raam.</li>
	<li>Nadat de lijm voldoende is uitgehard, brengt u tandcement aan op de blootgestelde schedel om de aanhechting tussen het hoofd en de hoofdplaat te versterken (figuur 2). OPMERKING: Als de experimenten de presentatie van visuele stimuli aan muizen omvatten, moet strooilicht naar het beeldvormingsgebied worden vermeden. Het is raadzaam om het cement zwart te maken door het te mengen met de actieve kool voor de vermindering van lichtreflectie.</li>
	<li>Trek de muis uit de anesthesie nadat het cement voldoende is uitgehard (ongeveer 20 minuten). Plaats de muis vervolgens in een nieuwe kooi om alleen te herstellen.</li>
	<li>Na bevestiging van zijn bewustzijn en vrijwillige beweging, wat wijst op volledig herstel, plaats je de muis terug in de thuiskooi. Dien tijdens het herstel een tweede, of meer indien nodig, meloxicam-dosis toe (eenmaal per 24 uur gedurende 1-3 dagen) als duidelijk pijnaangevend gedrag optreedt.</li>
</ol>4. In vivo beeldvorming van twee fotonen van microglia en neuronale calciumdynamica
<ol><li>Gewenning van muizen aan het microscoopapparaat<ol><li>Drie weken na de operatie induceert u anesthesie bij de muis met 3% isofluraan en plaatst u de muis onder de 25x objectieve lens van een microscoop met twee fotonen met behulp van een op maat gemaakt stereotaxisch instrument (figuur 3C). Voor de opstelling hier wordt de muis op de bovenkant van een loopband geplaatst en mag hij vrij lopen.</li>
		<li>Verwijder ongeveer 10 minuten later de muis uit het microscoopstadium en breng deze terug naar de thuiskooi. Herhaal de gewenning minstens 3 keer om de andere dag voordat u twee fotonen beeldacquisitie.</li>
	</ol></li>
	<li>Beeldacquisitie met twee fotonen OPMERKING: We raden aan om de beeldacquisitie meer dan 4 weken na de operatie uit te voeren, omdat microgliale activering geleidelijk terugkeert naar het basale niveau.<ol><li>Induceer net als in stap 4.1 anesthesie in de muis met 3% isofluraan en plaats de muis onder de objectieflens van de tweefotonenmicroscoop met behulp van een op maat gemaakt stereotaxisch instrument.</li>
		<li>Installeer het op maat gemaakte zonweringsapparaat en een LCD-monitor voor visuele stimulatie zoals hieronder beschreven (figuur 3D).<ol><li>Plaats de lens om scherp te stellen op het hersenoppervlak en stel deze lenspositie vervolgens in als de oorspronkelijke Z-positie. Houd de x-y-coördinaten constant en verhef de objectieflens; Verwijder de muis en het stereotaxische instrument uit de objectieflens en loopband.</li>
			<li>Bevestig een schaduwapparaat aan de bovenkant van de kopplaat met siliconen, dat zwart wordt gemaakt door te mengen met houtskoolpoeder, en zorg ervoor dat de ruimte tussen de kopplaat en het schaduwapparaat goed is afgesloten.</li>
			<li>Vul het schaduwapparaat met gedestilleerd water en bevestig vervolgens de muis en het stereotaxische frame opnieuw onder het objectief en op de loopband. Reset zorgvuldig het brandpuntsvlak aan het hersenoppervlak en controleer de diepte van de objectieflens. OPMERKING: Om het risico van beschadiging van de objectieflens te voorkomen, stelt u eerst de xyz-coördinaten in en past u vervolgens de schaduwinrichting van de objectieflens toe. Het is ook redelijk om eerst de afdekking te installeren en vervolgens de coördinaten aan te passen, maar voorzichtige behandeling is noodzakelijk voor deze optie.</li>
			<li>Bedek de objectieflens met zwarte aluminiumfolie om lichtvervuiling te voorkomen van de LCD-monitor die wordt gebruikt voor visuele stimulatie door de objectieflens (figuur 3D). Stel een 10-inch LCD-monitor in op 12,5 cm voor de ogen van de muis om visuele stimuli te presenteren (figuur 3D).</li>
		</ol></li>
		<li>Configureer de fluorescentie-emissieopvangfilters naar EGFP-fluorescentie (525/50 nm-emissiefilter) en R-CaMP-fluorescentie (593/46 nm-emissiefilter) en de excitatiegolflengte tot 1.000 nm. Verkrijg beelden met een ruimtelijke resolutie van 0,25 μm/pixel met behulp van een 25x 1,1 NA-objectief en GaAsP PMT's.</li>
		<li>Zoek het beeldvormingsgebied waarin R-CaMP(+)-neuronen en EGFP(+)-microglia gelijktijdig kunnen worden afgebeeld in laag 2/3. Voor deze opstelling bevonden de gegevens verkregen in figuur 4 en video 1 zich op een diepte van 100 μm van het piale oppervlak, met behulp van een live beeldvoorbeeld. Houd het vermogen van de excitatielaser zo laag mogelijk om fotobleken en schade veroorzaakt door verhoogde lokale temperatuur in het beeldgebied te voorkomen.</li>
		<li>Verkrijg beelden met een framesnelheid van 30 Hz. Presenteer gelijktijdig met de beeldacquisitie een drijvend-roosterende visuele stimuli bij 100% contrast, 1,5 Hz, 0,04 cycli per graad in 12 richtingen in 6 oriëntaties van 0 ° tot 150 ° in stappen van 30 ° naar de muis17.</li>
		<li>Verwijder na de beeldacquisitie de muis uit het microscoopstadium, maak het schaduwapparaat en het stereotaxische instrument los van de muis en breng de muis terug naar zijn thuiskooi.</li>
	</ol></li>
	<li>Gegevensregistratie<ol><li>Converteer en sla de verkregen beeldgegevens (nd2-formaat in dit geval) op als een reeks tiff-afbeeldingsbestanden voor elk kleurkanaal, met behulp van Fiji of de software die bij de microscoop wordt geleverd.</li>
		<li>Pas Turboreg toe, een plug-in van Fiji, om registratie uit te voeren met mode = vertaling. Gebruik de gemiddelde afbeelding als referentieafbeelding met de tiff-afbeeldingsbestanden van het EGFP-kanaal.</li>
		<li>Voer de volgende verwerking uit voor elk frame met MATLAB. OPMERKING: Hoewel MATLAB wordt gebruikt in de volgende verwerking, richt de beschrijving zich voornamelijk op de intentie van elke stap, zodat gegevens kunnen worden geanalyseerd door andere programmeersoftware zoals Python.<ol><li>Gebruik de imread-functie om respectievelijk twee EGFP tiff-afbeeldingen voor en na registratie van hetzelfde frame te lezen. Gebruik de imread-functie om de R-CaMP tiff-afbeelding van hetzelfde frame te lezen.</li>
			<li>Gebruik de functie normcorr2 om de correlatiefunctie te berekenen tussen de gevectoriseerde variabelen van de twee GFP-afbeeldingen die in stap 4.3.3.1 zijn gelezen.</li>
			<li>Gebruik de functie max om de lineaire index met de hoogste kruiscorrelatie van de correlatiefunctie te detecteren en gebruik vervolgens de functie ind2sub om de bewegingspositie van de geregistreerde afbeelding te berekenen op basis van de oorspronkelijke afbeelding.</li>
			<li>Gebruik de imwarp-functie om de R-CaMP-afbeelding te vertalen naar de positie die is berekend in stap 4.3.3.3 en gebruik vervolgens de imwrite-functie om de geregistreerde afbeelding van R-CaMP op te slaan.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Aanmaak van calciumsporen<ol><li>Voer de volgende verwerking uit met MATLAB. Gebruik de imread-functie om alle geregistreerde R-CaMP tiff-afbeeldingen te lezen die in stap 4.3.3.4 zijn gegenereerd. Als de geregistreerde afbeeldingen al als variabele in de werkruimte zijn geladen, laat u deze stap weg.</li>
		<li>Gebruik de functie gemiddelde om een tijdprojectiebeeld te genereren. Gebruik de imshow-functie om de gemiddelde afbeelding als een figuur weer te geven; gebruik de Roipoly-functie om een binair ROI-masker van de doelstructuur te genereren (dendritische wervelkolom in deze gegevens).</li>
		<li>Gebruik de gemiddelde functie met de afbeeldingen die worden verkregen door het binaire masker te vermenigvuldigen met afbeeldingen van elk frame als invoervariabelen, en bereken de gemiddelde fluorescentie-intensiteit binnen de ROI voor elk frame.</li>
		<li>Zoals eerder beschreven17, past u op de in stap 4.4.3 verkregen variabele het boterfrequentiefilter toe bij afsnijding = 1,6 s voor het snijden van hoogfrequent geluid en past u vervolgens het glijdende middenfilter toe op het tijdvenster = 200 s, voor het snijden van laagfrequent geluid.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Andoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+reverses+behavioral+and+synaptic+abnormalities+after+maternal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Exercise reverses behavioral and synaptic abnormalities after maternal inflammation.</a> Cell Reports. 27 (10), 2817-2825 (2019).</li>
<li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neuropathic+pain%3A+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).</li>
<li>Clasadonte, J., Scemes, E., Wang, Z., Boison, D., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+43-mediates+astroglial+metabolic+networks+contribute+to+the+regulation+of+the+sleep-wake+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Connexin 43-mediates astroglial metabolic networks contribute to the regulation of the sleep-wake cycle.</a> Neuron. 95 (6), 1365-1380 (2017).</li>
<li>Taylor, A. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+disrupt+mesolimbic+reward+circuitry+in+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia disrupt mesolimbic reward circuitry in chronic pain.</a> Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).</li>
<li>Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+changes+of+spine+dynamics+and+microglia+after+transient+peripheral+immune+response+triggered+by+LPS+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo.</a> Molecular Brain. 4, 27(2011).</li>
<li>Wu, Y., Dissing-Olsen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+Dynamic+mediators+of+synapse+development+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia: Dynamic mediators of synapse development and plasticity.</a> Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).</li>
<li>Andoh, M., Koyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+regulate+synaptic+development+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Microglia regulate synaptic development and plasticity.</a> Developmental Neurobiology. 81 (5), 568-590 (2020).</li>
<li>Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+impact+of+microglial+distribution+on+dynamics+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines.</a> European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).</li>
<li>Nakayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+permit+climbing+fiber+elimination+by+promoting+GABAergic+inhibition+in+the+developing+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum.</a> Nature Communications. 9 (1), 2830(2018).</li>
<li>Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglia+directly+monitor+the+functional+state+of+synapses+in+vivo+and+determine+the+fate+of+ischemic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals.</a> Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).</li>
<li>Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+interactions+with+synapses+are+modulated+by+visual+experience%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), 10000527(2010).</li>
<li>Liu, Y. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+network+activity+controls+microglial+process+surveillance+in+awake+mice+via+norepinephrine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).</li>
<li>Kim, T. H., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+large-scale+neural+ensemble+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of large-scale neural ensemble dynamics.</a> Cell. 185 (1), 9-41 (2022).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
<li>Isshiki, M., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cranial+window+types+for+in+vivo+two-photon+imaging+of+brain+microstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures.</a> Microscopy (Oxf). 63 (1), 53-63 (2014).</li>
<li>Ohtsuki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarity+of+visual+selectivity+among+clonally+related+neurons+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Similarity of visual selectivity among clonally related neurons in visual cortex.</a> Neuron. 75 (1), 65-72 (2012).</li>
<li>Maruoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+system+of+functionally+distinct+cell+types+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex.</a> Science. 358 (6363), 610-615 (2017).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Bernier, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+surveillance+of+the+brain+by+microglia+via+cAMP-regulated+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nanoscale surveillance of the brain by microglia via cAMP-regulated filopodia.</a> Cell Reports. 27 (10), 2895(2019).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+of+anesthesia-specific+alterations+in+microglial+surveillance+and+photodamage-directed+motility+in+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 421(2019).</li>
<li>Merlini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+Gi-dependent+dynamics+regulate+brain+network+hyperexcitability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability.</a> Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).</li>
<li>Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+hippocampus+without+cortical+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion.</a> eLife. 6, 26839(2017).</li>
<li>Badimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+feedback+control+of+neuronal+activity+by+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Negative feedback control of neuronal activity by microglia.</a> Nature. 586 (7829), 417-423 (2020).</li>
<li>Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting neural circuits.</a> Cell. 165 (3), 524-534 (2016).</li>
<li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DREADDs+for+Neuroscientists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We beschrijven het protocol van AAV-injectie en craniotomie voor gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen, evenals gegevensverwerking. Deze techniek kan de coördinatie blootleggen tussen microgliale dynamiek en neuronale activiteit op tijdschalen variërend van minder dan een seconde tot tientallen seconden.
Het operatieprotocol omvat verschillende technisch veeleisende stappen. AAV-injectie is een van de kritieke stappen. Mislukte AAV-injectie kan een significante vermindering van de expressie van R-CaMP veroorzaken. Er zijn twee belangrijke redenen: verstopte glazen pipetten en weefselschade. De verstopping van glazen pipetten vermindert of blokkeert de uitwerping van AAV-oplossing volledig. Deze situatie kan worden vermeden door de AAV-oplossing te kleuren met een kleurstof zoals snel groen en het succes van de injectie visueel te bevestigen. Weefselschade veroorzaakt door AAV-injectie voorkomt exogene genexpressie in de buurt van het midden van de injectieplaats. De schade veroorzaakt door AAV-injectie wordt waarschijnlijk veroorzaakt door een plotselinge toename van de efflux van de punt van de glazen pipet na de accumulatie van de druk in de pipet. Daarom moet de uitstroom van AAV-oplossing uit de glazen pipet constant zijn tijdens de injectie. Het selecteren van glazen pipetten met een iets bredere diameter aan hun uiteinden zou dit probleem oplossen. Bij craniale raamimplantatie is de snelheid van de operatie van cruciaal belang. Als de operatie te lang duurt, kan het hersenweefsel ernstig beschadigd raken. Dienovereenkomstig is herhaalde oefening noodzakelijk om de snelheid en soepelheid van de operatie te garanderen. Bovendien kan gedurende de 4 weken tussen operatie en beeldvorming de kwaliteit van de beeldvorming worden verminderd door weefselregeneratie tussen het schedelvenster en het hersenweefsel volgens de conventionele methode17. De methode hier overwint dit probleem door een dikke bril aan te brengen voor de binnenste glazen schijf van de schedelvensters om weefselregeneratie te remmen en het venster vrij te houden. In het hier beschreven systeem was dit effect duidelijk door gebruik te maken van een binnenste glazen schijf met een dikte van 0,525 ± 0,075 μm.
De methode kan met succes worden toegepast op muizen ouder dan 4 weken, maar de toepassing op jongere muizen kan problematisch zijn. Bij jonge muizen vertoont de schedel een snelle en prominente groei, wat een mismatch veroorzaakt tussen het schedelbot en het glazen venster.
In sommige geavanceerde studies werd in vivo beeldvorming van twee fotonen gebruikt om microglia-neuroninteracties te bestuderen 12,21,23. Vooral in het pionierswerk van Merlini et al. voerden ze gelijktijdige in vivo beeldvorming uit van microgliale dynamiek en neurale activiteit in de cellichamen21. In deze methode, door dikkere binnenglazen te gebruiken voor schedelvensters, konden we bewegingsartefacten in de diepteoriëntatie onderdrukken en de stabiele meting van neuronale activiteit in microstructuren, zoals dendritische stekels, bereiken. Deze methode zou helpen bij het onderzoeken van synaps-microgliale procesinteracties bij wakkere muizen.
Onlangs toonde in vitro onderzoek aan dat dunne filopodia-achtige microgliale processen een snellere beweeglijkheid hebben dan dikke processen, wat het belang van hun snellere beweeglijkheid in surveillancesuggereert 19. Het systeem hier kan de beweeglijkheid van dunne microgliale processen volgen met een temporele resolutie van een subseconde tot enkele tientallen seconden. Deze eigenschap helpt de functionele betekenis van hun beweeglijkheid voor surveillance in vivo te verduidelijken.
In de toekomst zou de combinatie van deze beeldvormingstechniek met interventies, zoals optogenetica24 of chemogenetica25, toegepast op lokale neurale circuits of interregionale neurale verbindingen licht werpen op nieuwe microgliale functies in synaptische ontwikkeling en plasticiteit die kenmerken van neurale circuits vormen. Ook zou verdere integratie van beeldvorming, interventie en gedragstaken bijdragen aan het onthullen van de coördinatie van microglia en neuronen die ten grondslag liggen aan specifiek gedrag.

Er is steeds meer bewijs dat de interne toestand van het lichaam voortdurend de hersenfuncties bij dieren beïnvloedt 1,2,3,4,5. Om een beter inzicht te krijgen in hersenfuncties, is het daarom cruciaal om op te helderen hoe gliacellen in de hersenen de biologische omstandigheden in de periferie bewaken en de informatie doorgeven aan neuronen.
Microglia, immuuncellen in de hersenen, zijn betrokken bij synaptische ontwikkeling en plasticiteit, die kenmerken van neurale circuits in de hersenen vormen 6,7,8,9. Het pionierswerk van Wake et al. toonde bijvoorbeeld aan dat microgliale processen contact maken met synapsen op een neuronale activiteitsafhankelijke manier in de neocortex van de muis en dat kunstmatige ischemie synapsverlies induceert na langdurig contact met microglia10. Tremblay et al. vonden dat verandering van visuele ervaring de modaliteit van microgliale interactie met synapsen verandert. Tijdens de kritieke periode waarin de dendritische wervelkolomomzet in de primaire visuele cortex (V1) wordt verhoogd door binoculaire deprivatie, vermindert donkere aanpassing de beweeglijkheid van microgliale processen en verhoogt zowel hun contactfrequentie met synaptische spleten als het aantal cellulaire insluitsels in microglia11. Deze resultaten suggereren dat microgliale processen neurale activiteit en hun omgeving detecteren om neurale circuits te hermodelleren. Bovendien meldde een recente studie dat microgliale surveillance verschilt tussen wakkere en verdoofde omstandigheden, wat het belang suggereert van experimenten met wakkere muizen voor het onderzoeken van neuron-microglia-communicatie onder fysiologische omstandigheden12.
In vivo twee-foton calciumbeeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor de registratie van calciumdynamiek, die voortdurende neuronale vuren weerspiegelt, in honderden neuronen tegelijkertijd in een levend dier13,14,15. Calciumbeeldvorming in neuronen vereist over het algemeen een temporele resolutie van meer dan een paar Hz om snelle neuronale reacties te volgen16,17. Daarentegen hebben eerdere studies die de microgliale dynamiek volgden, microgliale structuren bemonsterd met een relatief lage temporele resolutie van minder dan 0,1 Hz18,19,20. Een recente studie paste gelijktijdige beeldvorming van twee fotonen toe om de communicatie tussen neuronen en microgliate begrijpen 21. Het is echter nog steeds onduidelijk hoe dynamische microgliale processen reageren op de omringende neurale activiteit met een temporele resolutie van meer dan een paar Hz bij wakkere muizen. Om dit probleem aan te pakken, beschrijven we een gelijktijdige in vivo twee-foton beeldvormingsmethode van neurale activiteit en microgliale dynamica met een temporele resolutie hoger dan 1 Hz bij wakkere muizen. Deze methode stelt ons in staat om stabiele beeldvorming te bereiken bij wakkere muizen met een hogere framesnelheid (maximaal 30 Hz met de pixelframegrootte van 512 x 512 pixels) en biedt een gunstigere manier om het surveillancegedrag van microglia of hun interactie met neuronale activiteit bij wakkere muizen te onderzoeken.

<table><tbody><tr><td>10-inch LCD-monitor</td><td>EIZO</td><td>DuraVision FDX1003</td><td>Voor het presenteren van rastervisuele stimuli</td></tr><tr><td>26G Hamilton-sering</td><td>Hamilton</td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>27G-naald</td><td>Terumo</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>AAV-hSyn-R-CAMP1.07</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Vriendelijk geschonken door het laboratorium van Prof. Matsuzaki&nbsp;</td></tr><tr><td>Geactiveerde houtskoolpoeder</td><td>Nacalai tesque</td><td>07909-65</td><td></td></tr><tr><td>Zwarte aluminiumfolie</td><td>THORLABS</td><td>BKF12</td><td></td></tr><tr><td>CX3CR1-EGFP-muis</td><td>Jackson laboratory</td><td>IMSR_JAX: 005582</td><td>CX3CR-1EGFP/+ knock-in/knock-out muizen die EGFP in microglia in de hersenen tot expressie brengen onder controle van het endogene Cx3cr1 -locus.</td></tr><tr><td>DENT SILICONE-V</td><td>Shofu Inc</td><td>N/A</td><td>Voor het bevestigen van een schaduwapparaat aan een hoofdplaat</td></tr><tr><td>Tandcement (snelle hars, vloeistof)</td><td>Shofu Inc</td><td>N/A</td><td>AB</td></tr><tr><td>Tandcement (snelle hars, poeder)</td><td>Shofu Inc</td><td>N/A</td><td>B Kleur 3</td></tr><tr><td>Boor</td><td>Toyo Associates</td><td>HP-200</td><td></td></tr><tr><td>Glazen capillaire pipette</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>2-000-075</td><td></td></tr><tr><td>Glazen schijf (groot)</td><td>Matsunami</td><td>N/A</td><td>4 mm in diameter, 0,15&plusmn;0,02 mm dik</td></tr><tr><td>Glazen schijf (klein)</td><td>Matsunami</td><td>N/A</td><td>2 mm in diameter, 0,525&plusmn;0,075 mm dik</td></tr><tr><td>Hoofdplaat</td><td>Aangepast</td><td>N/A</td><td>Materiaal: SUS304, dikte: 0,5 mm, zie Figuur 2B voor de vorm</td></tr><tr><td>Hemostatische vezel</td><td>Davol Inc</td><td>1010090</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Fiji-software</td><td></td><td>Gratis software</td><td>Voor gegevensregistratie</td></tr><tr><td>Onmiddellijke lijm (Aron alpha)</td><td>Daiichi Sankyo</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Pfizer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>Astrazeneca</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 2017b</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>Voor gegevensregistratie en -verwerking</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>M1959</td><td></td></tr><tr><td>Micro-injector</td><td>KD Scientific</td><td>KDS-100</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetpuller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Multi-foton excitatiemicroscoop</td><td>NIKON</td><td>N/A</td><td>De commerciële naam is "A1MP+".</td></tr><tr><td>Objectieflens</td><td>NIKON</td><td>N/A</td><td>De commerciële naam is "CFI75 apochromat 25xC W".</td></tr><tr><td>Paraffine vloeistof</td><td>Nacalai tesque</td><td>26132-35</td><td></td></tr><tr><td>Psychtoolbox</td><td></td><td>Gratis software</td><td>Voor het presenteren van rastervisuele stimuli</td></tr><tr><td>Schaduwapparaat</td><td>Aangepast</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>Stereotactisch instrument</td><td>Narishige Scientific Instrument</td><td>SR-611</td><td>Voor de operatie</td></tr><tr><td>Stereotactisch instrument</td><td>Aangepast</td><td>N/A</td><td>Voor het fixeren van muizen onder de tweefoton-microscoop</td></tr><tr><td>Stopcock</td><td>ISIS</td><td>VXB1079</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisch zijde</td><td>Ethicon</td><td>K881H</td><td></td></tr><tr><td>Loopband</td><td>Aangepast</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>UV-licht uitharder</td><td>Norland Products Inc</td><td>NOA 65</td><td></td></tr><tr><td>Verdamper</td><td>Penlon</td><td>Sigma Delta</td><td>Anesthesietoestel</td></tr></tbody></table>

gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Omdat hersenfuncties onder de voortdurende invloed staan van de signalen die zijn afgeleid van perifere weefsels, is het van cruciaal belang om op te helderen hoe gliacellen in de hersenen verschillende biologische omstandigheden in de periferie waarnemen en de signalen doorgeven aan neuronen. Microglia, immuuncellen in de hersenen, zijn betrokken bij synaptische ontwikkeling en plasticiteit. Daarom moet de bijdrage van microglia aan de constructie van neurale circuits als reactie op de interne toestand van het lichaam kritisch worden getest door intravitale beeldvorming van de relatie tussen microgliale dynamiek en neuronale activiteit.
Hier beschrijven we een techniek voor de gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen. Adeno-geassocieerd virus dat codeert voor R-CaMP, een gen-gecodeerde calciumindicator van rood fluorescentie-eiwit, werd geïnjecteerd in laag 2/3 van de primaire visuele cortex in CX3CR1-EGFP transgene muizen die EGFP tot expressie brengen in microglia. Na virale injectie werd een schedelvenster geïnstalleerd op het hersenoppervlak van het geïnjecteerde gebied. In vivo beeldvorming van twee fotonen bij wakkere muizen 4 weken na de operatie toonde aan dat neurale activiteit en microgliale dynamiek tegelijkertijd konden worden geregistreerd bij de temporele resolutie van minder dan een seconde. Deze techniek kan de coördinatie tussen microgliale dynamiek en neuronale activiteit blootleggen, waarbij de eerste reageert op perifere immunologische toestanden en de laatste codeert voor de interne hersentoestanden.

We voerden de AAV-injectie en craniale raamimplantatie uit in V1 van een 8 weken oude CX3XR1-EGFP transgene muis zoals beschreven in dit protocol. Vier weken na de operatie voerden we gelijktijdige in vivo twee-foton beeldvorming uit van R-CaMP-gebaseerde neurale activiteit en microgliale dynamica in laag 2/3 van V1 (figuur 4 en video 1). Tijdens de beeldvorming werd de muis op een loopband geplaatst en vrij laten lopen. Beelden werden verkregen met een framesnelheid van 30 Hz met een ruimtelijke resolutie van 0,25 μm/pixel met behulp van een 25x, 1,1 NA-objectief en GaAsP PMT's. Zowel EGFP als R-CaMP werden geëxciteerd bij een golflengte van 1.000 nm, en EGFP-fluorescentie (525/50 nm-emissiefilter) en R-CaMP-fluorescentie (593/46 nm-emissiefilter) werden tegelijkertijd verzameld. Na de registratie van de verkregen gegevens om bewegingsartefacten te minimaliseren, werden alle vier frames gemiddeld in één frame om achtergrondruis te verminderen. Raspende visuele stimuli werden aan de muis gepresenteerd en de visuele reacties van neuronen en individuele dendritische stekels werden geanalyseerd (figuur 4D). Microgliale processen vertoonden een snelle dynamiek en veranderden hun morfologie binnen 10 s (figuur 4E en video 1). Zoals beschreven in de sectie Discussie, kon de expressie van R-CaMP niet worden gedetecteerd toen de AAV-injectie mislukte. Als de operatie niet succesvol was, konden de signalen van EGFP en R-CaMP niet worden waargenomen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64111/64111fig01.jpg"> Figuur 1: AAV-injectie . (A) Een glazen pipet werd met behulp van een siliconenbuis verbonden met een Hamilton-spuit van 26 G. (B) De opstelling voor AAV-injectie. (C) AAV-oplossing werd geïnjecteerd via de glazen pipet die 60° anterieur van de verticale as was gekanteld. (D) Schematisch schema van de procedure van open schedel (beschreven in stap 3.3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64111/64111fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64111/64111fig02v2.jpg"> Figuur 2: Schedelraam en hoofdplaat . (A) Schematisch diagram van craniale raamimplantatie. (B) Er werden op maat gemaakte kopplaten gebruikt. Voor beeldvorming in de rechterhersenhelft moet de kortere arm aan de rechterkant worden gebruikt. (C) Dorsale weergave van een muis met een schedelvenster en een geïmplanteerde hoofdplaat. (D) Hoge vergrotingsweergave van het schedelvenster weergegeven in figuur 2C. (E) Dorsale weergave van een muis die is bevestigd met het op maat gemaakte stereotaxische instrument. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64111/64111fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64111/64111fig03.jpg"> Figuur 3: De opstelling voor in vivo beeldvorming met twee fotonen. (A) Dorsale weergave van de zonwering. (B) Zijaanzicht van de zonwering. (C) Weergave van een muis met de arceringsinrichting op de kopplaat onder de objectieflens. De muis wordt op de loopband geplaatst. (D) Bekijken onder de twee-foton excitatie microscoop. Een monitor met visuele prikkels is aan de rechterkant van de figuur geplaatst. De objectieflens is bedekt met het schaduwapparaat en zwarte aluminiumfolie om licht van de monitor naar de objectieflens te voorkomen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64111/64111fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64111/64111fig04.jpg"> Figuur 4: Microgliale dynamica en visuele responsen in een dendritische wervelkolom. (A-C) Tijdgemiddelde beelden van EGFP(+) microglia en R-CaMP(+) neuronen in laag 2/3 van V1 in een 12 weken oude CX3XR1-EGFP transgene muis. De signaalintensiteit in elk kanaal werd onafhankelijk genormaliseerd. (D) Visuele reacties in een dendritische wervelkolom. Streepdiagrammen met zwarte pijlen geven de richting van de roosterprikkels aan die worden gepresenteerd in de timing die wordt aangegeven door grijze kolommen. In calciumsporen geven grijze lijnen individuele reacties aan en een zwarte lijn geeft hun gemiddelde aan. In de rechter inzet geeft een gele pijlpunt de dendritische wervelkolom aan waarin het interessegebied (ROI) werd gegenereerd om de calciumsporen te verkrijgen. (E) Microgliale processus (cyaan pijlpunt) vertoonde snelle terugtrekking in 10 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64111/64111fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Video 1: Twee-foton beeldvorming van neuronale activiteit en microgliale dynamiek. Beeldvormingsgegevens van EGFP(+) microglia en R-CaMP(+) neuronen in laag 2/3 van V1 in een 12 weken oude CX3XR1-EGFP transgene muis. Aan de linkerkant van de film geeft magenta R-CaMP aan in neuronen en groen geeft EGFP aan in microglia. Het midden van de film komt overeen met het EGFP-signaal en de rechterkant komt overeen met het R-CaMP-signaal. De signaalintensiteit in elk kanaal werd onafhankelijk genormaliseerd. De framesnelheid van de film is 40 keer sneller dan de werkelijke snelheid. Schaalbalk = 10 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64111/220330CatMovieForJoVE_IntNormalized-2.mp4" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>

Hier beschrijven we een protocol dat adeno-geassocieerde virusinjectie combineert met craniale raamimplantatie voor gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen.

Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Ons protocol maakt de gelijktijdige beeldvorming van microgliadynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen mogelijk. Het kan op grote schaal worden toegepast om het surveillancegedrag van microglia of de interactie met neuronen te onderzoeken. Het voordeel van deze methode is dat bewegingsartefacten beeldgegevens niet gemakkelijk vervuilen vanwege robuuste hoofdfixatie.Ook stelt herstel na beeldvorming met de hoge framesnelheid ons in staat om bewegingsartefacten uit de gegevens te verwijderen. Bij deze methode zijn de AAV-injectie en de operatie van craniale raamimplantatie technisch veeleisend. Falen komt vaak voor in het begin, dus raak alsjeblieft niet gefrustreerd en oefen meer.Om het injectieapparaat voor te bereiden, plaatst u een glazen pipet die via een buis is aangesloten op een 26-gauge Hamilton-spuit op een pipethouder van een stereotaxisch instrument. Kantel vervolgens de pipethouder 60 graden ten opzichte van de verticale as. Vul de glazen pipet, de spuit en de verbindingsbuis met vloeibare paraffine en plaats de spuit op een micro-injector.Dien analgesie toe aan de verdoofde muis en bevestig de hulpoorbalken. Bevestig vervolgens het dier op het stereotaxische instrument met de dorsale kant naar boven. Na het verwijderen van haar van de operatieplaats en het desinfecteren van het chirurgische gebied, maakt u een twee centimeter lange incisie op de hoofdhuid langs de middellijn, waardoor een goede blootstelling van de schedel boven de rechter primaire visuele cortex wordt gegarandeerd.Gebruik een tang om het botvlies op de blootgestelde schedel te verwijderen. Boor de schedel op de stereotaxische coördinaten drie millimeter lateraal naar de middellijn en 5 milliliter anterieur naar de lambdalijn om een klein gaatje te maken met een diameter van ongeveer 0,5 millimeter. Plaats vervolgens een stuk transparante film van ongeveer twee centimeter bij twee centimeter op de blootgestelde schedel van de muis.Verwijder een microliter AAV-oplossingsdruppel op de film met behulp van een pipetter. Breng de spuit voor. Plaats een glazen pipetpunt in de druppel AAV-oplossing op de film en trek voorzichtig aan de spuit om de AAV-oplossing op te zuigen.Plaats vervolgens de glazen pipet tot een diepte van 500 micrometer van het hersenoppervlak door het gat dat in de schedel is gemaakt. Injecteer vervolgens 0,5 microliter AAV-oplossing met behulp van de micro-injector met een injectievolumedebiet van twee microliter per uur. Trek de naald terug en spoel het hersenoppervlak af met een zoutoplossing.Maak een cirkelvormige groef langs de markering op de schedel door te boren. Reinig het vuil om de zichtbaarheid van de schedel te garanderen en breng zoutoplossing aan om verhitting tijdens het boren te voorkomen. Druk zachtjes op de centrale schedel met een tang.De boordiepte is voldoende als deze verticaal beweegt met weinig weerstand. Wanneer de groef voldoende diepte bereikt, steekt u de punt van de tang in de onderkant van het centrale schedelfragment. Til het voorzichtig op en verwijder het om het hersenoppervlak bloot te leggen.Gebruik een naald van 27 gauge en prik en scheur de dura aan de rand van het blootgestelde hersenoppervlak. Steek de punt van de tang door het gat aan de rand van de dura en pel het af om het hersenoppervlak bloot te leggen. Na het één voor één dispergeren van hemostatische vezels in zoutoplossing, plaatst u de hemostatische vezels langs de randen van het gat waarin de getransecteerde dura aanwezig is.Plaats het schedelvenster op het blootgestelde hersenoppervlak en hecht het vervolgens aan de schedel met instantlijm terwijl u zachtjes op het venster drukt. Breng daarna direct lijm aan op de hele blootgestelde schedel. Bevestig vervolgens voorzichtig een hoofdplaat op de schedel om het schedelvenster in het midden van het vierkante gat van de hoofdplaat te lokaliseren.Zodra de lijm voldoende is uitgehard, brengt u tandcement aan op de blootgestelde schedel om de aanhechting tussen het hoofd en het hoofdblad te versterken. Om het op maat gemaakte schaduwapparaat en een LCD-monitor voor visuele stimulatie te installeren, plaatst u eerst de lens om scherp te stellen op het hersenoppervlak en stelt u deze lenspositie vervolgens in als de oorspronkelijke Z-positie. Houd de XY-coördinaten constant en verhoog de objectieflens.Verwijder de muis en het stereotaxische instrument uit de objectieflens. Bevestig een schaduwapparaat aan de bovenkant van de kopplaat met siliconen en zorg ervoor dat de ruimte tussen de kopplaat en het schaduwapparaat goed is afgesloten. Vul het zonweringsapparaat met gedestilleerd water.Bevestig vervolgens de muis met het stereotaxische frame onder de objectieflens. Reset zorgvuldig het brandpuntsvlak aan het hersenoppervlak en controleer de diepte van de objectieflens. Bedek de objectieflens met zwarte aluminiumfolie om lichtvervuiling van de LCD-monitor te voorkomen.Stel een 10-inch LCD-monitor in op 12,5 centimeter voor de ogen van de muis om visuele stimuli te presenteren. Configureer de fluorescerende indieningsverzamelingsfilters voor EGFP en R-CaMP en de excitatiegolflengte tot 1.000 nanometer. Verkrijg afbeeldingen met een ruimtelijke resolutie van 0,25 micron per pixel.Zoek het beeldvormingsgebied waar R-CaMP-positieve neuronen en EGFP-positieve microglia tegelijkertijd in beeld kunnen worden gebracht. In laag 2, 3. Verkrijg afbeeldingen met een framesnelheid van 30 hertz.Gelijktijdig met de beeldacquisitie, presenteren drijvende rooster visuele stimuli aan de muis in 12 richtingen op zes oriëntaties, van nul tot 150 graden in stappen van 30 graden. Verwijder na de beeldacquisitie de muis uit het microscoopstadium. Maak het schaduwapparaat en het stereotaxische instrument los van de muis en breng de muis terug naar de thuiskooi.Met behulp van dit protocol werden AAV-injectie en craniale vensterimplantatie uitgevoerd in de primaire visuele cortex van een acht weken oude transgene muis, gevolgd door twee fotonenbeeldvorming van op R-CaMP gebaseerde neurale activiteit en microgliale dynamiek in laag 2, 3. Raspende visuele stimuli werden aan de muis gepresenteerd en de visuele reacties in de adendritische wervelkolom werden geanalyseerd met behulp van calciumsporen. Microgliale processen vertoonden een snelle dynamiek en veranderden hun morfologie binnen 10 seconden.Met behulp van beeldvorming van twee fotonen in laag 2, 3 van de primaire visuele cortex in een 12 weken oude transgene muis, werd R-CaMP waargenomen in neuronen, hier gezien in magenta. Een EGFP werd waargenomen in microglia, gezien in het groen. Individuele signalen werden ook waargenomen voor EGFP en R-CaMP.Succesvolle AAV-injectie is van cruciaal belang voor deze methode. De belangrijkste redenen voor mislukte AAV-injectie zijn de glazen pipetten en de weefselschade. Het surveillancegedrag op microglia en de microglia-interactie van de SNAP zijn geïdentificeerd als gangbaar in verschillende pathogene mechanismen, zoals de ziekte van Alzheimer.Onze methode is gunstig voor het onderzoek gericht op dit veld.

simultaneous-imaging-microglial-dynamics-neuronal-activity-awake

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Maruoka, H., et. al. Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice. J. Vis. Exp. (2022)     This video shows a two-photon microscopy procedure for imaging neuronal activity and microglial dynamics in an awake mouse during visual stimulation, highlighting calcium transients and cellular interactions.

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in an Awake Mouse

Source: Kamei, R., et. al., In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (2022)The video demonstrates the setup and imaging process for in vivo two-photon microscopy of microglial dynamics in the hippocampal CA1 (Cornu ammonis 1) and dentate gyrus, ensuring optimal optical alignment and structural integrity assessment.

In Vivo Two-Photon Imaging of Microglial Dynamics in the Mouse Hippocampus

Deze methode zorgt voor een tastbaar, vertrouwde omgeving voor de muis te navigeren en te verkennen tijdens microscopische beeldvorming of eencellige elektrofysiologische opnames, die stevige fixatie van het hoofd van het dier nodig heeft.

Flat-gevloerd Air-opgeheven Platform: Een nieuwe methode voor het combineren Gedrag met Microscopie of Electrofysiologie op Awake vrij bewegende Knaagdieren

Deze video toont de craniotomieprocedure die chronische beeldvorming van neuronen in de retrospleniale cortex van muizen mogelijk maakt met in vivo twee-foton microscopie in de Thy1-GFP transgene lijn. Deze benadering wordt gecombineerd met injectie van mCherry-expresserend adeno-geassocieerd virus in de dorsale hippocampus. Deze technieken maken langdurige monitoring van ervaringsafhankelijke structurele plasticiteit in RSC mogelijk.

Simultane twee-foton<em&gt; In Vivo</em&gt; Beeldvorming van Synaptic In- en Postsynaptische Doelen op Mouse retrospleniale Cortex

Dit protocol beschrijft een chronische craniale venster implantatie techniek die kan worden gebruikt voor longitudinale beeldvorming van neuro-glio-vasculaire structuren, interacties, en functie in zowel gezonde als zieke omstandigheden. Het dient als een aanvullend alternatief voor de transcraniële beeldvormingsbenadering die, hoewel vaak de voorkeur, een aantal kritische beperkingen bezit.

Nauwkeurige brain mapping om repetitieve in vivo beeldvorming van neuro-immuundynamica in muizen uit te voeren

Dit artikel demonstreert de voorbereiding van een op maat gemaakt beeldvormingsvenster aangevuld met infusiekanule en de implantatie ervan op het CA1-gebied van de hippocampus bij muizen.

Craniotomie procedure voor het visualiseren van neuronale activiteiten in Hippocampus van zich gedragende muizen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implantatie van een chronisch schedelvenster voor de longitudinale beeldvorming van hersencellen in wakkere, hoofdbezorgde muizen.

Implantatie van een schedelvenster voor herhaalde in vivo beeldvorming bij wakkere muizen

Dit artikel beschrijft een methode voor chronische in vivo observatie van de rustende microglia in de hippocampus CA1 van de muis met behulp van nauwkeurig gecontroleerde chirurgie en twee-fotonenmicroscopie.

In Vivo Chronische twee-foton beeldvorming van microglia in de hippocampus van de muis

Wanneer geïntegreerd met een kopplaat en een optisch ontwerp dat compatibel is met zowel enkelvoudige als twee-fotonmicroscopen, biedt de microprismalens een aanzienlijk voordeel bij het meten van neurale reacties in een verticale kolom onder verschillende omstandigheden, waaronder goed gecontroleerde experimenten in hoofdvaste toestanden of natuurlijke gedragstaken bij vrij bewegende dieren.

Langetermijnbeeldvorming van geïdentificeerde neurale populaties met behulp van microprisma's in vrij bewegende en met het hoofd gefixeerde dieren

Dit artikel demonstreert een methode om microglia-motiliteit en contact met postsynaptische puncta in het netvlies te visualiseren en te kwantificeren met behulp van spinning disk confocale microscopie.

Live beeldvorming en karakterisering van microglia-dynamica en interacties met synapsen in een zieke muisnetvlies

Leer gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen met AAV-injectie en craniaal venster. Deze methode minimaliseert bewegingsartefacten en biedt inzicht in hersendynamica.

Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

Meer video's verkennen