Synthese, karakterisering en toepassing van superparamagnetische ijzeroxide nanosondes voor detectie van extrapulmonale tuberculose

Wereldwijd wordt de diagnose van extrapulmonale tuberculose vaak uitgesteld, omdat het een chirurgische ingreep vereist voor bevestiging als gevolg van niet-specifieke klinische presentatie en slechte prestaties op diagnostische tests. Om serologische diagnostische tests voor Mycobacterium tuberculosis antigenen te verbeteren, hebben we super-paramagnetische ijzeroxide nanoprobes ontwikkeld voor het opsporen van extrapulmonale tuberculose. TB-SPIO nanosondes kunnen nauwkeurige magnetische resonantiebeelden bij lage concentraties bieden vanwege hun paramagnetische eigenschappen zonder een auto-immuunrespons te induceren.

TB-SPIO nanosondes maken het mogelijk om Mycobacterium tuberculosis-infectie te richten en op te sporen. Ze kunnen ook worden toegepast als MRI-contrastmiddel voor de detectie van andere ziekten. Zorg ervoor dat u het protocol zorgvuldig te bestuderen voordat u probeert het protocol, als elk deel van het experiment maakt gebruik van een specifieke kerntechnologie.

Visuele demonstratie van de methode kan leerlingen helpen om te begrijpen hoe het proces te implementeren, vooral voor sommige van de meer gecompliceerde experimenten. Om dextran-gecoate ijzeroxide magnetische nanodeeltjes te bereiden, krachtig combineren vijf milliliter dextran T40 met 45 milligram waterige ferric chloride hexahydraat en 32 milligram van ferrochloride tetrahydraat oplossingen bij kamertemperatuur. Voeg snel 10 milliliter ammoniumhydroxide toe en gebruik een roerstaaf om de resulterende zwarte suspensie gedurende een uur bij kamertemperatuur te roeren.

Aan het einde van de roerende incubatie, centrifugeren de oplossing en verwijder de aggregaten. Om de uiteindelijke SPIO-producten te scheiden van de niet-gebonden dextran T40, laadt u het gehele reactiemengsel van vijf milliliter in een 2,5 bij 33 centimeter gelfiltratiechromatografiekolom en ontwijkt u de dextran met 0,1-molaire natriumacetaat en 0,15-molar natriumbufferchlorideoplossing. Verzamel vervolgens de gezuiverde dextran-gecoate ijzeroxide magnetische nanodeeltjes in het lege volume en test de kolom eluates voor ijzer en dextran op 330 en 490 nanometer volgens standaardprotocollen.

Om SPIO-geconjugeerde Mycobacterium tuberculosis oppervlakte antilichamen te creëren, eerst synthetiseren SPIO-EDBE-barnsteenzuuranhydride door het mengen van 10 milliliter van een alkalische oplossing van SPIO-EBDE met een gram barnsteen anhydride gedurende 24 uur bij kamertemperatuur. De volgende dag, gebruik 12.000 tot 4, 000 moleculair gewicht cutoff moleculaire poreuze membraan buizen om de oplossing dialyseren met 26-uurs veranderingen van twee liter gedestilleerd water per verandering. Voeg na de laatste wijziging 100 microliter van de resulterende oplossing toe aan 400 microliter van 4,5 milligram per milliliter TB-oppervlakteantilichaam, gevolgd door de toevoeging van 1-hydroxybenzotriazool en benzotriazol-1-yloxy tripyrrolidinofosfonium hexafluoroffosfate als katalysatoren bij kamertemperatuur gedurende 24 uur met roer.

Scheid de oplossingen van het niet-gebonden antilichaam door gelfiltratiechromatografie met PBS als buffer. Om de gemiddelde deeltjesgrootte, morfologie en grootteverdeling te bepalen, drop-cast de composiet dispersie op een 200-mesh koperen raster en lucht-droog het monster bij kamertemperatuur voor het laden op een transmissie elektronenmicroscoop voor beeldvorming op 100 kilovolts. Om de ontspanningstijdwaarden van de nanosondes te meten, gebruikt u een nucleaire magnetische resonantie relaxometer bij 20 megahertz en 37 graden Celsius plus of min een graad.

Voor nanoprobe gepulseerde celbeeldvorming, eerst cultiveren menselijke THP-1 monocyten volgens standaard cel cultuur protocollen. Wanneer de cellen het juiste stadium van activering hebben bereikt, preincueren één keer 10 aan de zeven monocyten met één keer 10 aan de zesde kolonie-vormende eenheden van Mycobacterium bovis BCG gedurende één uur. Breng aan het einde van de incubatie de cellen over op een microcentrifugebuizen van één milliliter en voeg twee millimolar SPIO Mycobacterium-tuberculose oppervlak antilichaam-geconjugeerde nanoprobes toe aan elke buis voor een incubatie van een uur bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.

Verzamel aan het einde van de incubatie de cellen door centrifugatie en verhoog de pellets in 200 microliters van vers medium. Scan vervolgens de monsters met behulp van een snelle gradiënt echopulsvolgorde door middel van 3.0-T magnetische resonantiebeeldvorming om de specificiteit en gevoeligheid van de nanosondes te bepalen. Om proefdieren te inenten met M.bovis BCG, reconstrueren eerst het lyophilized vaccin of bacteriële voorraad in het medium van Sauton en verdunnen de gereconstitueerde voorraadoplossing met zoutoplossing.

Laad vervolgens 100 microliter van de oplossing in één 1 milliliter spuit per dier en injecteer het volledige volume bacteriën intradermally in de linker of rechter dorsale scapular huid van elke muis. Voor in vivo magnetische resonantiebeeldvorming van levende nanoprobe geïnjecteerde dieren, verwerf baseline T2-gewogen snelle spin-echo beelden van elk verdoofd experimenteel dier voordat u twee nanomolar spio-tb-antilichaamsondes injecteert die in 200 microliter zout in de staartader van elke muis zijn opgehangen. Beeld de dieren vervolgens onmiddellijk na de injectie opnieuw en de komende 30 minuten om de vijf minuten.

Aan het einde van de beeldvormingssessie analyseert u kwantitatief alle magnetische resonantiebeelden met behulp van de signaalintensiteit als een meting van de gedefinieerde gebieden die van belang zijn op vergelijkbare locaties van een M.tuberculosis granuloma-centrum en de rugspier naast een granulomatisgebied. Gebruik vervolgens de formule om de relatieve signaalverbeteringen te berekenen met behulp van de signaalintensiteitmeting vóór en nul tot drie uur na de injectie van de contrastmiddelen. Een maand na de inenting, het verzamelen van het weefsel van de intradermale inenting site van elk dier en vlek de formaline vaste paraffine ingebed vijf tot 10 micrometer dikke weefsel monsters met hematoxylin en eosine, Ziehl-Neelsen vlekken voor zuur-snelle bacteriën, en Berlijn blauw voor ijzer.

Transmissie elektronen microscopie imaging van SPIO-TB oppervlakte antilichaam nanosondes blijkt dat de nanosondes vertonen een goed verspreide verschijning met een gemiddelde grootte van 3,8 plus of min 0,4 nanometer per kern. M.bovis BCG en zuur-snelle bacteriële stam kan worden gedetecteerd door Ziehl-Neelsen kleuring. Na isolatie en cultuur met sondes die ijzer bevatten, kunnen de bacteriën worden geïdentificeerd door de blauwe kleuring van Berlijn.

De TB-targeting mate van SPIO-TB oppervlakte antilichaam nanosondes kan worden bepaald door middel van T2-gewogen magnetische resonantie imaging, zoals aangegeven door een afname van de signaalintensiteit in de aanwezigheid van de nanosondes die optreedt in een concentratie afhankelijke manier. Bij nanoprobe geïnjecteerde dieren is de T2-gewogen verbetering van de signaalreductie in de M.tuberculosis granulomatis-gebieden ongeveer 14 keer hoger dan die van de controleplaatsen. Een maand na infectie kan een georganiseerde onderhuidse granuloma worden waargenomen in nanoprobe geïnjecteerde C57 zwarte 6 muizen met nieuwe bloedvasculaireisatie en lymfocyten en epitheïoïde macrofagen aggregaten opgemerkt binnen deze laesies.

Positieve M.tuberculose expressie wordt ook waargenomen in de granulomatous gebieden met zuur-snelle bacillen vlekken positief op de laesie site. Berlijnsblauw, een ijzerpositieve vlek, kan ook worden gebruikt om de gevoeligheid van de sondes voor tbc te bepalen. Voor in vivo magnetische resonantie beeld van het leven, nanoprobe geïnjecteerde dieren verwerven baseline T2-gewogen snelle spin-echo beeld van elk verdoofd experimenteel dier voor het injecteren van de SPIO-TB antilichaam sondes. Nu we de SOP-techniek hebben vastgesteld om extra longtuberculose op te sporen, kunnen deze antilichamen worden gebruikt om specifiek extra longtuberculose te diagnosticeren.