Analyse van de ontwikkeling van de cardiale kamer tijdens muis embryogenese met hele Mount Epifluorescence

Met behulp van deze methode kunnen we direct onderzoek hartbuis vorming, looping, en volledige kamervorming zonder verdere experimentele manipulaties van de muis embryo. Hoewel we MLC-2v-tdTomato muizen als voorbeeld gebruiken, kan deze eenvoudige methode op grote schaal worden gebruikt met andere tl-verslaggeversmuislijnen. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het zeer eenvoudig is en geen complexe technieken of apparatuur vereist.

Het kan worden uitgevoerd op regelmatige lab instelling. Na de paring vrouwtje met mannelijke muizen, zowel MLC-2v-tdTomato 8 tot 10 weken oud, controleer de dammen voor vaginale pluggen elke ochtend. Leg de zwangere dammen, geëuthanaseerd op verschillende dagen na coitum, in supine positie en spray de buik met 70%ethanol.

Gebruik scherpe chirurgische schaar en tangen om de buikholte te openen door incisie van zowel de huid en buikwand. Na het lokaliseren van bilaterale baarmoederhoorns in het dorsale deel van de buikholte, scheid de hele baarmoeder met behulp van scherpe chirurgische schaar en tangen om zorgvuldig te snijden boven de oviducts aan beide zijden. Plaats de hele ontleed baarmoeder in een petrischaaltje van 10 centimeter met ijskoude PBS.

Met behulp van scherpe chirurgische schaar en tang, zorgvuldig scheiden elke vruchtzak langs de baarmoeder hoorn. Gebruik een pincet om elk embryo over te brengen naar een 35 millimeter kweekplaat gevuld met ijskoude PBS. Met behulp van scherpe chirurgische schaar en tangen, open een vruchtzak en bloot elk embryo door het afsnijden van de navelstreng en vervolgens trim extra embryonale weefsels zoveel mogelijk zonder beschadiging van de embryo's.

Onder een ontleden microscoop met een glasvezelmicroscoop verlichting, afgesneden van het hoofd van het embryo en breng het naar een 1,5 milliliter buis met 100 microliter buffer A voor later genotyping te correleren met de resultaten van epifluorescente beeldvorming. Open met fijne tangen de borst van het embryo. Verwijder met een scherpe chirurgische schaar en tang het hart weg van de longen en vasculatuur.

Gebruik een pincet om het ontleed embryonale hart over te brengen naar een 35 millimeter kweekplaat met PBS. Plaats de plaat met muis embryonale harten onder een epifluorescent ontleden microscoop. Gebruik fijne tangen om de embryonale harten zodanig te positioneren dat de ontwikkeling van ventrikels worden geconfronteerd met de examinator.

Pas de focus aan met een doelstelling van 0,63x in de modus Helderveld. Neem belichtingen op fel veld en leg meerdere beelden vast. Om tdTomato expressie te visualiseren, zet een glasvezel microscoop verlichting en stel het filter voor rode fluorescentie.

Pas de scherpstelling van het beeld indien nodig aan, pas de helderheid en het contrast aan, maak rood fluorescerende belichtingen en leg meerdere beelden vast. Voor embryogenobunt kook u eerder geïsoleerde hoofdmonsters in buffer A bij 100 graden Celsius gedurende 30 minuten. Centrifuge gedurende twee minuten op 11, 360 keer G.Transfer 20 microliter supernatant in een nieuwe 1,5 milliliter buis met 20 microliter buffer B en meng.

Gebruik 4,5 microliter van de gemengde supernatant als DNA-sjabloon en combineer het met 0,5 microliter van elk van de 10 micromolar-specifieke voorwaartse en omgekeerde primers, 10 microliter van 2x-voorgemengde polymerase en reactiebuffer en voeg vervolgens water toe aan een totaal volume van 20 microliter. Voer een PCR uit zoals beschreven in het manuscript. Laad de voltooide reactie in 100 base pair DNA ladder op een 1%agarose gel en loop op 140 volt in 1x TAE buffer gedurende 25 minuten.

Plaats de voltooide gel op een UV-transilluminator en zet het UV-licht aan om de DNA-banden te identificeren. MLC-2v wordt beschouwd als de vroegste marker voor ventriculaire kamer specificatie tijdens de ontwikkeling van het hart. In MLC-2v-tdTomato reporter knock-in muizen, relatief zwakke expressie van tdTomato in de lineaire hartbuis op E8.0 wordt sterker op E8.5 zoals aangetoond met behulp van hele-mount epiflourescent beeldvorming van de embryo's.

Met behulp van hele-mount epiflourescent beeldvorming van het ontleed hart, ventriculaire kamervorming tijdens de ontwikkeling van het muishart kan gemakkelijk worden bepaald. In het ontleed hart van een heel muizenembryo op E10.5, werd MLC-2v-tdTomato reporter expressie getoond in het ventriculaire gedeelte van het hart en niet in de instroom, het uitstroomkanaal of de toekomstige atria. Op E12.5 tot E13.5, tdTomato verslaggever wordt uitsluitend uitgedrukt in de ventrikels van de vier-chambered hart.

Het vergelijkbare ventriculaire-specifieke expressiepatroon werd getoond in het ontleedmuisembryo op E16.5. Na hele beeldvorming werd het genotype van de embryo's bepaald met behulp van twee sets primers voor PCR-genotyping, die homozygoot embryo's met het tdTomato-knock-in-allel, heterozygoot en de wild-type embryo's bevestigden. Deze methode is vrij eenvoudig en eenvoudig uit te voeren.

De kritieke stap is het ontleden van embryonale harten. Inzicht in cardiale anatomie tijdens de hartontwikkeling is noodzakelijk om het hart met succes te isoleren van het hele embryo.