Analyse van Cardiomyocyte Development behulp Immuunfluorescentie in Embryonale Muis Hart

Het algemene doel van deze procedure is om de rijping van myofibrillen en cardiomyocyten in het ontwikkelende embryonale muizenhart te beoordelen. Dit wordt bereikt door het embryonale hart eerst te oriënteren en te vriezen in een snijmedium. Vervolgens wordt het hart in de juiste oriëntatie cryosectie gedaan.

Vervolgens ondergaan de hartsecties immunofluorescente labeling van de eiwitten van belang. Ten slotte wordt er confocale microscopie uitgevoerd op de immunogekleurde hartsecties. Uiteindelijk worden twee- en driedimensionale beeldanalyses gebruikt om de ontwikkeling van MyFi en andere cardiomyocytstructuren aan te tonen.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de cardiale ontwikkeling, zoals de wijze waarop mutaties en cardiale genen de MyFi-assemblage en het ontstaan van specifieke structuren, zoals intercalaire schijven en costumers, beïnvloeden. Om embryonale harten snel te invriezen, wordt een Petri-schaal van 3,5 centimeter in een chemische zuurkast gevuld met optimal cutting temperature- of OCT-medium. Koel 2-methylbutaan af in vloeibare stikstof.

Nadat de embryonale muizenharten volgens het tekstprotocol zijn geïsoleerd, worden de harten in OCT geplaatst en enkele seconden gelaten om te equilibreren voordat ze worden overgebracht naar een vorm van zeven millimeter die OCT bevat. Richt de binnenwand van het hart naar de bodem van de vorm. Plaats de vorm voorzichtig in het met vloeibare stikstof gekoelde 2-methylbutaan.

Zorg ervoor dat het 2-methylbutaanvloeistof het OCT of het hart niet raakt totdat het OCT egaal wit is. Plaats de mal vervolgens in een ijsemmer met droogijs. Zodra alle harten bevroren zijn, worden de cryomalen in folie gewikkeld en bewaard bij -80 °C tot aan de cryosectie.

Om embryonale harten te fixeren, gebruik 4% PFA in PBS om de putjes van een 12-wells folie kweekplaat te vullen. Nadat de embryonale harten volgens het tekstprotocol zijn gedisseceerd, plaatst u elk hart in een putje met PFA en fixeert u deze gedurende één nacht bij vier graden Celsius. Om de harten cryoprotectief te behandelen, verplaatst u met een plastic transferpipet elk hart naar een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter met 1,5 milliliter 15% sucrose in PBS en schudt u voorzichtig bij vier graden Celsius totdat het hart naar de bodem van het buisje zinkt. Breng vervolgens elk hart over naar 30% sucrose in PBS en schud voorzichtig bij vier graden Celsius totdat het hart naar de bodem van het buisje zinkt.

Bevries de embryo's in OCT zoals eerder in deze video is aangetoond. Nadat de cryovormen in de cryostaatkamer zijn geplaatst en zijn geëquilibreerd tot -17 °C, wordt de cryovorm omgekeerd en wordt er lichte druk uitgeoefend om het hartblok uit de vorm te drukken. Richt de anteriorwand van het hart naar de bovenkant van het gevormde weefselblok.

Plaats een grote druppel OCT op de houder en monteer het hartblok op de OCT-druppel. Houd de oriëntatie zodanig aan dat de voorwand van het hart het verst van de houder afligt. Laat het hart op de houder invriezen.

Plaats de klem en het gemonteerde hartblok op de objecthouder van de cryostaat. Stel dit zo in dat de hoek van het mes drie tot vijf graden ten opzichte van het monster bedraagt. Verzamel coupes van 10 micrometer op microscopiepreparaatjes die vooraf zijn behandeld met een positief geladen coating.

Laat de monsters volledig drogen voordat ze bij -80 °C worden bewaard voor het uitvoeren van immunofluorescentie. Na het fixeren en/of het verwijderen van OCT uit de coupes, wordt 1x blokkeerbuffer verdund in PBS gebruikt om gedurende 45 minuten te blokkeren onder zachte schudding. Indien er een primair antilichaam wordt gebruikt dat in muis is gegenereerd, voeg dan een donkey of goat anti-mouse IgG H plus L monovalent FAB-fragment toe, verdund 1:100 in PBS met 0,1% tween 20, en incubeer dit gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur onder zachte schudding.

Voeg het primaire antilichaam of de primaire antilichamen toe, verdund in één x blokkeringsbuffer, en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur of overnight bij vier graden Celsius. Was na de incubatie de coupes drie keer gedurende 10 minuten met één XPBS. Voeg bij kamertemperatuur een geconjugeerd secundair antilichaam, verdund 1:500 in blokkeringsbuffer, toe aan de monsters en incubeer gedurende twee uur, beschermd tegen licht.

Was de coupes bij kamertemperatuur drie keer gedurende 10 minuten met XPBS, terwijl ze worden beschermd tegen licht. Monteer de objectglazen in anti-fade medium door twee druppels medium op elk uiteinde van het objectglas aan te brengen en dek dit af met een dekglas. Gebruik nagellak om de dekglazen af te dichten.

Bewaar het bij 4 °C, beschermd tegen licht, tot het moment van beeldvorming. Gebruik een 4x objectief en laserfluorescentie om het monster en het gebied van interesse te lokaliseren. Leg het beeld vast om als referentiekaart te gebruiken.

Bij beeldvorming met een hoge vergroting: verwijder het preparaat door minimale aanpassingen aan de objecttafel te maken. Schakel vervolgens over naar een 60 x olie-immersieobjectief.

Plaats een kleine druppel olie op het objectief en plaats het preparaat terug op de objecttafel. Zoek vervolgens het monster opnieuw op en stel de laservermogensbelichtingstijd en de binning in op de gewenste niveaus voor elk kanaal. Zodra de optimale instellingen zijn bepaald volgens de richtlijnen van het tekstprotocol, worden deze monsterinstellingen gebruikt voor alle weefselcoupes binnen het experiment.

Gebruik het intensiteitshistogram om het optimale intensiteitsbereik voor elk kanaal vast te stellen, dat vervolgens voor de analyse wordt gebruikt. Genereer een Z-stack met de acquisitiefunctie door de juiste laserkanalen te selecteren. Kies daarna de bovenste en onderste grenzen van de Z-stack.

Kies een Zack-stapgrootte die de helft is van de optische plaatsdikte zoals aangegeven door de software. Klik op 'run' om de beelden te verzamelen met Fiji of een vergelijkbaar programma voor beeldanalyse. Open het Zack-bestand met een aangepaste kleurmodusoptie en de kanalen gesplitst in afzonderlijke vensters.

Open via het vervolgkeuzemenu van de afbeelding de tool voor het aanpassen van helderheid en contrast en stel binnen elk kanaal het optimale histogramintensiteitsbereik in. Pas deze kanaalbereiken, zoals eerder bepaald, toe op alle te analyseren Zacks. Voeg vervolgens via het vervolgkeuzemenu voor afbeeldingskleuren de afzonderlijke kanalen samen tot één samengestelde afbeelding.

Maak via het projectmenu Image Stacks Z een afgeplatte Z-stack van de samengestelde afbeelding. Aangezien deze afbeelding aanzienlijk helderder zal zijn dan de 3D-afbeelding, moet het histogram-intensiteitsbereik voor de controlemonsters worden aangepast om oververzadiging te voorkomen; pas vervolgens dezelfde instellingen toe op de experimentele afgeplatte Z-stack. Om een 3D-afbeelding te genereren, kiest u eerst het projectmenu Image Stacks 3D. Kies vervolgens de x-as of de y-as als rotatie-as.

Stel de plakafstand in op hetzelfde aantal microns als de stapgrootte van de Z-stapel. Kies de gewenste totale rotatie en stel de rotatiehoekincrement in op één. Open vervolgens de ImageJ 3D-viewer via het uitklapmenu van de plug-ins.

Kies voor de weergave van de gegenereerde samengestelde afbeelding als volume en stel de resamplingsfactor in op één of twee. Deze figuren tonen typische resultaten voor de co-kleuring van verschillende eiwitten in een snap-frozen, met aceton gefixeerd hart; het antilichaam tegen S alpha actinin labelde reproduceerbaar de Z-schijven en in intercalaire schijven met hoge specificiteit en minimale achtergrond. Het antilichaam tegen het adherens-junction-eiwit bèta-catenine bond aan het membraan van zowel cardiomyocyten als niet-cardiomyocyten, en colocalisatie met SFA actinin trad op in vermoedelijke intercalaire schijven bij E 16.5. Immunofluorescentie van bèta 1 integrine in het embryonale hart is bijzonder uitdagend, maar bèta 1 integrine-kleuring in deze studies onthulde een signaal met dezelfde periodiciteit als de door SFA actinin gelabelde Z-schijven, wat mogelijk wijst op het vormen van beginnende costameren bij E 16.5.

Bij E 12,5 vertoonde het kleuringspatroon van SFA actinine en tropomyosine een regelmatige periodiciteit in trabeculaire cardiomyocyten, wat consistent is met mature myofibrillen in de buitenste compacte zone. SFA actinine was meer punctaat dan lineair en het tropomyosine-signaal was diffuus in plaats van lineair. NCA adherente kleuring en trabeculaire cardiomyocyten in harten van E 12,5 co-lokaliseerden met gebieden van intense SFA actinine-kleuring, wat mogelijk interstitiële schijven vertegenwoordigt. Hier wordt getoond: A een met PFA gefixeerd embryonaal hart van E 12,5, gelabeld voor SFA actinine en filamenteus actine van een life act RFP Ruby transgene muis. De signaal-ruisverhouding van SFA actinine was verlaagd in vergelijking met snap-frozen hartsecties.

Driedimensionale beeldreconstructie onthulde dat MyFi binnen een cardiomyocyt ruwweg parallel aan elkaar liepen, maar individuele cardiomyocyten waren onder variërende hoeken ten opzichte van elkaar georiënteerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe embryonale harten correct georiënteerd en cryogesneden moeten worden, alsmede in het uitvoeren van immunokleuring, confocale microscopie en beeldanalyse om de rijping van MyFi en cardiomyocyten tijdens de ontwikkeling van het muizenhart te beoordelen.Admit.