Multi-Locus variabele-nummer tandem-herhaling analyse van de vis-pathogene bacterie Yersinia ruckeri door multiplex PCR en capillaire elektroforese

Dit MLB genotyping protocol heeft ons begrip van de epidemiologie en de wereldwijde bevolkingsstructuur van Yersinia ruckeri, een internationaal belangrijke vispathogene bacterie, sterk vergroot. In vergelijking met eerder opgerichte Yersinia ruckeri typeschema's, biedt het een zeer hoge spanningsresolutie. De procedure is eenvoudig, goedkoop, en kent draagbare resultaten toe die gemakkelijk over laboratoria kunnen worden vergeleken.

De techniek verbetert de diagnostische specificiteit aanzienlijk en maakt infectietracering mogelijk. Zo kunnen we nu vaak virulente Yersinia ruckeri klonen bestaande tegen de achtergrond van niet-virulente milieustammen onderscheiden. Het demonstreren van de procedure zal Saima Nasrin Mohammad, een technicus in ons laboratorium.

Om te beginnen, gebruik steriele inentingslussen te zaaien uit Yersinia ruckeri pure culturen op een geschikte agar type op petrischaaltjes. Incubeer op 22 graden Celsius gedurende een tot twee dagen of 15 graden Celsius gedurende drie tot vier dagen. Daarna, met behulp van inentingslussen, kies een representatieve kolonie uit elke petrischaal en breng over naar 1,5-milliliter centrifugebuizen, met 50 microliter ultra gezuiverd water om opnieuw te besteden.

Vortex kort en zeven minuten uitbroeden op een verwarmingsblok bij 100 graden Celsius. Dan, centrifuge op 16,000 g gedurende drie minuten en gebruik een pipet om zorgvuldig de supernatant sjabloon DNA over te zetten in lege 1,5-milliliter centrifugebuizen. Ga naar de volgende stap of bewaar het DNA op 20 graden Celsius.

Om mastermixen voor te bereiden, bereken je eerst reagente volumes op basis van het aantal te analyseren bacteriële monsters, waarbij ook één negatieve en één positieve controle en een uiteindelijk overschotvolume van 10% worden weergegeven, zoals beschreven in het manuscript. Houd er rekening mee dat er verschillende primerconcentraties worden gebruikt. In twee afzonderlijke centrifugebuizen, een per PCR-test, voeg multiplex PCR plus master mix, primers, en RNase-vrij water.

Vortex de geprepareerde master mengt voorzichtig bij lage snelheid en vervolgens, distribueren 22 microliters van elke master mix afzonderlijk in individuele putten op ofwel PCR strips of platen. Voeg vervolgens drie microliters van de voorbereide DNA-sjabloon toe aan elke put met mastermix;twee putten per bacteriemonster, één voor elke test. Gebruik DNA van een geverifieerde Yersinia ruckeri stam voor een positieve controle, en ultra gezuiverd water voor een negatieve controle.

Verzegel en centrifuge kort. Laad de voorbereide reacties op een PCR thermo cycler en stel het programma op volgens het manuscript. Het programma wordt voltooid in minder dan drie uur.

Volgens de aanbevelingen van de fabrikant, voeg agarose gel poeder in een keer TBE buffer te bereiken 1,5 gewicht / volume procent en warmte op te lossen. Voorafgaand aan het gieten, chill de opgeloste gel oplossing kort onder stromend water, voeg 5 microliter van fluorescerende nucleïnezuur kleurstof per 50 microliter gel oplossing en meng. Monteer en nivellering van de gietlade.

Voeg kegels toe naar gelang van het geval voor het aantal monsters. Giet de geloplossing in de cast en wacht tot deze stolt. Daarna dompelt u de gietvorm met de gel in één keer TBE-buffer onder in een gelelektroforesesysteem.

Meng vijf microliter van de PCR-producten samen met twee microliters van lading kleurstof in nieuwe PCR strips. Breng vijf microliter van de mengsels naar de putten in de gel. Bespaar ten minste een goed leeg.

Voeg vijf microliter dna-ladder in de lege put toe als referentie. Sluit de elektroden aan en voer de gel ongeveer een uur op 110 volt per 15 centimeter. Gebruik een UV-gebaseerd gelbeeldvormingssysteem om de aanwezigheid van meerdere banden die PRC-amplicons vertegenwoordigen te verifiëren.

Gebruik na bevestiging van PCR-amplicons nieuwe PCR-strips of -platen om PCR-producten één tot 10 in gezuiverd water te verdunnen. Vortex en centrifuge kort. Bereid tijdens het werken in een rookkast een mastermix in een centrifugebuis bestaande uit formamide en referentieformaat standaardoplossing.

Gebruik het aantal te analyseren PCR-producten reagensvolumes zoals beschreven in het manuscript. Laat een overschot van 10% toe. Vortex kort en distribueren 9,5 microliter in individuele putten op een PCR-plaat geschikt voor de beschikbare capillaire elektroforese systeem.

Voeg vervolgens 0,5 microliter verdund PCR-product toe. Verzegel en centrifuge kort. Laad vervolgens de plaat met de monsters in een PCR thermo cycler en denature de monsters op 95 graden Celsius gedurende drie minuten voordat koeling tot vier graden Celsius voor onbepaalde tijd.

Centrifugeer gedurende een minuut op 1000 g, verwijder de afdichting voorzichtig en laad de plaat op een gekalibreerd capillaire elektroforesesysteem volgens de instructies van de fabrikant. Voer fragmentanalyse capillaire elektroforese uit, met behulp van reagentia naar keuze voor het apparaat van keuze, en pas de run voorwaarden aan de beschrijving in het manuscript. Voor Yersinia ruckeri VNTR capillaire elektroforese grootte bellen, eerste import capillaire elektroforese resultaat bestanden in Gene Mapper 5 software.

Stel de analysemethode in op Microsatellite Default, selecteer de juiste productkeuze onder maatstandaard en druk vervolgens op de knop Analyseren. Door middel van de grootte match editor, controleer de juiste identificatie van de grootte standaard fragmenten en corrigeer eventuele zichtbaar onjuiste toewijzingen. Selecteer vervolgens het te lezen voorbeeld, druk op de knop Plot weergeven en druk op Control A om de weergave van de groottetabel in te schakelen.

Houd in het bovenste paneel Control ingedrukt terwijl u op de vijf pieken klikt die de VNTR-amplicons vertegenwoordigen. Druk op Control G om de groottetabel te filteren, met alleen kenmerken van de vijf gemarkeerde pieken en de grootteoproepen voor elke VNTR-locus voor downstream-toepassing vast te leggen. Om rekening te houden met bevooroordeelde amplicon mobiliteitspatronen tijdens capillaire elektroforese, bereken nauwkeurige VNTR herhalingstellingen door gebruik te maken van de verworven grootte oproepen in combinatie met de locus specifieke variabelen.

De formule kan worden geïmplementeerd in een spreadsheetsjabloon voor automatisering. In de spreadsheet telt ronde berekende VNRT-herhaling af voor het dichtstbijzijnde gehele getal voorafgaand aan downstream-analyse. Maak in de BioNumerics-software een nieuwe database en kies ervoor om de MLVA-plug-in te activeren.

Druk in het deelvenster experimenttype op Nieuw experimenttype maken, kies Tekentype en gebruik de standaardinstellingen wanneer daarom wordt gevraagd. Selecteer vervolgens het nieuwe experiment en voeg nieuwe tekens toe voor elk van de 10 VNTR loci, waarbij nul tot 100 als waardebereik wordt gebruikt. Terug in het hoofdpaneel importeert u Yersinia ruckeri VNTR herhalingstellingen en methodegegevens door importvelden en tekens te selecteren.

Zoek het bestand waar dit is opgeslagen en maak selecties in de kolom Doeltype. Voor de VNTRs betekent dit het selecteren van de juiste tekenwaarde, terwijl de verschillende metagegevens worden geclassificeerd als invoerinfovelden. De gemaakte keuzes kunnen worden opgeslagen als een sjabloon om het proces voor later te vergemakkelijken.

Selecteer geïmporteerde voorbeelden die zijn bestemd voor MST-clusteranalyse en klik vervolgens op de knop Nieuwe vergelijking maken in het deelvenster Vergelijkingen. Indien gewenst voor de visuele presentatie van het MST, wijs de monsters toe aan gekleurde groepen, bijvoorbeeld volgens een bepaalde metagegevensfunctie. Selecteer vervolgens Geavanceerde clusteranalyse en MST voor categorische gegevens om een MST-diagram te genereren op basis van de gekozen voorbeelden.

Wijzig verder de visuele presentatie van het MST door partitieparameters, kruislengtes, node branch labeling, enz. Exporteer indien nodig het afgeronde MST in een gewenste indeling met de afbeeldingsselectie exporteren. Na multiplex PCR, de gel elektroforese beeld controleert de aanwezigheid van meerdere amplicons in alle 12 rijstroken met monsters, met de eerste rijstrook die de DNA-ladder gebruikt.

In elektroferogrammen als gevolg van capillaire elektroforese kan de verschillende VNTR loci worden geïdentificeerd aan de hand van een combinatie van grootte en kleurstoflabeling. Oranje pieken vertegenwoordigen de grootte standaard gebruikt. Een voorbeeld minimale spanning boom, op basis van MLVA profielen van Yersinia Ruckeri isolaten teruggewonnen uit Atlantische zalm in vijf verschillende Noorse boerderijen wordt getoond.

Een duidelijke clustering tendens in verband met de oorsprong van de boerderij kan worden waargenomen. De identificatie door MLVA van verschillende Yersinia ruckeri klonen domineert, bijvoorbeeld, met name geografische regio's van vissoorten, is al benut voor het verbeteren van vaccinatiestrategieën tegen deze ziekteverwekker.