Single-doorvoer complementaire High-resolution analytische technieken voor het karakteriseren van complexe natuurlijke organische stof mengsels

Dit protocol beschrijft de methode voor uitgebreide, onbevooroordeelde moleculaire karakterisering van een enkel monster met behulp van zowel massaspectrometrie, met behulp van metabolomics, proteomics en lipidomics, en nucleaire magnetische resonantie spectroscopie platforms. Het belang van deze aanpak is dat we een biologisch systeem stroomafwaarts van het genoom kunnen karakteriseren, door verschillende soorten moleculen te identificeren, waardoor we metabole en ontbindingstrajecten kunnen afleiden. Sequentiële extractietechniek, laat extractie van biologisch beschikbare, polaire verbindingen met behulp van water, gevolgd door MPLEx om eventuele extra polaire verbindingen of metabolieten evenals eiwitten en lipiden uit een enkel monster vast te leggen.

Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang omdat het de wetenschapper begeleidt door het scheiden van de drie lagen tijdens de tweede extractiestap, en het splitsen van de extracten tussen verschillende analyse-instrumenten. Integratieve multi-omische analyses maakt effectievere onderzoeken en een volledig begrip van complexe biologische systemen mogelijk. Deze robuuste methode haalt een grote diversiteit aan moleculen en is toepasbaar op diverse monstersoorten.

Begin deze procedure met het verzamelen en voorbereiden van de monsters zoals beschreven in het tekstprotocol. Met behulp van een ethanol gewassen, roestvrij stalen gebruiksvoorwerp, aliquot 50 milligram van elk van de gedroogde monsters in individuele twee milliliter glazen buizen. Voeg een milliliter gedistilleerd, ontgast water toe aan elk monster.

Dop vervolgens de flesjes en schud twee uur op een shakertafel. Centrifugeren de monsters op 15 duizend keer zwaartekracht gedurende 30 minuten. En laat de oplossingen dan 20 minuten op kamertemperatuur staan.

Decanteer en sla de supernatant van elk monster. Voer een MPLEx Extraction uit op de nu water gewonnen residuen door deze extractiestappen te herhalen. Behalve om een min 20 graden celsius vier tot drie chloroform te vervangen door methanol mengsel voor de gedistilleerde, ontgast water.

Scheid zorgvuldig de twee resulterende oplosmiddellagen, die visueel te onderscheiden zijn door de toplaag te verwijderen door voorzichtig pipetting. Droog de onderste niet-polaire laag in de vriesdroger. Zodra het droog is, voeg vijf microliter van chloroform en 195 microliter van methanol toe als het binnen de volgende paar dagen analyseert.

Ter verbetering van de elektrospray ionisatie-efficiëntie voor fourier-transform ion cyclotron resonantie massaspectrometrie, afgekort FTICR-MS door directe injectie. Verdun het chloroformextract één op één in methanol en het water extract twee tot één in methanol. Kalibreer de FTICR spectrometer door direct 100 microliter van een tuningoplossing te injecteren, verspreid over een massabereik van ongeveer 100 tot 1.300 daltons, in de FTICR-MS.

Direct injecteren 100 microliters van de Suwannee River Fulvic Acid standaard om de elektrospray ionisatie bron. Gekoppeld aan de FTICR spectrometer via een spuitpomp ingesteld op een flow rate van 3,0 microliter per minuut. Stel de naaldspanning in op positieve 4,4 kilovolt.

Wachtrij een tot 100 massa-lading verhouding en het glas capillair op 180 graden Celsius. Inspecteer de resulterende spectra met behulp van de analysesoftware om de kwaliteit van de gegevens te bevestigen. Introduceer nu 100 microliter van elk extract via directe injectie aan de elektrospray-ionisatiebron, gekoppeld aan de FTICR-spectrometer via een spuitpomp ingesteld op een stroomsnelheid van 3,0 microliter per minuut.

Stel de parameters in zoals voorheen. Pas de ionenaccumulatietijd voor elk monster of groep monsters aan om rekening te houden met variatie in koolstofconcentratie. Verzamel 144 scans voor elk monster, gemiddeld de scans en voer vervolgens een interne kalibratie met behulp van een homologe CH2-serie.

Droog de extracten met behulp van een concentrator en sla de rest van de extracten voor latere gaschromatografie massaspectrometrie, vloeibare chromatografie massaspectrometrie en nucleaire magnetische resonantie spectroscopie analyse. Als u zich wilt voorbereiden op GC-MS, moet u eerst lege controlemonsters voorbereiden zoals beschreven in het tekstprotocol. Ter bescherming van karabijngroepen voeg 20 microliter van 30 milligram per milliliter methoxamine hydrochloride in Paradyne aan elk van de monsters, met inbegrip van de methanol extracten, het water extracten, de blanks en de FAME kalibratie monsters.

Sluit de flesjes af met doppen. Vortex de extracten voor 20 seconden, dan sonicate de extracten voor 60 seconden. Centrifugeren de extracten op 37 graden Celsius gedurende 90 minuten op 100 keer zwaartekracht.

Voeg 80 microliter MSTFA met 1%trimethylchlorosilane toe aan elk monster. Na het vortexen en soniceren van de extracten zoals voorheen, centrifugeren de extracten weer op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten op 100 keer zwaartekracht. Na het koelen extracten op kamertemperatuur, overdracht in GC-MS autosampler flesjes.

Ga naar GC-MS analyse en gegevensverwerking zoals beschreven in het tekstprotocol. Ter voorbereiding op de NMR-analyse van vloeibare toestand verdunt u de rest van de waterextracten met 10%met een interne standaard van vijf millimolar DSS. Breng het mengsel in een hoge kwaliteit, drie millimeter buitendiameter borosilicaat glas NMR buis.

Ga naar NMR-analyse en gegevensverwerking zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de LC-MS lipidomics analyse uit te voeren, injecteer 10 microliter van elk extract in een ultra performance vloeibare chromatografie systeem, gekoppeld aan een Orbitrap massaspectrometer met behulp van een omgekeerde fase geladen oppervlak hybride kolom. Stel een verloop van 34 minuten in zoals vermeld in het tekstprotocol met een stroomsnelheid van 250 microliter per minuut.

Gebruik zowel negatieve als positieve ionisatiemodi met een hogere energiebotsingsdissociatie en door botsingen veroorzaakte dissociatie. Om proteomics analyse uit te voeren, eerste extract eiwitten volgens het MPLEx protocol voor de rest van de methanol fase zoals beschreven in het tekstprotocol. Turf werd vergeleken met diepte in het S1-veen op de Sparren en Veengebieden Respons Under Changing Environments of SPRUCE site in Minnesota, USA.

3, 312 enzymen werden geïdentificeerd in de proteomics analyse. Uit een analyse van de enzymactiviteiten met diepte blijkt dat het aantal enzymen sterk afneemt tussen 15 centimeter en 45 centimeter in het SPARSveen. Om te laten zien hoe sites kunnen variëren in metaboliet- en enzymactiviteiten, worden spruce-resultaten vergeleken met die van een Permafrostveen en Fen in Noord-Zweden.

In totaal werden 67, 040 metabolieten geïdentificeerd in alle SPARREN Turfmonsters uit de combinatie van FTICR-MS, NMR, GC-MS en LC-MS analyses. Hier wordt de relatieve fractie van verschillende chemische klassen weergegeven die via verschillende technieken in de verschillende diepten worden geïdentificeerd. Terwijl aminozuren en suikers dalen met diepte, dit wordt niet waargenomen voor lipiden.

Door kruis validering van metabolieten geïdentificeerd in alle analyses tegen de KEGG Database werd vastgesteld dat de geïdentificeerde verbindingen betrokken zijn bij gemeenschappelijke metabole trajecten zoals tricarboxylzuur cyclus, glycolyse en suiker metabolisme. Gedurende deze procedure is het van cruciaal belang om op de hoogte te zijn van mogelijke bronnen van verontreiniging. Vanaf het verzamelen van monsters mogen monsters niet in contact komen met gekoppelde kunststoffen die ionisatie negatief kunnen beïnvloeden.

Veel van de oplosmiddelen die tijdens de extractieprocedure worden gebruikt, zijn gevaarlijk of ontvlambaar. Draag altijd de juiste BESCHERMINGSMIDDELEN om huid- en oogcontact te voorkomen en om besmettingsmonsters te voorkomen.