Analyse van Cardiomyocyte Development behulp Immuunfluorescentie in Embryonale Muis Hart
26 maart 2015
Mutaties die leiden tot aangeboren hartafwijkingen profiteren van in vivo onderzoek van de hartstructuur tijdens de ontwikkeling, maar hoogwaardige structurele studies in het embryonale muishart zijn technisch uitdagend. Hier presenteren we een robuuste immunofluorescentie- en beeldanalysemethode om cardiomyocyt-specifieke structuren in het zich ontwikkelende muishart te beoordelen.
Het algemene doel van deze procedure is om de rijping van MyFi en cardiomyocyten te beoordelen in het zich ontwikkelende embryonale muishart. Dit wordt bereikt door eerst het embryonale hart in een snijmedium te oriënteren en in te vriezen. Vervolgens wordt het hart in de juiste oriëntatie cryo-gesneden.
Daarna ondergaan de hartsecties immunofluorescente markering van eiwitten van belang. Ten slotte wordt confocale microscopie van immunogeverfde hartsecties uitgevoerd. Uiteindelijk worden tweedimensionale en driedimensionale beeldanalyen gebruikt om de ontwikkeling van MyFi en andere cardiomyocytenstructuren te tonen.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van hartontwikkeling, zoals hoe mutaties en hartgenen de MyFi-assemblage en het ontstaan van specifieke structuren zoals interate discs en costumers beïnvloeden. Om embryonale harten snel te bevriezen, gebruikt u optimaal snijtemperatuur of OCT-medium om een 3,5 centimeter Petrischaal in een chemische kap te vullen. Koel. Twee methyl butaan in vloeibaar stikstof.
Nadat de embryonale muisharten volgens het tekstprotocol zijn geïsoleerd, plaatst u de harten in OCT en laat ze enkele seconden gelijkmaken voordat u ze overbrengt naar een zeven millimeter mal die OCT bevat. Orienteer de binnenwand van het hart naar de bodem van de mal. Plaats de mal voorzichtig in het vloeibaar stikstof gekoelde twee methyl butaan.
Zorg ervoor dat de vloeistof van twee methyl butaan de OCT of het hart niet raakt totdat de OCT vast en wit is. Breng vervolgens de mal over in een ijsemmer met droog ijs. Nadat alle harten zijn bevroren, wikkelt u de cryo-malen in folie en bewaart u deze op negentig graden Celsius totdat ze klaar zijn voor cryosectio.
Om embryonale harten te fixeren, gebruikt u 4% PFA in PBS om de putjes van een 12-voudige foliekweekplaat te vullen. Nadat de embryonale harten volgens het tekstprotocol zijn gedissecteerd, plaatst u elk hart in een putje met PFA en fixeert u het bij vier graden Celsius overnacht. Om de harten te beschermen tegen bevriezing, gebruikt u een plastic overdrachtspijpje om elk hart over te brengen naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje met 1,5 milliliter 15% Sucrose in PBS en schudt u voorzichtig bij vier graden Celsius totdat het hart naar de bodem van het buisje zakt. Breng elk hart over naar 30% sucrose in PBS en schudt u voorzichtig bij vier graden Celsius totdat het hart naar de bodem van het buisje zakt.
Vries de embryo's in OCT in zoals eerder in deze video is aangetoond. Nadat u de cryo-malen in de cryostatkamer hebt geplaatst en de temperatuur op negatief 17 graden Celsius hebt ingesteld, keert u de cryo-mal om en gebruikt u lichte druk om de hartblok uit de mal te verwijderen. Orienteer de voorste wand van het hart naar de bovenkant van de gevormde weefselblok.
Plaats een grote druppel OCT op de draaitafel en monteer de hartblok op de OCT-druppel. Zorg ervoor dat de oriëntatie zo is dat de voorste wand van het hart het verst van de draaitafel verwijderd is. Laat het hart aan de draaitafel bevriezen.
Laad de draaitafel en gemonteerde hartblok op de cryostat-objecthouder. Pas aan zodat de hoek van het mes drie tot vijf graden is ten opzichte van het monster. Verzamel 10 micrometer secties op microscoopglaasjes die zijn voorbehandeld met een positief geladen coating.
Laat de monsters volledig drogen voordat u ze bewaart bij negentig graden Celsius om immunofluorescentie uit te voeren. Nadat u de OCT heeft vastgelegd en/of verwijderd uit de secties, gebruikt u een x blokkerende buffer verdund in PBS om 45 minuten te blokkeren met zacht schudden. Als u een primaire antilichaam gebruikt dat in muis is gegenereerd, voegt u een ezel of geit anti-muis IgG H plus L monovalent FAB-fragment toe, verdund 1 tot 100 in PBS 0,1% tween 20 en incubeert u bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten met zacht schudden.
Voeg primaire antilichamen of antilichamen toe, verdund in een x blokkerende buffer, en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur of bij vier graden Celsius overnacht. Na de incubatie, gebruikt u een XPBS om de secties drie keer gedurende 10 minuten te wassen. Voeg bij kamertemperatuur een geconjugeerd secundair antilichaam toe, verdund 1 tot 500 in blokkerende buffer naar de monsters en incubeer beschermd tegen licht gedurende twee uur.
Was de secties bij kamertemperatuur drie keer gedurende 10 minuten met een XPBS beschermd tegen licht. Monteer de dia's in een anti-fade medium door twee druppels medium op elk uiteinde van de dia te plaatsen en gebruik een dekglas om te bedekken. Gebruik nagellak om de dekglazen af te sluiten.
Bewaar het bij vier graden Celsius, beschermd tegen licht totdat u klaar bent om te beeldvormen. Gebruik een vier x objectief en laserfluorescentie om het monster en het gebied van belang te vinden. Leg de afbeelding vast om als kaart te gebruiken.
Bij hoge vergroting. Verwijder de dia en maak minimale aanpassingen aan de dia-standaard. Vervolgens gaat u over op een 60 x olie-immersie-objectief.
Plaats een kleine druppel olie op het objectief en plaats de dia weer op de dia-standaard. Zoek vervolgens het monster opnieuw, stel de laservermogen-expositietijd en binning in op de gewenste niveaus voor elk kanaal. Zodra de optimale instellingen zijn bepaald volgens de richtlijnen van het tekstprotocol, gebruikt u de monsterinstellingen voor alle weefselsecties binnen het experiment.
Gebruik de intensiteitshistogram om het optimale intensiteitsbereik voor elk kanaal te noteren, dat zal worden gebruikt voor analyse. Genereer een Zack met behulp van de acquisitiefunctie door de juiste laserkanalen te selecteren. Kies vervolgens de bovenste en onderste limieten van de Z-stack.
Kies een Zack-stapgrootte die de helft is van de waarde van de optische plakdikte die door de software wordt geleverd. Klik op uitvoeren om de afbeeldingen te verzamelen met behulp van Fiji of een vergelijkbaar programma voor beeldafbeeldanalyse. Open het Zack-bestand met een aangepaste kleurmodus-
Overzicht
Deze studie presenteert een robuuste methode voor het beoordelen van cardiomyocyt-specifieke structuren in het zich ontwikkelende muishart door middel van immunofluorescentie en beeldanalyse. De techniek gaat in op de uitdagingen van hoogwaardige structurele studies in de embryonale hartontwikkeling.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Hartontwikkeling
- Immunofluorescence
- Beeldanalyse
Achtergrond
- Aangeboren hartafwijkingen worden vaak onderzocht door middel van in vivo onderzoeken.
- Hoogwaardige beeldvorming van het embryonale hart is technisch uitdagend.
- Inzicht in de rijping van cardiomyocyten is cruciaal voor hartonderzoek.
- Deze methode kan de effecten van mutaties op de hartstructuur verduidelijken.
Doel van het onderzoek
- Om de rijping van myofibrillen en cardiomyocyten in het embryonale muishart te beoordelen.
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor hoogwaardige beeldvorming van hartstructuren.
- Om te onderzoeken hoe mutaties de assemblage van myofibrillen en de structuren van cardiomyocyten beïnvloeden.
Gebruikte methoden
- Orientatie en invriezen van embryonale harten in snijmedium.
- Cryosecteren van harten voor immunofluorescentielabeling.
- Confocale microscopie voor het beeldvormen van gekleurde hartsecties.
- Twee-dimensionale en driedimensionale beeldanalyses om cardiomyocytenstructuren te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle immunofluorescentielabeling van eiwitten in cardiomyocyten.
- Hoogwaardige beelden die de ontwikkeling van myofibrillen demonstreren.
- Inzichten in de structurele ontwikkeling van intercalaire discs en costameres.
- Methodologie biedt een kader voor toekomstige studies naar hartontwikkeling.
Conclusies
- De ontwikkelde methode is effectief voor het bestuderen van de rijping van cardiomyocyten.
- Het kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen over genetische mutaties in het hart.
- Deze aanpak verbetert ons begrip van de hartstructuur tijdens de ontwikkeling.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-resolution immunofluorescence analysis of embryonic mouse heart tissue enables precise evaluation of cardiomyocyte maturation and structural assembly, addressing a critical bottleneck in early cardiac target validation. This method enhances predictive confidence in linking genetic perturbations to phenotypic outcomes, supporting risk-adjusted decisions in cardiovascular drug discovery portfolios. Robust visualization of myofibril, intercalated disc, and costamere development informs mechanistic de-risking at the discovery and preclinical interface.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct assessment of cardiomyocyte structural maturation in physiologically relevant tissue context.
- Supports functional validation of cardiac gene targets by visualizing effects on myofibril and intercalated disc assembly.
- Facilitates mechanistic de-risking by correlating genetic mutations with structural phenotypes.
- Improves predictive confidence for early-stage cardiovascular target triage.
Screening & Assay Development
- Establishes validated imaging protocols for quantitative analysis of cardiac structural proteins.
- Standardizes immunofluorescence workflows for reproducible detection of sarcomere and costamere markers.
- Enables high-content screening of genetic or pharmacological perturbations in embryonic heart tissue.
- Provides scalable imaging and analysis pipelines for downstream compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural readouts with disease-relevant cardiac phenotypes for translational biomarker development.
- Ensures continuity from discovery-stage genetic validation to preclinical model characterization.
- Supports risk-adjusted advancement of cardiac candidates based on in situ structural evidence.
- Facilitates cross-species comparison of cardiac maturation processes when adapting to other models.
Pipeline & Workflow Integration
This immunofluorescence-based workflow integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging genetic perturbation studies with phenotypic validation in embryonic heart tissue.
- Discovery Biology: Provides direct visualization of cardiomyocyte maturation and structural assembly for hypothesis testing.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis of experimental conditions.
- Analytics: Enables measurement of protein localization, periodicity, and colocalization to support statistical comparison.
- Translational Research: Connects early discovery findings to preclinical cardiac phenotypes relevant for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a robust, adaptable imaging platform for repeated use across cardiac R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cardiac target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes tissue processing, staining, and imaging for reproducible results across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking genetic changes to structural cardiac outcomes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cardiovascular targets and candidate advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic tissue handling, immunofluorescence, and confocal microscopy.
- Demands access to advanced imaging platforms and quantitative image analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of sample orientation, staining, and imaging parameters.
- May require adaptation for different developmental stages or cardiac model systems.
- Technical sensitivity and resolution must be validated for each protein target and developmental context.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:03
Snap-freezing Embryonic Mouse Hearts
2:02
Paraformaldehyde Fixing, Cryoprotecting, and OCT Embedding
2:55
Cryosectioning
3:51
Immunofluorescence
5:16
Confocal Imaging and Image Analysis
8:30
Results: Analysis of Cardiomyocyte Development
10:27
Conclusion
