Ontwikkeling van een niet-invasieve, laser-assisted experimenteel model van hoornvlies endotheel celverlies

De huidige ziektemodellen voor hoornvlies endotheelcelverlies richten zich op de vernietiging van het endotheel en vertegenwoordigen waarschijnlijk de laatste stadia van de ziekte wanneer hoornvliestransplantatie onvermijdelijk is. Nieuwe behandelingen met behulp van stamcellen of gentherapie, echter, zijn nu beschikbaar die nuttiger zou kunnen zijn voor de vroege stadia van de ziekte, de modellen waarvoor ontbreken. Niet-invasieve intraoculaire chirurgie door fotodisruptie met behulp van een Nd:YAG laser is uitgegroeid tot een routineprocedure voor oogartsen.

Na het verkrijgen van vers opukte varkensogen uit het plaatselijke slachthuis, plaats de monsters in vier graden Celsius vol medium. Gebruik een schaar om de extracellulaire weefsels te verwijderen en geniet van de ogen in 5%povidone jodium oogheelkundige oplossing gedurende vijf minuten. Plaats vervolgens de gedesinfecteerde monsters in steriele PBS bij kamertemperatuur.

Met behulp van een spectrale domein optische coherentie tomografie apparaat, het scherm van de ogen voor grote voorste segment pathologieën zoals hoornvlies littekens, oedeem, en andere opaciteiten. Na het screenen, plaats de ogen voor een slip lamp unit uitgerust met een Nd:YAG laser met een golflengte van 1, 064 nanometer en een brandpuntspuntsmeter diameter van 10 micrometer in de lucht. Selecteer de vergroting van 12x en leid de verlichting af om de afzonderlijke hoornvlieslagen te visualiseren.

Na het instellen van de pulsenergie en het focuspunt op de juiste parameters voor de selectieve ablatie van de hoornvlies endotheelcellen, breng verschillende lasershots aan op het weefsel. Plaats vervolgens onder een ontledenmicroscoop een heldere paracentese van het hoornvlies dicht bij de limbus en injecteer viscoelastisch om de voorkamer te stabiliseren. Gebruik dan een acht millimeter trephine om de laser behandelde centrale hoornvlies accijns en plaats het geïsoleerde hoornvlies in een put van een 12-goed plaat endotheel kant omhoog.

Wanneer alle hoornvliezen zijn verzameld, voeg drie millimeter van volledige medium aan elk monster goed en broeden de monsters voor maximaal drie dagen bij 37 graden Celsius. Vervang aan het einde van de incubatie het medium in elke put door methanolvrije 4%-paraformaldehyde in de buffer van Sorensen voor een incubatie van 20 minuten bij kamertemperatuur. Plaats aan het einde van de incubatie de vaste monsters ongeveer een uur in PBS tot de hoornvliezen zinken.

Breng de monsters 's nachts over in 30% sacharose in PBS voordat u de weefsels in optimalsnijtemperatuur insluit voor opslag bij min 80 graden Celsius. Gebruik een cryostat ingesteld op min 27 graden Celsius te verkrijgen 10 micrometer dikke delen van de bevroren weefsels verzamelen van elke sectie op een microscoop dia binnen een minuut na het verwerven. Bewaar vervolgens de dia's op min 80 graden Celsius tot het vlekken.

Voor hematoxyline en eosine vlekken, lucht drogen de bevroren secties gedurende enkele minuten om vocht te verwijderen voordat vlekken met gefilterde 0,1%Mayer's hematoxylin gedurende 10 minuten in een 50 milliliter buis. Spoel de glijbanen aan het einde van de incubatie vijf minuten in dubbel gedestilleerd water in een cuvette. Vervolgens dompel de glijbanen in 0,5% eosine 10 keer, gevolgd door dip spoelen in dubbel gedestilleerd water totdat de eosine stopt strepen.

Dompel de gespoelde dia's 10 keer in 50% ethanol en 10 keer in 70% ethanol. Na de laatste 70% ethanol dip, equilibrate de secties in 95%ethanol gedurende 30 seconden, gevolgd door 60 seconden in 100% ethanol voor verschillende dips in xyleen. Monteer vervolgens de exemplaren met coverslip voordat u afbeeldingen op een lichtmicroscoop krijgt.

Twee foton- en lichtmicroscopiebeelden moeten onafhankelijk worden geëvalueerd als geen schade, te veel schade of een juiste hoeveelheid schade. Op basis van deze beoordelingen kan vervolgens een warmtekaart worden berekend om de juiste constellatie van laserparameters te selecteren voor selectieve ablatie van de hoornvlies endotheelcellen met minimale schade aan het omringende weefsel. Eerdere analyse heeft uitgewezen dat het brandpunt van de laser moet ten minste 0,15 millimeter achter het hoornvlies endotheel voor de laagste puls energie getest.

Voor pulsenergieën hoger dan 2,9 millijoule ligt de langste geteste brandpuntsafstand nog te dicht bij het endotheel. Verschillende cytoprotectieve middelen kunnen worden getest, terwijl de uitgesneden exemplaren zijn in de cultuur. Indien bewezen succesvol, kunnen ze worden toegevoegd aan de irrigatie-oplossing voor behandeling.