Name: Ontwikkeling van een niet-invasieve, laser-assisted experimenteel model van hoornvlies endotheel celverlies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Ontdek een niet-invasief Nd:YAG laserprotocol voor hoornvlies endotheel celverlies bij varkensogen. Deze methode biedt een betrouwbaar ex vivo model voor vroegtijdig bullous keratopathy onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Christine Örün en Jan A. M. Sochurek voor hun hulp bij experimentele methoden.

Alle procedures met betrekking tot dierlijk weefsel volgen de richtlijnen van de plaatselijke Commissie dierverzorging en ethiek.
1. Voorbereiding van de orgaancultuur en laserbehandeling
<ol><li>Verkrijg vers opgesomde varkensogen van het plaatselijke slachthuis. Houd ze koel (4 °C) in dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met hoge glucose, aangevuld met L-glutamine, natriumpyruvaat, penicilline/streptomycine (1%) en varkensserum (10%), voortaan in dit artikel als volledig medium aangeduid.</li>
	<li>Verwijder extracellulaire weefsels met een schaar en week de ogen in 5% povidone-jodium oogheelkundige oplossing voor 5 min voor het plaatsen van hen in gesteriliseerde fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) tot gebruik.</li>
	<li>Scherm ogen voor belangrijke voorste segment pathologieën, zoals hoornvlies littekens, oedeem, en andere opacities met een spectral-domein optische coherentie tomografie apparaat (Tabel van materialen).</li>
	<li>Plaats de ogen voor een spleet-lamp unit uitgerust met een Nd:YAG laser (Tabel van materialen), die een golflengte van 1.064 nm en een brandpuntspuntsafstand diameter van 10 μm in de lucht heeft. OPMERKING: Voor een optimale positionering wordt een 3D-geprint e-apparaat gebruikt, dat is ontworpen om het oog stevig vast te houden, zonder er te veel druk op te leggen (figuur 1).</li>
	<li>Gebruik een vergroting van 12x en buig de verlichting af om de individuele hoornvlieslagen te visualiseren.</li>
	<li>Stel de pulsenergie (bijvoorbeeld 1,6 mJ) en het focuspunt (bijvoorbeeld 0,16 mm) in voor selectieve ablatie van endotheelcellen.</li>
	<li>Plaats een helder hoornvlies paracentesis dicht bij de limbus en injecteer visco-elastische(Tabel van materialen)om de voorste kamer te stabiliseren.</li>
	<li>Accijns het laserbehandelde centrale hoornvlies uit met een trephine van 8 mm.</li>
	<li>Plaats het uitgesneden hoornvlies in een put van een 12-put plaat met de endotheel site naar boven gericht en uitbroed het monster in 3 mL van volledig medium bij 37 °C gedurende maximaal 3 dagen. OPMERKING: Tijdens deze stap kunnen potentiële cytoprotectiemiddelen aan het medium worden toegevoegd.</li>
</ol>2. Voorbereiding van de histologie
<ol><li>Bereid de buffer van Sorensen voor met een pH van 7,4 met 19,6 mL van 133 mM KH2PO4 en 80,4 mL van 133 mM Na2HPO4.</li>
	<li>Verwijder het medium uit het hoornvlies houdende put en fixer het weefsel gedurende 20 min bij kamertemperatuur (RT) met methanolvrije paraformaldehyde (4%) in de buffer van Sorensen.</li>
	<li>Plaats weefsel in 20% sacharose in PBS tot weefsel zinkt (1 uur) en vervolgens in 30% sacharose in PBS 's nachts bij RT. Zorg ervoor dat u contact met bellen en de interface van het luchtoppervlak vermijdt. Sluit weefsel in in optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding en bewaar op -80 °C.</li>
	<li>Snijd secties 10 μm dik met behulp van een cryostat bij -27 °C. OPMERKING: Een kameel haarborstel is handig om te helpen begeleiden de opkomende sectie over het mes.</li>
	<li>Breng de sectie naar een microscoopdia door de dia aan te raken in het weefsel binnen 1 min van het snijden om te voorkomen dat het weefsel invriesdroogt. Bewaar de dia's op -80 °C.</li>
</ol>3. Hematoxylin en eosine (H&E) kleuring
<ol><li>Lucht droge secties gedurende enkele minuten om vocht te verwijderen.</li>
	<li>Vlek met gefilterde 0,1% Mayers hematoxylin gedurende 10 min in een 50 mL buis.</li>
	<li>Spoel in een Coplin pot in koel lopende ddH2O gedurende 5 min en dompel in 0,5% eosine 10x.</li>
	<li>Dip in ddH2O totdat de eosine stopt strepen en duik dan in 50% (10x) evenals 70% (10x) EtOH.</li>
	<li>Equilibrate in 95% EtOH (30 s) en 100% EtOH (60 s) alvorens in xyleen meerdere keren te dompelen.</li>
	<li>Monteer en bedek het monster ten slotte voordat u foto's maakt met een lichtmicroscoop.</li>
</ol>

<ol><li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cataract+and+Refractive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li>
<li>Edelhauser, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+balance+between+corneal+transparency+and+edema%3A+the+Proctor+Lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).</li>
<li>Tuft, S. J., Coster, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">The corneal endothelium.</a> Eye. 4, London, England. Pt 3 389-424 (1990).</li>
<li>Bourne, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+corneal+endothelium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Biology of the corneal endothelium in health and disease.</a> Eye. 17, 912-918 (2003).</li>
<li>He, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+map+of+the+human+corneal+endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D map of the human corneal endothelial cell.</a> Scientific Reports. 6, 29047(2016).</li>
<li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li>
<li>Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+corneal+endothelium+following+complete+endothelial+cell+loss+in+rat+keratoplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty.</a> Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).</li>
<li>Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+corneal+endothelial+cells+following+keratoplasty+in+rats+with+bullous+keratopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy.</a> Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).</li>
<li>Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+Cell+Therapy+for+Corneal+Endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Ophthalmology+Reports%22%5BJournal%5D)">Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium.</a> Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+three-dimensional+organ+culture+model+for+corneal+wound+healing+and+corneal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).</li>
<li>Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+neodymium-YAG+laser+to+open+the+posterior+capsule+after+lens+implant+surgery%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+-+American+Intra-Ocular+Implant+Society%22%5BJournal%5D)">Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report.</a> Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).</li>
<li>Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavitation+bubble+dynamics+and+acoustic+transient+generation+in+ocular+surgery+with+pulsed+neodymium%3A+YAG+lasers%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers.</a> Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).</li>
<li>Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+Nd%3AYAG+laser+surgery%3A+laser-tissue+interaction%2C+damage+range%2C+and+reduction+of+collateral+effects%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects.</a> IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).</li>
<li>Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro.</a> International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+inhibits+corneal+endothelial+mesenchymal+transition+and+accelerates+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing.</a> Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).</li>
<li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs%3A+histological+and+permeability+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).</li>
<li>Smeringaiova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Wound+Repair+of+the+Organ-Cultured+Porcine+Corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas.</a> Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).</li>
<li>Yamashita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rabbit+Corneal+Endothelial+Dysfunction+Model+Using+Endothelial-Mesenchymal+Transformed+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16868(2018).</li>
<li>Schubert, H. D., Trokel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+repair+following+Nd%3AYAG+laser+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial repair following Nd:YAG laser injury.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+Model+of+Corneal+Endothelial+Injury+Established+Using+the+Nd%3A+YAG+Laser%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser.</a> Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).</li>
<li>McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+endothelial+injury+thresholds+for+exposures+to+1.54+micro+m+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Physics%22%5BJournal%5D)">Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation.</a> Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).</li>
<li>Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+damage+following+focal+laser+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Corneal damage following focal laser intervention.</a> Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De resultaten van deze pilot studie geven aan dat een Nd:YAG laser kan worden gebruikt om selectief ablate hoornvlies endotheel cellen wanneer de juiste parameters voor energie dosis en focus punt positie worden gekozen.
Aangezien de endotheliale functie belangrijk is voor de transparantie van het hoornvlies en het beschermen van het hoornvlies tegen stronaal oedeem, spelen modellen van endotheeldisfunctie een belangrijke rol bij de ontwikkeling van anti-oedematousgeneesmiddelen of chirurgisch...

Transparantie van het hoornvlies is essentieel voor de overdracht van licht naar het netvlies en de fotoreceptoren1. In dit verband is een relatieve staat van uitdroging van cruciaal belang om de collageenvezels in de hoornvliesstroma correct uitgelijnd te houden. Deze homeostase wordt onderhouden door hoornvliesendotheelcellen (CEC) gelegen op het membraan van de Descemet (DM)2. Het endotheel is de binnenste hoornvlieslaag. Het heeft een belangrijke barrière en pomp functie, die cruciaal is voor hoornvlies transparantie3. In tegenstelling tot het epitheel is het endotheel niet in staat om zichzelf te vernieuwen4. Daarom stimuleert elke celschade veroorzaakt door ziekte of trauma de resterende endotheelcellen om te vergroten en te migreren, resulterende defecten te dekken en hoornvliesfunctionaliteit te behouden5. Als de CEC-dichtheid echter onder een kritische drempel zakt, leidt decompensatie van het endotheel tot een oedeem, wat resulteert in wazig zicht en ongemak of zelfs ernstige pijn4. Ondanks de beschikbaarheid van geneesmiddelen om de symptomen te verlichten, momenteel de enige definitieve behandeling in deze gevallen is hoornvliestransplantatie, die kan worden uitgevoerd in de vorm van een volledige-dikte graft of een lamellen endotheeltransplantatie. Deze laatste procedure is beschikbaar als Descemet's membraan endothelial keratoplastie (DMEK) evenals Descemet's strippen geautomatiseerde endotheel keratoplastie (DSAEK)6. De bescherming van de resterende CEC en het verbeteren van hun overleving zou echter een alternatief doel kunnen zijn, dat een adequaat ziektemodel nodig heeft om potentiële therapeutische geneesmiddelen te testen.
De huidige CEC-verliesziektemodellen richten zich op de vernietiging van het endotheel door de injectie van toxische stoffen (bijvoorbeeld benzalkoniumchloride) in de voorste kamer of door mechanische slijtage van de cellen met behulp van een invasieve descemetorhexistechniek7,8. Hoewel deze modellen goed ingeburgerd zijn, bestaan er nadelen zoals algemene ontstekingsreactie en onnauwkeurige bijkomende schade. Daarom zijn deze modellen meer kans om de laatste stadia van de ziekte te vertegenwoordigen, wanneer de bovengenoemde chirurgische opties onvermijdelijk zijn.
Met vooruitgang in cellulaire behandelingsstrategieën zoals stamcellen en gentherapie, zou de toepassing van deze cellulaire therapieën in vroege stadia van verlies CEC9nuttig kunnen zijn. Vervolgens hebben we een model nodig dat deze eerdere stadia van de ziekte beter vertegenwoordigt. In dit verband zijn celkweekmodellen de afgelopen tien jaar verbeterd, maar zijn ze nog steeds beperkt in hun geldigheid, omdat cellen in vitro niet in de buurt kunnen komen van het repliceren van de complexe interacties die optreden tussen de verschillende celtypen binnen het hoornvlies10. Daarom zijn ex vivo en in vivo ziektemodellen nog steeds in trek en het verbeteren van de bestaande modellen is van het grootste belang.
Niet-invasieve, intraoculaire chirurgie door fotoverstoring met behulp van een neodymium: YAG (Nd:YAG) laser is uitgegroeid tot een routineprocedure voor oogartsen wereldwijd sinds de invoering ervan in de late jaren 197011. Fotoverstoring is afhankelijk van niet-lineaire lichtabsorptie die leidt tot de vorming van plasma, het genereren van akoestische schokgolven en het ontstaan van cavitatiebellen, wanneer de toepassingsplaats zich in een vloeibare omgeving bevindt12. In het algemeen dragen deze processen bij aan het beoogde effect van nauwkeurig weefselsnijden. Echter, ze kunnen ook de bron van onnodige bijkomende schade beperken van de lokale opsluiting van laserchirurgie13.
De voorspelling van de resulterende mechanische effecten is aanzienlijk verbeterd door karakterisering van de schokgolf voortplanting en cavitatie cursus. Het is ons doel om CEC te richten met zo weinig mogelijk schade aan omliggende weefsel om een niet-invasieve, laser-ondersteunde experimentele ziekte model voor de vroege stadia van CEC verlies te bieden. Hiervoor is het noodzakelijk om de optimale pulsenergieën en posities van de brandpunten van de laser te bepalen.

<table><tbody><tr><td>BARRON VACUUM TREPHINE</td><td>Katena</td><td>K20-2058</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle&rsquo;s Medium - high glucose</td><td>PAA</td><td>E-15009</td><td></td></tr><tr><td>Eye holder</td><td>Zelf</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Leica</td><td>DMI 6000 B</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>529568</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Merck</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG laser</td><td>Zeiss Meditec</td><td>visuLAS YAG II plus</td><td></td></tr><tr><td>OCT Tissue Tek</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010056</td><td></td></tr><tr><td>Porcine serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12736C</td><td></td></tr><tr><td>Spectral-domain optical coherence tomograph</td><td>Heidelberg Engineering</td><td>Spectralis</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture plate 12-well</td><td>Sarstedt</td><td>833921</td><td></td></tr><tr><td>Two-Photon Microscope</td><td>JenLab</td><td>DermaInspect</td><td></td></tr><tr><td>Viscoelastic</td><td>OmniVision</td><td>Methocel</td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van een niet-invasieve, laser-assisted experimenteel model van hoornvlies endotheel celverlies

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Nd: YAG lasers zijn gebruikt om niet-invasieve intraoculaire chirurgie uit te voeren, zoals capsulotomy voor meerdere decennia nu. Het indringende effect is afhankelijk van de optische afbraak bij de laserfocus. Akoestische schokgolven en cavitatiebellen ontstaan, waardoor weefselbreuk ontstaat. Belgroottes en drukamplitudes variëren met pulsenergie en positie van het brandpunt. In deze studie werden enucleated varkensogen geplaatst voor een commercieel beschikbare Nd:YAG laser. Variabele puls energieën evenals verschillende posities van de brandpunten posterior naar het hoornvlies werden getest. Resulterende laesies werden geëvalueerd door twee-foton microscopie en histologie om de beste parameters voor een exclusieve onthechting van hoornvlies endotheel cellen (CEC) met minimale bijkomende schade te bepalen. De voordelen van deze methode zijn de precieze ablatie van CEC, verminderde bijkomende schade, en vooral de contactloze behandeling.

Met behulp van de hier gepresenteerde procedure behandelden we ogen met een Nd:YAG-laser, waarbij we verschillende puls-energieën (1,0−4,6 mJ) en posities van brandpunten (afstand tot het achterste oppervlak van het hoornvlies: 0,0−0,2 mm) evalueerden om de optimale parameters te vinden. Meerdere replica's (n = 3) werden geëvalueerd voor elke constellatie van de laserparameters (12 x 21).
In aanvulling op de bovengenoemde protocol, monster werd geanalyseerd met een twee-foton microscoop voor f...

Hier presenteren we een protocol om hoornvliesendodelialcellen (CEC) los te koppelen van het membraan (DM) van Descemet met behulp van een neodymium:YAG (Nd:YAG) laser als ex vivo ziektemodel voor bullous keratopathie (BK).

Ontwikkeling van een niet-invasieve, laser-assisted experimenteel model van hoornvlies endotheel celverlies

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

De huidige ziektemodellen voor hoornvlies endotheelcelverlies richten zich op de vernietiging van het endotheel en vertegenwoordigen waarschijnlijk de laatste stadia van de ziekte wanneer hoornvliestransplantatie onvermijdelijk is. Nieuwe behandelingen met behulp van stamcellen of gentherapie, echter, zijn nu beschikbaar die nuttiger zou kunnen zijn voor de vroege stadia van de ziekte, de modellen waarvoor ontbreken. Niet-invasieve intraoculaire chirurgie door fotodisruptie met behulp van een Nd:YAG laser is uitgegroeid tot een routineprocedure voor oogartsen.Na het verkrijgen van vers opukte varkensogen uit het plaatselijke slachthuis, plaats de monsters in vier graden Celsius vol medium. Gebruik een schaar om de extracellulaire weefsels te verwijderen en geniet van de ogen in 5%povidone jodium oogheelkundige oplossing gedurende vijf minuten. Plaats vervolgens de gedesinfecteerde monsters in steriele PBS bij kamertemperatuur.Met behulp van een spectrale domein optische coherentie tomografie apparaat, het scherm van de ogen voor grote voorste segment pathologieën zoals hoornvlies littekens, oedeem, en andere opaciteiten. Na het screenen, plaats de ogen voor een slip lamp unit uitgerust met een Nd:YAG laser met een golflengte van 1, 064 nanometer en een brandpuntspuntsmeter diameter van 10 micrometer in de lucht. Selecteer de vergroting van 12x en leid de verlichting af om de afzonderlijke hoornvlieslagen te visualiseren.Na het instellen van de pulsenergie en het focuspunt op de juiste parameters voor de selectieve ablatie van de hoornvlies endotheelcellen, breng verschillende lasershots aan op het weefsel. Plaats vervolgens onder een ontledenmicroscoop een heldere paracentese van het hoornvlies dicht bij de limbus en injecteer viscoelastisch om de voorkamer te stabiliseren. Gebruik dan een acht millimeter trephine om de laser behandelde centrale hoornvlies accijns en plaats het geïsoleerde hoornvlies in een put van een 12-goed plaat endotheel kant omhoog.Wanneer alle hoornvliezen zijn verzameld, voeg drie millimeter van volledige medium aan elk monster goed en broeden de monsters voor maximaal drie dagen bij 37 graden Celsius. Vervang aan het einde van de incubatie het medium in elke put door methanolvrije 4%-paraformaldehyde in de buffer van Sorensen voor een incubatie van 20 minuten bij kamertemperatuur. Plaats aan het einde van de incubatie de vaste monsters ongeveer een uur in PBS tot de hoornvliezen zinken.Breng de monsters 's nachts over in 30% sacharose in PBS voordat u de weefsels in optimalsnijtemperatuur insluit voor opslag bij min 80 graden Celsius. Gebruik een cryostat ingesteld op min 27 graden Celsius te verkrijgen 10 micrometer dikke delen van de bevroren weefsels verzamelen van elke sectie op een microscoop dia binnen een minuut na het verwerven. Bewaar vervolgens de dia's op min 80 graden Celsius tot het vlekken.Voor hematoxyline en eosine vlekken, lucht drogen de bevroren secties gedurende enkele minuten om vocht te verwijderen voordat vlekken met gefilterde 0,1%Mayer's hematoxylin gedurende 10 minuten in een 50 milliliter buis. Spoel de glijbanen aan het einde van de incubatie vijf minuten in dubbel gedestilleerd water in een cuvette. Vervolgens dompel de glijbanen in 0,5% eosine 10 keer, gevolgd door dip spoelen in dubbel gedestilleerd water totdat de eosine stopt strepen.Dompel de gespoelde dia's 10 keer in 50% ethanol en 10 keer in 70% ethanol. Na de laatste 70% ethanol dip, equilibrate de secties in 95%ethanol gedurende 30 seconden, gevolgd door 60 seconden in 100% ethanol voor verschillende dips in xyleen. Monteer vervolgens de exemplaren met coverslip voordat u afbeeldingen op een lichtmicroscoop krijgt.Twee foton- en lichtmicroscopiebeelden moeten onafhankelijk worden geëvalueerd als geen schade, te veel schade of een juiste hoeveelheid schade. Op basis van deze beoordelingen kan vervolgens een warmtekaart worden berekend om de juiste constellatie van laserparameters te selecteren voor selectieve ablatie van de hoornvlies endotheelcellen met minimale schade aan het omringende weefsel. Eerdere analyse heeft uitgewezen dat het brandpunt van de laser moet ten minste 0,15 millimeter achter het hoornvlies endotheel voor de laagste puls energie getest.Voor pulsenergieën hoger dan 2,9 millijoule ligt de langste geteste brandpuntsafstand nog te dicht bij het endotheel. Verschillende cytoprotectieve middelen kunnen worden getest, terwijl de uitgesneden exemplaren zijn in de cultuur. Indien bewezen succesvol, kunnen ze worden toegevoegd aan de irrigatie-oplossing voor behandeling.

development-noninvasive-laser-assisted-experimental-model-corneal

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video demonstrates a non-invasive laser-assisted procedure to selectively damage the corneal endothelial cells in the porcine eye. The developed ex vivo model of endothelial cell damage can be used to study diseases of the corneal endothelium.

Laser-assisted Selective Ablation of Porcine Corneal Endothelial Cells: A Technique to Induce Focused Porcine Corneal Endothelial Injury for Ex Vivo Studies

Neovascularisatie (NV) van het hoornvlies kan compliceren meerdere visuele pathologieën. Met behulp van een gecontroleerde, alkali-brandwonden-model, kan een kwantificeerbare niveau van de cornea NV worden geproduceerd voor mechanistische studie van het hoornvlies NV en evaluatie van potentiële therapieën voor neovascular aandoeningen.

Een alkali-brandwonden Model van Cornea Neovascularisatie in de muis

Er wordt een volledig laserprocedure voorgesteld in de endotheeltransplantatie. De chirurgische techniek is gebaseerd op het gebruik van een femtosecondelaser om het donorweefsel voor te bereiden. Vervolgens wordt de laserlastechniek gebruikt om het donorendotheel op de juiste positie te bevestigen.

Een &quot;All-laser&quot; Endothelial Transplant

Hier presenteren we het protocol voor laser-geïnduceerde choroïdale neovascularisatie (CNV) bij muizen, een experimenteel model dat de vasculaire kenmerken van neovasculaire leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) nastreeft. Eenmaal onder de knie, kan het op betrouwbare en effectieve wijze CNV induceren als modelsysteem om verschillende experimentele maatregelen te testen.

Een muismodel voor Laser-geïnduceerde Choroïdale Neovascularisatie

Een primaire kweek van runder corneale endotheelcellen werd gebruikt om het mechanisme van corneale endotheel-mesenchymale overgang te onderzoeken. Verder werd een rat hoornvliesendotheel cryoinjury model gebruikt om corneale endotheel-mesenchymale overgang in vivo te demonstreren.

In vitro en in vivo modellen voor de studie van het hoornvlies endotheel-mesenchymale transitie

Het volgende artikel biedt een eenvoudige, reproduceerbare techniek om effectief een duurzame muismodel van limbale stamcellen deficiëntie (LSCD). Dit diermodel is bruikbaar bij het testen en vergelijken van de werkzaamheid van behandelingen voor limbale stamcellen ziekten.

Een eenvoudige mechanische Procedure aanmaken Limbale Stem Cell Deficiency in Mouse

Hier presenteren we het nut van longitudinale in vivo imaging in de follow-up van de morfologische veranderingen van laser-geïnduceerde choroidal neovascularization in muizen.

In Vivo Multimodale beeldvorming en analyse van Laser-geïnduceerde Choroidal Neovascularization muismodel

Hier wordt een stap-voor-stap protocol voor de bereiding en de teelt van de corneale knoppen van het varkens gesplitst. Aangezien dit organo-typisch gecultiveerde orgel cultuur model de celsterfte binnen 15 dagen weergeeft, vergelijkbaar met de menselijke donor cornea's, vertegenwoordigt het het eerste model dat langdurige teelt van niet-humane cornea's toestaat zonder toxische dextran toe te voegen.

Een porcine Corneale endotheliale orgel cultuur model met behulp van splitsen Corneale knoppen

Descemet's Stripping Only is een experimentele procedure waarbij patiënten met centrale cornea guttae als gevolg van Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy het membraan van Descemet laten strippen voor perifere cellen om de endotheellaag te regenereren. We presenteren een nieuwe methodologie die DSO simuleert in dystrofische menselijke hoornvliezen ex vivo met versnelde genezing gestimuleerd door eFGF1 (NM141).

Een menselijk hoornvliesorgaancultuurmodel van Descemet's strippen alleen met versnelde genezing gestimuleerd door gemanipuleerde fibroblastgroeifactor 1

Dit protocol beschrijft een methode om een nauwkeurig en reproduceerbaar hoornvlies- en limbaal alkalisch letsel te induceren in een muismodel. Het protocol is voordelig omdat het een gelijkmatig verdeelde verwonding van het sterk gekromde hoornvlies en de limbus van de muis mogelijk maakt.

Inductie van hoornvlies- en limbale alkalische letsels met behulp van een punch-trephine-techniek in een muismodel

Hier stellen we drie verschillende methoden voor om de sensorische vezels die het hoornvlies innerveren te beschadigen. Deze methoden vergemakkelijken de studie van axonregeneratie bij muizen. Deze drie methoden, die kunnen worden aangepast aan andere diermodellen, zijn ideaal voor de studie van de fysiologie en regeneratie van de innervatie van het hoornvlies.

Drie strategieën om neurotrofe keratitis en zenuwregeneratie in het hoornvlies van muizen te induceren

Ontdek een niet-invasief Nd:YAG laserprotocol voor hoornvlies endotheel celverlies bij varkensogen. Deze methode biedt een betrouwbaar ex vivo model voor vroegtijdig bullous keratopathy onderzoek.

Ontwikkeling van een niet-invasieve, laser-assisted experimenteel model van hoornvlies endotheel celverlies

Meer video's verkennen