Name: Analyse van Cardiomyocyte Development behulp Immuunfluorescentie in Embryonale Muis Hart (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Leer cardiomyocytontwikkeling analyseren met immunofluorescentie in embryonale muizenharten. Deze methode combineert cryosectie, confocale microscopie en beeldanalyse om myofibrilopbouw en structurele rijping te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen Drs. Hilary Clay, Stephen Wilson, Anna Payne-Tobin en James Smyth bedanken voor de nuttige discussies. De microscopie werd uitgevoerd in het Cardiovascular Research Institute Imaging Core aan de University of California, San Francisco. Dit werk werd ondersteund door NIH K08 HL105657 (LDW) en NIH HL65590 (SRC).

OPMERKING: Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de UCSF Institutional Animal Care en gebruik Comite. 1. cryopreservatie en fixatie van de embryonale Mouse Hearts. 1.1) Snap-bevriezing embryonale harten <ol><li> Vul een 3,5 cm petrischaal en 7 mm cryomolds met Optimal Cutting Temperatuur (oktober) medium (zie ook Materiaal tabel). In een chemische afzuigkap, koel 2-methylbutaan in vloeibare stikstof. </li><li> Breng 30 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in 10 cm petrischalen, 10 ml PBS in 3,5 cm petrischalen, en plaats alle petrischaaltjes op ijs. Bereid een 10 cm schotel en diverse 3,5 cm gerechten per zwanger muis. </li><li> Isoleer embryo&#39;s zoals eerder beschreven 15 uitvoeren van de dissectie in ijskoude PBS. </li><li> In het kort, euthanaseren de zwangere vrouw met behulp van CO 2 narcose en cervicale dislocatie. <ol><li> Maak een insnijding in de buik, ontleden uit de baarmoeder door alo het snijden van de schepenng de binnenbocht van de baarmoeder, en breng de baarmoeder 10 cm petrischaaltje met ijskoude PBS. </li><li> Snijd de baarmoeder tussen elke embryo transfer naar een individuele 3,5 cm petrischaal met ijskoude PBS. Isoleer elk embryo zoals beschreven 15. </li><li> Open de pericardiale holte met fijne tang, verwijder het hart afstand van de longen en bloedvaten door te snijden in de aorta, vena cava, en pulmonaire aders en overdracht naar de 3,5 cm petrischaaltje met oktober </li><li> Laat het hart in evenwicht in oktober voor een paar seconden, dan dragen het hart in de 7 mm mal met oktober Richt de voorste wand van het hart naar de bodem van de vorm. </li></ol></li><li> Plaats voorzichtig de mal in vloeibare stikstof gekoelde 2-methylbutaan. Let er dan op toe 2-methylbutaan vloeistof aan de LGO of hart te raken. Bevriezen totdat de LGO is effen wit, dan is de overdracht van de mal om een ​​ijsemmer met droogijs. Ga verder met de volgende embryo. </li><li> Wrap cryomolds in folie en bewaar bij -80 ° C tot klaar voor cryosectioning. </li></ol> 1.2) Alternatief: Paraformaldehyde (PFA) vaststellen, cryoprotecting en oktober inbedding embryonale harten <ol><li> Vul de putjes van een 12-well weefselkweek plaat met 4% PFA in 1x PBS. </li><li> Ontleden de embryonale harten zoals beschreven in 1.1.3. Plaats elk hart in een putje met 4% PFA en vast te stellen op 4 ° CO / N. </li><li> Cryoprotection: met een plastic overdracht pipet, verplaatsen elk hart van een 1,5 ml microcentrifugebuis met 1,5 ml 15% sucrose in PBS en voorzichtig roeren bij 4 ° C totdat het hart zinkt naar de bodem van de buis (enkele uren tot O / N ). Transfer elk hart om een ​​1,5 ml microcentrifugebuis met 1,5 ml 30% sucrose in PBS en voorzichtig roeren bij 4 ° C totdat de hart zinkt naar de bodem van de buis (enkele uren tot O / N). </li><li> Met behulp van een plastic transferpipet, plaats de cryobeschermd hart in oktober en laat het evenwichtgedurende enkele minuten om overtollig sucrose te verwijderen, vervolgens over het hart in de 7 mm mal met oktober Richt de voorste wand van het hart naar de bodem van de vorm. </li><li> Bevries het hart in oktober door het plaatsen van de mal in vloeibare stikstof gekoelde 2-methylbutaan of droogijs. </li><li> Wikkel cryomolds in folie en bewaar bij -80 ° C tot klaar voor cryosectioning. </li></ol> 2. cryosectioning <ol><li> Stel cryostaat temperatuur tot -17 ° C. </li><li> Plaats cryomolds in de cryostaatkamer en equilibreren temperatuur gedurende 15-20 minuten. </li><li> Keer de cryomold en gebruik zachte druk op het hart blok te verdrijven uit de mal. Richt de voorste wand van het hart naar de top van de gevormde weefsel blok. </li><li> Zet een grote daling van oktober op de boorkop, en monteer het hart blok op de oktober daling te bevriezen op de boorkop. Houd de oriëntatie zodanig dat de voorste wand van het hart het verst van de boorkop. </li><li> Laad de boorkop en gemonteerd hijart blok op de houder cryostaat object. Stel zodat de hoek van het blad 3-5 ° ten opzichte van het monster. </li><li> Verzamel 10 micrometer secties op objectglaasjes die zijn voorbehandeld met een positief geladen coating (zie Materialen tabel). Laat volledig drogen voordat het opslaan bij -80 ° C. </li></ol> 3. Immuunfluorescentie <ol><li> Voor snap-ingevroren secties, te repareren en permeabilize weefsel in aceton gedurende 10 min in een zuurkast bij RT. </li><li> Voor ingevroren en PFA gefixeerde secties incuberen in PBS-0,1% Triton X-100 gedurende 20 min oktober verwijderen en PFA gefixeerde secties permeabilize. </li><li> Block 45 min in 1x blokkerende buffer, verdund in PBS. </li><li> Bij gebruik van een primair antilichaam opgewekt in muizen, incubeer in ezel of geit anti-muis IgG (H + L) monovalent Fab fragment 1: 100 verdund in PBS-0,1% Tween 20 gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur (zie bespreking). </li><li> Incubeer in primair antilichaam of antilichamen verdund in 1 x blokkeerbuffer gedurende 2 uur bij KT ofO / N bij 4 ° C (zie tabel van Materialen / Apparatuur voor specifieke verdunningen). </li><li> Was secties in 1x PBS driemaal gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Incubeer in Alexa Fluor-geconjugeerd secundair antilichaam 1: 500 verdund in blokkerende buffer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. </li><li> Was secties in 1x PBS driemaal gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. </li><li> Optioneel: Incubate in Hoechst kleurstof verdund 1: 2000 in PBS bij RT (beschermd tegen licht) tot kernen labelen, daarna spoelen met PBS. </li><li> Post-fix gemerkte secties 1% PFA gedurende 1 min bij kamertemperatuur. </li><li> Mount schuift anti-fade medium (met DAPI als kernen niet reeds gemerkt) door twee druppels drager aan elk uiteinde van de schuif en die vervolgens met een dekglaasje. Afdichting coverslips met nagellak. Store beschermd tegen licht bij 4 ° C tot klaar om de afbeelding. </li></ol> 4. confocale beeldvorming en beeldanalyse <ol><li> Zet de juiste lasergolflengten, camera, en confocale microscoop incLuding podium mover en z motor. Start de imaging software programma. Gebruik de 405, 488, en 561 lasergolflengten voor beeldvorming Hoechst-, Alexa 488- en Alexa 568-gekleurde coupes, respectievelijk. OPMERKING: Zie Materialen Tafel voor onze hardware en software specificaties. </li><li> Monteer de regelschuif (dekglaasje naar beneden voor een omgekeerde microscoop) op de dia podium. </li><li> Met behulp van de 4X doelstelling (zie Materialen tabel), vind het monster en interessegebied. Leg het beeld om te gebruiken als een kaart weergegeven wanneer de beeldvorming bij een hoge vergrotingsfactor. </li><li> Verwijder de glijbaan, waardoor minimale aanpassingen aan de dia podium. Wijziging van de 60x olie-immersie objectief (zie Materialen tabel), plaats een kleine druppel olie op het doel, en vervang de dia (dekglaasje naar beneden) op de dia podium. </li><li> Weer vinden monster. Stel het laservermogen, belichtingstijd en binning op de gewenste niveaus voor elk kanaal. LET OP: Wij gebruiken over het algemeen laservermogen van 0,8, blootstelling camera tijd van 100 msec en binning van 2 (see Materialen Tabel hardware en software specificaties); optimale instellingen moeten empirisch worden bepaald voor elk experiment. <ol><li> Zodra de optimale instellingen worden bepaald, gebruik dan dezelfde instellingen voor alle coupes binnen het experiment. Gebruik het histogram aan de optimale intensiteit bereik mee voor elk kanaal (deze informatie wordt gebruikt voor analyse). </li></ol></li><li> Genereer az stack met de overname functie: kies de juiste laser kanalen, kies dan de bovenste en onderste grenzen van de z-stack. Kies az stack stapgrootte die de helft van de waarde van de optische plakdikte door de software. Klik op &quot;run&quot; om de beelden te verzamelen. </li><li> Gebruik Fiji 16 of een vergelijkbaar programma voor beeldanalyse. Binnen Fiji, opent de z-stack-bestand met aangepaste kleur optiemodus en de kanalen te splitsen in aparte vensters. Open de &quot;Helderheid / Contrast&quot; tool van de Image pulldown-menu; binnen elk kanaal, set de optimale histogram intensiteitsbereik bepaald in 4.5.1. Deze kanaal reeksen van toepassing op alle z stapels wordt geanalyseerd. </li><li> Samenvoegen van de afzonderlijke kanalen in één foto samengesteld met behulp van Beeld-&gt; Kleur pulldown menu. </li><li> Maak een afgeplat z stapel uit de samengestelde afbeelding met behulp van de Beeld-&gt; Stacks-&gt; menu z project. Dit beeld zal aanzienlijk helderder het 3D-beeld dan zijn; pas de histogram intensiteit bereik voor de steekproef voor controles oververzadiging te voorkomen, en dezelfde instellingen toepassen om de experimentele afgevlakt z stack. </li><li> Om een 3D-beeld te genereren, gebruikt u eerst de Beeld-&gt; Stacks-&gt; menu 3D-project 17. Kies voor de x-as of Y-as van rotatie. Stel de slice afstand als hetzelfde aantal micron z stack stapgrootte. Kies de gewenste totale rotatie en stel de draaihoek increment op 1. Open vervolgens de Image J 3D Viewer uit de Plugins pulldown menu. Kies de samengestelde afbeelding gegenereerd in 4.8, display, volume, en zet de Resampling factor 1 of 2. </li></ol>

<ol><li>Risebro, C. A., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+ventricles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Scientific+World+Journal%22%5BJournal%5D)">Formation of the ventricles.</a> The Scientific World Journal. 6, 1862-1880 (2006).</li>
<li>Ji, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+cardiac+function+during+early+mouse+embryogenesis+coincides+with+entry+of+primitive+erythroblasts+into+the+embryo+proper%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper.</a> Circulation research. 92, 133-135 (2003).</li>
<li>Bennett, P. M., Maggs, A. M., Baines, A. J., Pinder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transitional+junction%3A+a+new+functional+subcellular+domain+at+the+intercalated+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">The transitional junction: a new functional subcellular domain at the intercalated disc.</a> Molecular biology of the cell. 17, 2091-2100 (2006).</li>
<li>Sparrow, J. C., Schock, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initial+steps+of+myofibril+assembly%3A+integrins+pave+the+way.+Nature+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 10, 293-298 (2009).</li>
<li>Kastner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+A+deficiency+and+mutations+of+RXRalpha%2C+RXRbeta+and+RARalpha+lead+to+early+differentiation+of+embryonic+ventricular+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Vitamin A deficiency and mutations of RXRalpha, RXRbeta and RARalpha lead to early differentiation of embryonic ventricular cardiomyocytes.</a> Development. 124, 4749-4758 (1997).</li>
<li>Zhang, W., Chen, H., Qu, X., Chang, C. P., Shou, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+ventricular+trabeculation%2Fcompaction+and+the+pathogenesis+of+the+left+ventricular+noncompaction+cardiomyopathy+%28LVNC%29%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+medical+genetics+Part+C%2C+Seminars+in+medical+genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of ventricular trabeculation/compaction and the pathogenesis of the left ventricular noncompaction cardiomyopathy (LVNC).</a> American journal of medical genetics Part C, Seminars in medical genetics. 163C, 144-156 (2013).</li>
<li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+localization+of+alpha3beta1+integrin+isoforms+in+association+with+myofibrillogenesis+during+cardiac+myocyte+development+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+adhesion+and+communication%22%5BJournal%5D)">Cellular localization of alpha3beta1 integrin isoforms in association with myofibrillogenesis during cardiac myocyte development in culture.</a> Cell adhesion and communication. 7, 85-97 (1999).</li>
<li>Lu, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vinculin%2Fsarcomeric-alpha-actinin%2Falpha-actin+nexus+in+cultured+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The vinculin/sarcomeric-alpha-actinin/alpha-actin nexus in cultured cardiac myocytes.</a> The Journal of cell biology. 117, 1007-1022 (1992).</li>
<li>Schultheiss, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+distribution+of+subsets+of+myofibrillar+proteins+in+cardiac+nonstriated+and+striated+myofibrils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Differential distribution of subsets of myofibrillar proteins in cardiac nonstriated and striated myofibrils.</a> The Journal of cell biology. 110, 1159-1172 (1990).</li>
<li>Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Costameres%2C+focal+adhesions%2C+and+cardiomyocyte+mechanotransduction.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">Costameres, focal adhesions, and cardiomyocyte mechanotransduction. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 289, H2291-H2301 (2005).</li>
<li>Sinn, H. W., Balsamo, J., Lilien, J., Lin, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+novel+Xin+protein+to+the+adherens+junction+complex+in+cardiac+and+skeletal+muscle+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Localization of the novel Xin protein to the adherens junction complex in cardiac and skeletal muscle during development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 1-13 (2002).</li>
<li>Lu, S., Borst, D. E., Horowits, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-RAP+expression+during+mouse+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">N-RAP expression during mouse heart development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 201-212 (2005).</li>
<li>Hirschy, A., Schatzmann, F., Ehler, E., Perriard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+cardiac+cytoarchitecture+in+the+developing+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Establishment of cardiac cytoarchitecture in the developing mouse heart.</a> Developmental biology. 289, 430-441 (2006).</li>
<li>Whitman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmoplakin+and+talin2+are+novel+mRNA+targets+of+fragile+X-related+protein-1+in+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Desmoplakin and talin2 are novel mRNA targets of fragile X-related protein-1 in cardiac muscle.</a> Circulation research. 109, 262-271 (2011).</li>
<li>Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryonic+development+in+a+serum-free+whole+embryo+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22BMC%22%5BJournal%5D)">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC. 11, 274(2010).</li>
<li>Swope, D., Cheng, L., Gao, E., Li, J., Radice, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+cadherin-binding+proteins+beta-catenin+and+plakoglobin+in+the+heart+leads+to+gap+junction+remodeling+and+arrhythmogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Loss of cadherin-binding proteins beta-catenin and plakoglobin in the heart leads to gap junction remodeling and arrhythmogenesis.</a> Molecular and cellular biology. 32, 1056-1067 (2012).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nature. 7, 168-169 (2010).</li>
<li>Shi, S. R., Shi, Y., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+immunohistochemistry%3A+review+and+future+prospects+in+research+and+diagnosis+over+two+decades%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis over two decades.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 59, 13-32 (2011).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> The Journal of cell biology. 172, 9-18 (2006).</li>
<li>Risebro, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prox1+maintains+muscle+structure+and+growth+in+the+developing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Prox1 maintains muscle structure and growth in the developing heart.</a> Development. 136, 495-505 (2009).</li>
<li>Ehler, E., Rothen, B. M., Hammerle, S. P., Komiyama, M., Perriard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibrillogenesis+in+the+developing+chicken+heart%3A+assembly+of+Z-disk%2C+M-line+and+the+thick+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Myofibrillogenesis in the developing chicken heart: assembly of Z-disk, M-line and the thick filaments.</a> Journal of cell science. 112 (Pt 10), 1529-1539 (1999).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De optimale fixatie van het weefsel techniek en verdunning moet empirisch worden bepaald voor elk antilichaam. In onze handen, snap-bevriezen is superieur aan PFA fixatie enkele cardiomyocyten antigenen, zoals s-α-actinine, β-catenine, β1-integrine, tropomyosine, taline (niet getoond) en N-cadherine; Daarentegen PFA fixatie levert superieure resultaten voor focale adhesie kinase (niet getoond). Het eiwit crosslinks gevormd door PFA kan epitopen en beperken antilichaam binding te maskeren; antigen retrieval kan nodig zijn in dergelijke gevallen, en methoden voor het antigen retrieval kunnen op een andere 20 worden gevonden. PFA concentratie of lengte van fixatie kan worden verlaagd tot epitoop maskering verminderen en optimale omstandigheden empirisch bepaald voor elk antilichaam en bij elk ontwikkelingsstadium. Passende negatieve controles moeten worden gebruikt bij het karakteriseren van een nieuw antilichaam of cardiale mutant, inclusief pre-immuun serum als het primaire antilichaam controle en een &quot;no primair antilichaam&quot; control. Gebruik van knockout muizen een goede negatieve controle maar vroege sterfte voorkomt het gebruik van vele genproducten bestudeerde. Gebruik van adequate volumes aan experimentele en controle dia&#39;s volledig onder te dompelen in dezelfde immunofluorescentie blokkeren, antilichaam, en wassen oplossingen was belangrijk als zachte wiegen van dia&#39;s tijdens de incubatie om een ​​uniforme belichting van de secties om de oplossingen te garanderen was. Deze aanpak geminimaliseerd technische variabiliteit in kleuring tussen secties en dia&#39;s binnen een experiment. Wanneer de kosten beperkt het antilichaam oplossing volume, gebruik maken van een uitstrijkje pen om stroom van oplossingen beperken buiten het weefsel secties en dia&#39;s in een vochtige kamer te houden tijdens lange incubatie. Als een monoklonaal muis primair antilichaam - en dus een anti-muis secundair antilichaam - wordt gebruikt, wordt een tweede blokkerende stap endogene muis immunoglobulinen omvatten die noodzakelijk (stap 3.4) om niet-specifieke achtergrondsignaal te verlagen. Gepaste microscopie en beeldverwerking technieken zijn cruciaal voor het verkrijgen van biologisch accurate informatie 21. Het histogram toont de verdeling van pixels op elk intensiteitsniveau (0-65.535 niveaus beeld een 16-bit) voor elke kleur. Achtergrond, kan de helderheid en het contrast worden aangepast door het instellen van een intensiteit weergave bereik dat het histogram piek flankeert; zinvolle vergelijkingen tussen de condities te maken, moeten dezelfde instellingen tussen controle en experimentele omstandigheden worden gebruikt. Dit protocol voorziet in een betrouwbare methode om cardiomyocyte rijping en ontwikkeling te analyseren in de moedertaal embryonale muis hart. Terwijl immunofluorescentie cardiomyocyt-eiwitten wordt vaak gebruikt om hartspiercellen tijdens de ontwikkeling markeren weinig studies met technieken die hoge-resolutie analyse van myofibril structuur en de opkomst geïntercaleerde schijven en costameres 12-14,22,23 mogelijk. Deze techniek kan worden gebruikt voor in vivo beoordeling van mutaties die ontwikkelingsstoornissen hartafwijkingen veroorzaken, als een middel ter identificatie van veranderingen in cardiomyocyte rijping die licht kunnen werpen op de mechanismen van structurele afwijkingen.

Tijdens de ontwikkeling, hart weeën beginnen kort na hartspiercellen migreren naar de middellijn en vormen de lineaire hart buis 1,2. De sarcomeer is de fundamentele contractiele eenheid binnen de cardiomyocyte; deze zeer georganiseerde cytoskeletstructuur bevat actine filamenten verankerd aan de Z-disc sarcomeer α-actinine (s-α-actinine) en myosine vezels verankerd aan de M-lijn (figuur 1). Zoals de cardiomyocyte rijpt, sarcomeres assembleren in serie te myofibrils die zich uitstrekken over de cel te vormen. Myofibrillen zijn verankerd aan de einden van de cardiomyocyten van de geïntercaleerde schijf, de cel-cel junctional structuur die een over- kruising met een deelverzameling van Z schijfvormige elementen zoals s-α-actinine 3, adherens bevat junction eiwitten zoals N-cadherine en β catenine, gap junction eiwitten en desmosomen (figuur 1) 4. Langs de lengterichting membraan, de Z-schijven van perifere myofibrillen ookhechten aan het celmembraan via costameres; deze gespecialiseerde focale adhesies vormen een anker tussen de myofibril, plasmamembraan en extracellulaire matrix aanvullende structurele steun aan de cardiomyocyten voorzien (figuur 1) 4. Vroeg in de ontwikkeling van het hart, zijn hartspiercellen gerangschikt in vinger-achtige projecties bekend als trabeculae die uitsteken in de ventriculaire ruimte en bevatten relatief volwassen myofibrils 5. Zoals ontwikkeling van het hart opbrengst, de hartspiercellen in de sub-epicardial regio woekeren met de compacte myocard dat de ventriculaire muren bestaat, maar sarcomeer en myofibril assemblage zijn vertraagd in vergelijking met trabeculair myocard 5,6 te vormen. Modellen van sarcomeer en myofibril samenstel zijn grotendeels het gevolg immunofluorescentie studies op gekweekte cardiomyocyten 7-10, die eenvoudig zijn maar missen een driedimensionale omgeving, de bloedstroom, en contacten met andere hartcels aanwezig in vivo. Hoge-resolutie structurele studies met behulp van immunofluorescentie in de muis embryonale hart zijn technisch uitdagend, en weinig studies hebben de opkomst van geïntercaleerd schijven en costameres tijdens muis ontwikkeling van het hart onderzocht. De adherens junction eiwit β catenine lijkt te lokaliseren om geintercaleerde schijven van embryonale dag (E) 17,5 11, N-cadherine lokaliseert om lineaire structuren die geïntercaleerd schijven door E18.5 12 versus postnatale dag 0 13 kan vertegenwoordigen, en costameres zijn geconstateerd E18.5 14, maar deze eiwitten weer te diffuus en meer continue membraan distributie in eerdere ontwikkelingstijd punten 11-13. We beschrijven hier een eenvoudige en reproduceerbare werkwijze voor immunokleuring en fluorescentie microscopie van doorsnede muis embryonale hart dat zorgt voor gedetailleerde analyse van myofibril en cardiomyocyten ontwikkeling, waaronder de opkomst van intercalated discs zo vroeg E12.5 en ontluikende costameres op E16.5. Dit protocol kan nuttig zijn voor het sonderen van de effecten van de mutaties op de sarcomeer vorming evenals myofibril en cardiomyocyte rijping zijn.

<table><tbody><tr><td>Cryomold, Disposable Base Mold, 7x 7 mm</td><td>Richard-Allen Scientific</td><td>58949</td><td>Deze maat niet beschikbaar bij Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Cryomold, Disposable Base Mold, 15 x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-159</td><td>Ook verkrijgbaar bij Richard-Allen Scientific, catalogusnummer 58950</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) medium 4583</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>2-methyl butaan</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td>Gebruik verse 4% oplossing in 1x PBS, pH 7.2-7.4. </td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Gebruik 15% en 30% oplossingen in 1X PBS.</td></tr><tr><td>Disposable transfer pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>S30467-1</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>'Plus' geeft een positief geladen coating aan en is cruciaal voor het behoud van weefselhechting op de slide.</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Western Blocking Agent</td><td>Roche</td><td>11921673001</td><td>Blocking buffer voor immunofluorescentie, wanneer secundaire antilichamen van verschillende soorten zijn. Verdun tot 1x in PBS. </td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-007-003</td><td>Geiten Anti-mouse IgG (H+L) ook beschikbaar. Voor het blokkeren van endogene immunoglobulinen.</td></tr><tr><td>Anti-s-&#945;-actinine antilichaam</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td>Muis monoklonaal, clone EA53. Verdun 1:400 voor snap-frozen/aceton-gefixeerde secties, verdun 1:300 voor PFA-gefixeerde secties. Voor incubatie op muisweefsel, blokkeer endogene muis immunoglobulinen met anti-muis IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td></tr><tr><td>Anti-&#946;catenin antilichaam</td><td>Cell Signaling</td><td>9587s</td><td>Konijn polyklonaal. Vereist snap-freezing/aceton fixatie. Verdun 1:400.</td></tr><tr><td>Anti-&#946;1 integrin antilichaam</td><td>R&amp;D</td><td>AF2405</td><td>Geiten polyklonaal. Verdun 1:200. Snap-frozen/aceton-gefixeerde weefselkleuring is superieur aan PFA-gefixeerd weefsel.</td></tr><tr><td>Anti-tropomyosine antilichaam</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa</td><td>CH1</td><td>Muis monoklonaal. Vereist snap-freezing/aceton fixatie. Verdun 1:200. Voor incubatie op muisweefsel, blokkeer endogene muis immunoglobulinen met anti-muis IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td></tr><tr><td>Anti-N-cadherine antilichaam</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7939</td><td>Konijn polyklonaal. Verdun 1:200. Snap-frozen/aceton-gefixeerde weefselkleuring is superieur aan PFA-gefixeerd weefsel.</td></tr><tr><td>Anti-talin antilichaam</td><td>Sigma</td><td>T3287</td><td>Muis monoklonaal, clone 8d4. Vereist snap-freezing/aceton fixatie. Verdun 1:200. Voor incubatie op muisweefsel, blokkeer endogene muis immunoglobulinen met anti-muis IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td></tr><tr><td>Anti-fosfotyrosine 397 focale adhesiekinase antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>700255</td><td>Konijn monoklonaal antilichaam. Vereist PFA fixatie. Verdun 1:500.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antilichaam</td><td>Life Technologies</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antilichaam</td><td>Life Technologies</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antilichaam</td><td>Life Technologies</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Antilichaam</td><td>Life Technologies</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 kleurstof</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>Kernkleuring</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Dekvlakken</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>MLC 400B Monolithic Laser Combiner Laser box</td><td>Keysight (voorheen Agilent)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clara Interline CCD camera</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti inverted microscoop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1 Spinning disk confocal scanner unit</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Apochromat 4X luchtobjectief</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Numerieke apertuur (NA) 0.2, Werkafstand (WD) 15.7 mm</td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Apochromat VC 60x olie-immersie objectief (MRD01602)</td><td>Nikon&nbsp;&nbsp;</td><td>NA 1.4, WD 0.13 mm</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements Imaging Software</td><td>Nikon</td><td>http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm</td><td></td></tr><tr><td>Beeldanalyse software</td><td>Fiji</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse van cardiomyocyte development behulp immuunfluorescentie in embryonale muis hart

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Tijdens de ontwikkeling van het hart, de generatie van myocardiale specifieke structurele en functionele eenheden zoals sarcomeres, contractiele myofibrils, tussengevoegde schijven en costameres vereist de gecoördineerde assemblage van meerdere componenten in tijd en ruimte. Verstoring in het installeren van deze componenten leidt tot ontwikkelingsstoornissen hartafwijkingen. Immunofluorescentiekleuring technieken worden algemeen gebruikt in gekweekte cardiomyocyten te myofibril rijping sonde, maar ex vivo benadering wordt beperkt door de mate waarin myocyten volledig differentiëren in cultuur ontbreken van normale in vivo mechanische input, en afwezigheid van endocardiale signalen. Toepassing van immunofluorescentie technieken voor de studie van ontwikkeling muizenhart is wenselijk maar technisch uitdagend en methoden vaak niet voldoende gevoeligheid en resolutie te sarcomeren zichtbaar in de vroege stadia van ontwikkeling van het hart. Hier beschrijven we een robuuste en reproduceerbare methode samen immunostain multiple eiwitten of om samen te visualiseren een fluorescerend eiwit met immunofluorescentiekleuring in de embryonale muis hart en gebruiken deze methode te ontwikkelen myofibrils, geïntercaleerd schijven, en costameres analyseren. Deze werkwijze kan verder worden toegepast cardiomyocyten structurele veranderingen veroorzaakt door mutaties die leiden tot ontwikkelingsstoornissen hartafwijkingen beoordelen.

De figuren 2 tot en met 6 tonen typische resultaten voor co-kleuring van verschillende eiwitten in een snap-bevroren en aceton gefixeerde hart. Het antilichaam tegen B-α-actinine reproduceerbaar gemerkte Z-schijven en geïntercaleerde schijven met hoge specificiteit en minimale achtergrond (Figuren 2A, 3A, 4A, 5A, 6A en 6C) Figuur 6 toont dat de anti-muis IgG (H + L) monovalente Fab fragment blokkeert effectief de endogene muis IgG binding van anti-muis secundaire antilichamen. Het antilichaam tegen adherens junction eiwit β catenine gebonden het membraan zowel cardiomyocyten als niet-cardiomyocyt cellen en co-lokalisatie met s-α-actinine opgetreden bij veronderstelde tussengevoegde schijven op E16.5 (figuur 2C en D), zoals verwacht van de β catenine kleuringspatroon in het volwassen hart 18. β1 integrine immunofluorescentie in het embryonale hart is bijzonder uitdagend en vaak niet in slaagt om focale adhesies 14 te identificeren, maar β1 integrine kleuring in deze studies is gebleken signaal met dezelfde frequentie als s-α-actinine label Z-schijven, mogelijk als gevolg van ontluikende costameres vormen op E16.5 (Figuur 3D). Bij E12.5, s-α-actinine en tropomyosine (sarcomeer dunne filament eiwit) immunofluorescentie bleek een kleuringspatroon met regelmatige periodiciteit in trabeculaire hartspiercellen consistent met volwassen myofibrils in deze cellen (Figuren 4A en 5A voor s-α-actinine; Figuur 4B voor tropomyosine). N-cadherine kleuring trabeculaire cardiomyocyten op E12.5 harten verzorgen colocaliseren met gebieden van intense s-α-actinine kleuring (figuur 5B - D en figuur 6A - C) eventueel voor tussengevoegde schijven. Incontrast aan trabeculair myocytes, s-α-actinine in de compacte zone was meer punctate dan lineair, en tropomyosine kleuring was diffuus plaats van lineair (Figuur 4A en 4B). Aldus kan sarcomeer assemblage later in compact voorkomen opzichte trabeculaire myocardium. Bovendien differentiële patronen van s-α-actinine en tropomyosine in de compacte zone suggereren dat s-α-actinine organiseert in puncta en onvolwassen Z-discs vroeg, terwijl tropomyosine opname in de dunne gloeidraad een later gebeurtenis myofibril samenstel kan zijn. Figuur 7, Film 1 en Film 2 tonen typische resultaten van een PFA-vaste E12.5 embryonale hart. In deze voorbeelden werd een LifeAct-RFPruby transgeen embryo voor beeldvorming; de LifeAct-RFPruby transgen 19 etiketten draadvormige actine maar vereist PFA fixatie. Z-schijven gelabeld met s-α-actinine waren gemakkelijk te visualiseren in de meeste gebieden, maar de signaal-ruisverhouding Decre<html> ased vergelijking met ingevroren hart secties (figuur 7A); Dit signaal was typerend voor s-α-actinine immunofluorescentie in PFA-gefixeerd weefsel, waarin epitopen kunnen worden gemaskeerd door eiwit cross-links. Figuur 7B toont co-visualisatie van draadvormige actine en immunolabeled s-α-actinine binnen myofibrils (pijlpunten) en filamenteuze actine binnen endocardiale cellen naast trabeculaire myocyten (pijlen). Drie-dimensionale beeldreconstructie onthulde aanvullende gegevens: individuele cardiomyocyten werden gemakkelijker onderscheiden, myofibrils binnen cardiomyocyten werden ongeveer parallel aan elkaar, maar individuele cardiomyocyten werden georiënteerd onder verschillende hoeken met elkaar (Figuur 7C en D, film 1 en film 2 ). De dichte benadering tussen endocardiale cellen cardiomyocyten werd beter gewaardeerd in de driedimensionale uitzichten. <html> &quot;&gt; <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig1.jpg" /> Figuur 1. Cardiomyocyte sarcomeres, geïntercaleerd schijven, en costameres. De Z-disc verankert actine filamenten, terwijl de M-lijn verankert myosine vezels, die de actine filamenten overlappen. De sarcomeer bestaat uit een Z-disc - M lijn - Z-schijf unit. Meerdere sarcomeren in serie maken een myofibril. Het laterale uiteinde van het myofibril voegt in de transversale rand van de cardiomyocyten in een gespecialiseerde cel-cel junctionele structuur die de geïntercaleerde schijf. Perifere myofibrils aansluiten op de longitudinale cardiomyocyte plasmamembraan via costameres, die focale adhesies met de extracellulaire matrix tussen hartspiercellen vormen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> = Upload / 52644 / 52644fig2.jpg &quot;/&gt; Figuur 2. s- α -actinin en β catenine immunofluorescentie op embryonale dag 16,5. Het hart werd uitgesneden, snap bevroren, cryosectioned, aceton gefixeerde, en immunostained behulp van (A) muis monoklonaal kloon EA53 antilichaam tegen s-α-actinine, die gelabeld cardiomyocyte Z-schijf en geïntercaleerd schijven, en (B) konijnen polycloncal antilichaam tegen de adherens knooppunt eiwit β-catenine. (C) Samengevoegd beelden tonen s-α-actinine en β catenine vlekken. (D) vergroot gebied van interesse van paneel C ; sterretjes merk veronderstelde geïntercaleerd schijven met co-lokalisatie van s-α-actinine en β catenine. Beelden werden verkregen uit het perifere linker ventriculaire wand of compact myocardium, de epicardiale laag linksboven panelen AC. Intensiteit histogramscherm range 460-1600 (uit of mogelijke 0-65535) voor zowel de s-α-actinine / 488 nm en β catenine / 561 nm laser kanalen. Schaalbalk 10 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig3.jpg" /> Figuur 3. s- α -actinin en β 1 integrine immunofluorescentie op embryonale dag 16,5. Het hart werd uitgesneden, snap bevroren, cryosectioned, aceton-vaste en immunostained behulp van (A) muis monoklonaal kloon EA53 antilichaam tegen s-α-actinine en (B) geiten polyklonaal antilichaam tegen het focale adhesie eiwit β1 integrine. (C) Samengevoegd beelden tonen β1 integrine in cardiomyocyten als niet-cardiomyocyt cellen. Opmerking zowel diffuse enpunctata β1 integrine-signaal in cardiomyocyten (D) vergroot gebied van interesse van paneel C. Opmerking punctate, periodieke β1 integrine kleuring (pijlen) met een frequentie zoals nabijgelegen s-α-actinine-kleuring in Z-schijven.; deze structuren kunnen costameres vertegenwoordigen. Beelden werden verkregen van de linker ventrikel compacte myocardium. Intensiteit histogramscherm range 460-1200 (van de mogelijke 0-65535) voor de s-α-actinine / 488 nm laser kanaal en 460-600 voor de β1 integrine / 561 nm laser kanaal. Schaalbalk 10 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig4.jpg" /> Figuur 4. s- α -actinin en tropomyosine immunofluorescentie op embryonale dag 12.5: myofibril organisatie in<html> trabeculaire en compacte myocardium. Harten van littermate embryo&#39;s werden uitgesneden, snel bevroren, cryosectioned, aceton gefixeerd en immuungekleurd met (A) muizen monoklonaal antilichaam tegen kloon EA53 s-α-actinine en (B) muizen monoklonaal antilichaam tegen het myofibril dunne gloeidraad eiwit tropomyosine (Developmental Studies Hybridoma Bank CH1). Trabeculaire (pijlen) en compacte myocard (pijlpunten) zijn aangegeven. Opmerking lineaire s-α-actinine kleuring regelmatig periodiciteit in het trabeculaire myocardium, tegenover een reeks kleurpatronen waaronder puncta en lineaire kleuring in de compacte laag (A). Merk ook op lineaire tropomyosine kleuring met regelmatige periodiciteit in het trabeculaire myocard, maar meer diffuse kleuring in compacte myocard. Intensiteit histogramscherm range 460-1,400 (van de mogelijke 0-65535) voor de s-α-actinine kanaal en 460-1,000 voor de tropomyosine kanaal. Schaalbalk 10 micrometer.&quot;Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig5.jpg" /> Figuur 5. s- α -actinin en N-cadherine immunofluorescentie op embryonale dag 12.5:. Myofibrils en geïntercaleerd schijven in trabeculaire hartspiercellen Het hart werd uitgesneden, snap bevroren, cryosectioned, aceton-vaste en immunostained behulp van (A) muis monoklonaal kloon EA53 antilichaam tegen B-α-actinine en (B) konijnen polyklonaal antilichaam tegen het focale adhesie eiwit N-cadherin. 0,2 micrometer optische schijfjes werden verzameld als az stack, en z stapels werden afgevlakt om de beelden te genereren. (C) Samengevoegd afgevlakt stapels tonen zowel N-cadherine en s-α-actinine kleuring binnen trabeculaire hartspiercellen als well als kernen gelabeld met Hoechst kleurstof (D) vergroot gebied van interesse van paneel C.; sterretjes markeren geintercaleerde schijven met co-lokalisatie van s-α-actinine en N-cadherine. Intensiteit histogramscherm range 470-1,200 (van de mogelijke 0-65535) voor de Hoechst / 405 nm laser kanaal en 470-2,000 voor zowel de s-α-actinine / 488 nm en N-cadherine / 561 nm laser kanalen. Schaalbalk 10 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig6.jpg" /> Figuur 6. Anti-muis IgG (H + L) monovalent Fab fragment blokkeert effectief de endogene muis IgG binding van anti-muis secundaire antilichamen. De E12.5 embryonale hart werd uitgesneden, snel ingevroren, cryosectioned, aceton gefixeerd en immunogekleurd. <strong&gt; (AC) Secties werden geblokkeerd met 1x blokkerende buffer gevolgd door anti-muis IgG monovalente Fab fragment, blootgesteld aan monoklonaal kloon EA53 primair antilichaam tegen B-α-actinine en konijnen polyklonaal primair antilichaam tegen N-cadherin, gewassen en blootgesteld Alexa Fluor 488 anti-muis en Alexa Fluor 586 anti-konijn secundaire antilichamen. (A) Samengevoegd beeld met behulp van intensiteit histogramscherm range 480-2500 (van de mogelijke 0-65535). Sterretjes nota gebieden waar N-cadherine-signaal is beperkt tot het dwarse einde van trabeculair cardiomyocyten, die waarschijnlijk vertegenwoordigt ontluikende tussengevoegde schijven. (B) N-alleen-cadherine kanaal met histogram weergavebereik 480-2,500. (C) s-α -actinin-only kanaal met intensiteit histogramscherm range 480-2,500. (DG) Secties werden geblokkeerd met 1x blokkeringsbuffer alleen (geen anti-muis IgG monovalente Fab fragment blokkeren stap), blootgesteld aan konijnenpolyklonaalprimair antilichaam tegen N-cadherine (alleen niet monoklonaal primair antilichaam), gewassen en blootgesteld aan Alexa Fluor 488 anti-muis Alexa Fluor 586 anti-konijn secundaire antilichamen. (D) Samengevoegd beeld die histogram weergavebereik 480-2500. (E) N-only-cadherine kanaal met intensiteit histogramscherm range 480-2500. (F) kanaal met intensiteit histogramscherm range 480-2,500 s-α-alleen-actinine. (G) kanaal met behulp van s-α-alleen-actinine hooggevoelige histogram weergavebereik 480-530, die achtergrond detectie van endogene muis IgG toont in de afwezigheid van anti-muis IgG monovalente Fab fragment blokkeringsstap. (HK) Secties werden geblokkeerd met 1x blokkerende buffer gevolgd door anti-muis IgG eenwaardig Fab fragment, blootgesteld aan konijnen polyklonaal primair antilichaam tegen N-cadherine (geen monoklonaal primair antilichaam), gewassen en blootgesteld aan Alexa Fluor 488 anti-muis en Alexa Fluor 586 anti-konijn secundaire antilichamen. (H) Samengevoegd beeld met behulp van intensiteit histogramscherm range 480-2,500. (I) N-only-cadherine kanaal met intensiteit histogramscherm range 480-2,500. (J) s-α-actinin- alleen kanaal met behulp van de intensiteit histogramscherm range 480-2,500. (K) s-α-alleen-actinine kanaal met een hoge gevoeligheid intensiteit histogram range 480-530, die het gebrek aan achtergrond endogene muis IgG detectie toont wanneer de anti-muis IgG monovalente Fab fragment blokkeren stap wordt gebruikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig7.jpg" /> Figuur 7. s- α -actinin en actine organisatie in trabeculaire cardiomyocytes op embryonale dag 12.5. De LifeAct-RFPruby transgene muis lijn werd gebruikt om draadvormige actine 19 visualiseren, terwijl de muis monoklonaal kloon EA53 antilichaam tegen s-α-actinine werd gebruikt om de Z-schijven en geïntercaleerd schijven te labelen. Embryo&#39;s werden PFA gefixeerd. 0,2 micrometer optische schijfjes werden verzameld als az stack (A) De afgevlakte z stack blijkt dat s-α-actinine kleuring was meer diffuus in PFA-gefixeerd weefsel dan in de snap-bevroren en aceton vaste rubrieken (figuren 2-5).. (B ) Flattened z stapel toont zowel draadvormige actine en s-α-actinine. Draadvormige actine fluorescentie gelokaliseerde tussen Z-schijven binnen myofibrils (pijlpunten). Filamenteuze actine fluorescentie werd waargenomen bij endocardiale cellen die het trabeculaire myocyten (pijlen) lijn. (C) Drie-dimensionale weergave van de trabeculaire cardiomyocyten, gezien vanaf de bovenkant van de stapel. (D) Drie-dimensionale weergave vanhet trabeculaire cardiomyocyten, gezien vanaf de onderkant van de stapel. Intensiteit histogramscherm range 470-900 (van de mogelijke 0-65535) voor zowel de 488 nm laser kanaal en voor de 561 nm laser kanaal A en B; weergave range 460-800 voor beide kanalen in C en D. Schaalbalk 10 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/Movie1.mov">Film</a> 1. 360 ° roterende 3D-weergave van s- α -actinin en actine organisatie in trabeculaire hartspiercellen op embryonale dag 12.5. Het beeld stapel uit figuur 6 werd teruggegeven in drie dimensies met behulp van de Image J 3D Viewer plugin binnen de Fiji-beeldanalyse programma. Intensiteit histogramscherm range 470-800 (van de mogelijke 0-65535) voor zowel de 488 nm en 561 nm laser kanalen. &lt;/ P&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/Movie2.mov">Movie</a> 2. Geselecteerde 3D ​​uitzicht s- α -actinin en actine organisatie in trabeculaire hartspiercellen op embryonale dag 12.5. Het beeld stapel uit figuur 6 werd teruggegeven in drie dimensies met behulp van de Image J 3D Viewer plugin binnen de Fiji-beeldanalyse programma. Kleine rotaties rond de x, y en z-assen bleek relatief uitgelijnd myofibrils binnen hartspiercellen maar slechte afstemming tussen de meeste hartspiercellen. Kleine rotaties toonde ook de nauwe onderlinge aanpassing van de endocardiale cellen ontbreekt s-α-actinine rond hartspiercellen. Intensiteit histogramscherm range 470-800 (van de mogelijke 0-65535) voor zowel de 488 nm en 561 nm laser kanalen.

Mutaties die leiden tot aangeboren hartafwijkingen profiteren van in vivo onderzoek van de hartstructuur tijdens de ontwikkeling, maar hoogwaardige structurele studies in het embryonale muishart zijn technisch uitdagend. Hier presenteren we een robuuste immunofluorescentie- en beeldanalysemethode om cardiomyocyt-specifieke structuren in het zich ontwikkelende muishart te beoordelen.

Analyse van Cardiomyocyte Development behulp Immuunfluorescentie in Embryonale Muis Hart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Het algemene doel van deze procedure is om de rijping van myofibrillen en cardiomyocyten in het ontwikkelende embryonale muizenhart te beoordelen. Dit wordt bereikt door het embryonale hart eerst te oriënteren en te vriezen in een snijmedium. Vervolgens wordt het hart in de juiste oriëntatie cryosectie gedaan.Vervolgens ondergaan de hartsecties immunofluorescente labeling van de eiwitten van belang. Ten slotte wordt er confocale microscopie uitgevoerd op de immunogekleurde hartsecties. Uiteindelijk worden twee- en driedimensionale beeldanalyses gebruikt om de ontwikkeling van MyFi en andere cardiomyocytstructuren aan te tonen.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de cardiale ontwikkeling, zoals de wijze waarop mutaties en cardiale genen de MyFi-assemblage en het ontstaan van specifieke structuren, zoals intercalaire schijven en costumers, beïnvloeden. Om embryonale harten snel te invriezen, wordt een Petri-schaal van 3,5 centimeter in een chemische zuurkast gevuld met optimal cutting temperature- of OCT-medium. Koel 2-methylbutaan af in vloeibare stikstof.Nadat de embryonale muizenharten volgens het tekstprotocol zijn geïsoleerd, worden de harten in OCT geplaatst en enkele seconden gelaten om te equilibreren voordat ze worden overgebracht naar een vorm van zeven millimeter die OCT bevat. Richt de binnenwand van het hart naar de bodem van de vorm. Plaats de vorm voorzichtig in het met vloeibare stikstof gekoelde 2-methylbutaan.Zorg ervoor dat het 2-methylbutaanvloeistof het OCT of het hart niet raakt totdat het OCT egaal wit is. Plaats de mal vervolgens in een ijsemmer met droogijs. Zodra alle harten bevroren zijn, worden de cryomalen in folie gewikkeld en bewaard bij -80 °C tot aan de cryosectie.Om embryonale harten te fixeren, gebruik 4% PFA in PBS om de putjes van een 12-wells folie kweekplaat te vullen. Nadat de embryonale harten volgens het tekstprotocol zijn gedisseceerd, plaatst u elk hart in een putje met PFA en fixeert u deze gedurende één nacht bij vier graden Celsius. Om de harten cryoprotectief te behandelen, verplaatst u met een plastic transferpipet elk hart naar een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter met 1,5 milliliter 15% sucrose in PBS en schudt u voorzichtig bij vier graden Celsius totdat het hart naar de bodem van het buisje zinkt. Breng vervolgens elk hart over naar 30% sucrose in PBS en schud voorzichtig bij vier graden Celsius totdat het hart naar de bodem van het buisje zinkt.Bevries de embryo's in OCT zoals eerder in deze video is aangetoond. Nadat de cryovormen in de cryostaatkamer zijn geplaatst en zijn geëquilibreerd tot -17 °C, wordt de cryovorm omgekeerd en wordt er lichte druk uitgeoefend om het hartblok uit de vorm te drukken. Richt de anteriorwand van het hart naar de bovenkant van het gevormde weefselblok.Plaats een grote druppel OCT op de houder en monteer het hartblok op de OCT-druppel. Houd de oriëntatie zodanig aan dat de voorwand van het hart het verst van de houder afligt. Laat het hart op de houder invriezen.Plaats de klem en het gemonteerde hartblok op de objecthouder van de cryostaat. Stel dit zo in dat de hoek van het mes drie tot vijf graden ten opzichte van het monster bedraagt. Verzamel coupes van 10 micrometer op microscopiepreparaatjes die vooraf zijn behandeld met een positief geladen coating.Laat de monsters volledig drogen voordat ze bij -80 °C worden bewaard voor het uitvoeren van immunofluorescentie. Na het fixeren en/of het verwijderen van OCT uit de coupes, wordt 1x blokkeerbuffer verdund in PBS gebruikt om gedurende 45 minuten te blokkeren onder zachte schudding. Indien er een primair antilichaam wordt gebruikt dat in muis is gegenereerd, voeg dan een donkey of goat anti-mouse IgG H plus L monovalent FAB-fragment toe, verdund 1:100 in PBS met 0,1% tween 20, en incubeer dit gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur onder zachte schudding.Voeg het primaire antilichaam of de primaire antilichamen toe, verdund in één x blokkeringsbuffer, en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur of overnight bij vier graden Celsius. Was na de incubatie de coupes drie keer gedurende 10 minuten met één XPBS. Voeg bij kamertemperatuur een geconjugeerd secundair antilichaam, verdund 1:500 in blokkeringsbuffer, toe aan de monsters en incubeer gedurende twee uur, beschermd tegen licht.Was de coupes bij kamertemperatuur drie keer gedurende 10 minuten met XPBS, terwijl ze worden beschermd tegen licht. Monteer de objectglazen in anti-fade medium door twee druppels medium op elk uiteinde van het objectglas aan te brengen en dek dit af met een dekglas. Gebruik nagellak om de dekglazen af te dichten.Bewaar het bij 4 °C, beschermd tegen licht, tot het moment van beeldvorming. Gebruik een 4x objectief en laserfluorescentie om het monster en het gebied van interesse te lokaliseren. Leg het beeld vast om als referentiekaart te gebruiken.Bij beeldvorming met een hoge vergroting: verwijder het preparaat door minimale aanpassingen aan de objecttafel te maken. Schakel vervolgens over naar een 60 x olie-immersieobjectief.Plaats een kleine druppel olie op het objectief en plaats het preparaat terug op de objecttafel. Zoek vervolgens het monster opnieuw op en stel de laservermogensbelichtingstijd en de binning in op de gewenste niveaus voor elk kanaal. Zodra de optimale instellingen zijn bepaald volgens de richtlijnen van het tekstprotocol, worden deze monsterinstellingen gebruikt voor alle weefselcoupes binnen het experiment.Gebruik het intensiteitshistogram om het optimale intensiteitsbereik voor elk kanaal vast te stellen, dat vervolgens voor de analyse wordt gebruikt. Genereer een Z-stack met de acquisitiefunctie door de juiste laserkanalen te selecteren. Kies daarna de bovenste en onderste grenzen van de Z-stack.Kies een Zack-stapgrootte die de helft is van de optische plaatsdikte zoals aangegeven door de software. Klik op 'run' om de beelden te verzamelen met Fiji of een vergelijkbaar programma voor beeldanalyse. Open het Zack-bestand met een aangepaste kleurmodusoptie en de kanalen gesplitst in afzonderlijke vensters.Open via het vervolgkeuzemenu van de afbeelding de tool voor het aanpassen van helderheid en contrast en stel binnen elk kanaal het optimale histogramintensiteitsbereik in. Pas deze kanaalbereiken, zoals eerder bepaald, toe op alle te analyseren Zacks. Voeg vervolgens via het vervolgkeuzemenu voor afbeeldingskleuren de afzonderlijke kanalen samen tot één samengestelde afbeelding.Maak via het projectmenu Image Stacks Z een afgeplatte Z-stack van de samengestelde afbeelding. Aangezien deze afbeelding aanzienlijk helderder zal zijn dan de 3D-afbeelding, moet het histogram-intensiteitsbereik voor de controlemonsters worden aangepast om oververzadiging te voorkomen; pas vervolgens dezelfde instellingen toe op de experimentele afgeplatte Z-stack. Om een 3D-afbeelding te genereren, kiest u eerst het projectmenu Image Stacks 3D. Kies vervolgens de x-as of de y-as als rotatie-as.Stel de plakafstand in op hetzelfde aantal microns als de stapgrootte van de Z-stapel. Kies de gewenste totale rotatie en stel de rotatiehoekincrement in op één. Open vervolgens de ImageJ 3D-viewer via het uitklapmenu van de plug-ins.Kies voor de weergave van de gegenereerde samengestelde afbeelding als volume en stel de resamplingsfactor in op één of twee. Deze figuren tonen typische resultaten voor de co-kleuring van verschillende eiwitten in een snap-frozen, met aceton gefixeerd hart; het antilichaam tegen S alpha actinin labelde reproduceerbaar de Z-schijven en in intercalaire schijven met hoge specificiteit en minimale achtergrond. Het antilichaam tegen het adherens-junction-eiwit bèta-catenine bond aan het membraan van zowel cardiomyocyten als niet-cardiomyocyten, en colocalisatie met SFA actinin trad op in vermoedelijke intercalaire schijven bij E 16.5. Immunofluorescentie van bèta 1 integrine in het embryonale hart is bijzonder uitdagend, maar bèta 1 integrine-kleuring in deze studies onthulde een signaal met dezelfde periodiciteit als de door SFA actinin gelabelde Z-schijven, wat mogelijk wijst op het vormen van beginnende costameren bij E 16.5.Bij E 12,5 vertoonde het kleuringspatroon van SFA actinine en tropomyosine een regelmatige periodiciteit in trabeculaire cardiomyocyten, wat consistent is met mature myofibrillen in de buitenste compacte zone. SFA actinine was meer punctaat dan lineair en het tropomyosine-signaal was diffuus in plaats van lineair. NCA adherente kleuring en trabeculaire cardiomyocyten in harten van E 12,5 co-lokaliseerden met gebieden van intense SFA actinine-kleuring, wat mogelijk interstitiële schijven vertegenwoordigt. Hier wordt getoond: A een met PFA gefixeerd embryonaal hart van E 12,5, gelabeld voor SFA actinine en filamenteus actine van een life act RFP Ruby transgene muis. De signaal-ruisverhouding van SFA actinine was verlaagd in vergelijking met snap-frozen hartsecties.Driedimensionale beeldreconstructie onthulde dat MyFi binnen een cardiomyocyt ruwweg parallel aan elkaar liepen, maar individuele cardiomyocyten waren onder variërende hoeken ten opzichte van elkaar georiënteerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe embryonale harten correct georiënteerd en cryogesneden moeten worden, alsmede in het uitvoeren van immunokleuring, confocale microscopie en beeldanalyse om de rijping van MyFi en cardiomyocyten tijdens de ontwikkeling van het muizenhart te beoordelen.Admit.

analysis-cardiomyocyte-development-using-immunofluorescence-embryonic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een snelle manier om immunokleuring van zebravis embryonale hart gedrag wordt beschreven. In vergelijking met de ganse berg immunokleuring aanpak, deze methode verhoogt dramatisch de penetratie van de antilichamen, die het mogelijk maakt het verkrijgen van een hoge resolutie beelden, die cellulaire / subcellulaire structuren openbaren in het hart in een veel lagere verwerkingstijd.

Immunokleuring van ontleed zebravis embryonale hart

Primaire muis cardiomyocytkweken is een van de cruciale instrumenten voor het onderzoek myofibrillar inrichting en functie. Het volgende protocol beschrijft de isolatie en de cultuur van primaire cardiomyocyten van neonatale muis harten. De resulterende cardiomyocytkweken kunnen vervolgens worden gebruikt voor een verscheidenheid van biomechanische, biochemische en celbiologische assays.

Isolatie en cultuur van de Neonatale Mouse Cardiomyocytes

We beschrijven een aantal methoden om kleurstoffen injecteren van DNA vectoren, virussen en cellen om zowel cellot en fenotype van endogene en geënte cellen uit embryonale of pluripotente cellen in muizenembryo's op embryonale dag (E) 9,5 en latere stadia bewaken ontwikkeling.

Cell Labeling en Injectie in ontwikkelingslanden Embryonale Mouse Hearts

We beschrijven een protocol voor het volumetrisch afbeelden van met fluorescente eiwitten gelabelde cellen diep in intacte embryonale en postnatale harten. Door gebruik te maken van weefselklaringsmethoden in combinatie met gehele montagekleuring, kunnen enkele met fluorescente eiwitten gelabelde cellen in een embryonaal of postnataal hart duidelijk en nauwkeurig worden afgebeeld.

Imaging Ontruimde embryonale en postnatale Hearts bij Single-cell Resolution

We presenteren een protocol voor de analyse van coronairvaten geheel muriene embryonale hart tot E15.5, met behulp van standaard immunologische werkwijzen kleuring gevolgd door optische klaring en confocale microscopie. Deze techniek maakt visualisatie van bloedvaten door het gehele hart zonder dat tijdrovende analyse van seriële secties.

Analyse van de coronaire vaten in Gewist Embryonale Hearts

Om celdeling te onderscheiden van variaties in de celcyclus in cardiomyocyten, presenteren we protocollen met behulp van twee transgene muislijnen: Myh6-H2B-mCh transgene muizen, voor de ondubbelzinnige identificatie van cardiomyocytenkernen, en CAG-eGFP-anillin muizen, voor het onderscheid tussen celdeling en variaties in de celcyclus.

Visualisatie van celcyclus Variaties en Bepaling van Nucleatie in Postnatale Cardiomyocytes

Hier beschrijven we een protocol voor hele mount immunofluorescentie en beeld-gebaseerde kwantitatieve volumetric analysis van vroege fase muis embryo's. Wij presenteren deze techniek als een krachtige aanpak van kwalitatief en kwantitatief cardiale structuren beoordelen tijdens de ontwikkeling, en voor te stellen dat het wellicht grote schaal aan te passen aan andere orgaansystemen.

Kwantitatieve geheel-mount immunofluorescentie analyse van cardiale Progenitor populaties in muis embryo 's

Bij deze methode zijn embryonale cardiale weefsels chirurgisch microdissected, losgekoppeld, fluorescently label en host embryonale weefsels ingeplant. Dit biedt een platform voor het bestuderen van de individu of weefsel niveau developmental organisatie onder ectopische hemodynamische voorwaarden en/of veranderde omgevingen van de paracrine/juxtacrine.

Microinjection-gebaseerd systeem voor In Vivo implantatie van embryonale Cardiomyocytes in het aviaire Embryo

We presenteren de protocollen te onderzoeken muis hart ontwikkelen met behulp van microscopie van de hele berg epifluorescerende op muis embryo's ontleed van ventriculaire specifieke MLC-2v-tdTomato verslaggever knock-in muizen. Deze methode laat ons direct visualiseren van elke fase van de ventriculaire formatie tijdens de ontwikkeling van de hart van de muis zonder arbeidsintensieve histochemische methoden.

Analyse van de ontwikkeling van de cardiale kamer tijdens muis embryogenese met hele Mount Epifluorescence

We presenteren een gedetailleerd protocol voor het kweken en beeldvorming van muizenembryo's dat 3D + tijdbeeldvorming van cardiale voorlopercellen mogelijk maakt. Deze video-toolkit behandelt de belangrijkste vaardigheden die nodig zijn voor succesvolle live imaging die anders moeilijk te verkrijgen zijn uit tekstpublicaties.

Live beeldvorming van vroege cardiale voorlopers in het muizenembryo

Leer cardiomyocytontwikkeling analyseren met immunofluorescentie in embryonale muizenharten. Deze methode combineert cryosectie, confocale microscopie en beeldanalyse om myofibrilopbouw en structurele rijping te bestuderen.

Analyse van Cardiomyocyte Development behulp Immuunfluorescentie in Embryonale Muis Hart

Meer video's verkennen