Name: RNA Blot Analyse voor de detectie en kwantificering van Plant MicroRNAs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 41 s
Description: Leer een gemodificeerde northern hybridisatiemethode voor nauwkeurige detectie van plant microRNAs tussen 20-24 nucleotiden. Dit protocol valideert kleine RNA-sequenties uit next-generation sequencing datasets met hoge resolutie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen de toegang tot stralingslab die door het gastinstituut en BRIT voor radio-isotoop wordt verstrekt. PVS laboratorium wordt ondersteund door National Center for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research and grants (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) van het Department of Biotechnology, Regering van India. MP erkent DBT-Research Associateship, DBT, Regering van India.

1. Voorbereiding van een 15% denaturering polyacrylamide gel
<ol><li>Weeg en voeg 4,8 g ureum toe, voeg 3,75 mL acrylamide toe van 40% acrylamide: bisacrylamide (19:1) oplossing en 1 mL van 10x TBE pH 8.2 in een steriele 50 mL buis.</li>
	<li>Los het ureum op met een waterbad van 60 °C tot een duidelijke oplossing.</li>
	<li>Maak het volume op tot 10 mL met vers automatisch geautolaveerd steriel water en koel het gelmengsel af tot kamertemperatuur.</li>
	<li>Bereid verse 10% (w/v) ammonium persulfate oplossing.</li>
</ol>2. Montage van de glasplaten en elektroforese-eenheid
<ol><li>Was alle apparaten die nodig zijn voor de gel elektroforese en elektro-blotting met wasmiddel. Voorzichtig schrobben ze met behulp van een zachte spons om de resterende buffer en acrylamide te verwijderen, afspoelen met water en laat ze drogen.</li>
	<li>Monteer beide glazen platen samen en leg ze stevig op de spons. Gebruik een 1 mm dikke plaat voor deze setup. Zorg ervoor dat de platen op hetzelfde niveau zijn om lekkage te voorkomen.</li>
	<li>Voeg aan de 10 mL gelmix 8 μL TEMED en 80 μL vers bereide 10% (w/v) ammoniumerfaatoplossing toe.</li>
	<li>Meng en giet dit onmiddellijk tussen de geassembleerde glasplaten. Plaats de kam voorzichtig. Vermijd het genereren van luchtbellen in deze stap.</li>
	<li>Laat de gel ongeveer 45 min polymeriseren.</li>
	<li>Was de gepolymeriseerde gel met steriel water voordat u de gellopende setup plaatst.</li>
	<li>Monteer de platen in de lopende cassette en verwijder de kam voorzichtig.</li>
	<li>Giet vers bereide steriele 1x TBE, pH 8.2 in de tank.</li>
	<li>Was de putten voorzichtig door de buffer te pipetten om zoutkristallen te verwijderen. Deze stap helpt het RNA-monster gelijkmatig over de gel te lopen.</li>
	<li>Voer een pre-run uit op 80 V gedurende 30 minuten.</li>
</ol>3. Bereiding van ladingskleurstof en monsters
<ol><li>Voor 10 mL gel laden kleurstof, wegen 5 mg bromofenol blauw, 5 mg xyleen cyanol, voeg 10 mL van gedeïmiseerde formamide zorgvuldig en meng ze goed.</li>
	<li>Aliquot 10 μg totaal RNA in een steriele buis van 1,5 mL en droog de monsters met behulp van een speedvac. Droog de monsters niet te droog.</li>
	<li>Resuspend de RNA monsters in 8 μL van het laden.</li>
	<li>Verwarm de monsters op 98 °C gedurende 2 min, koel gedurende 1 min af bij RT, draai de draaikolk en draai de monsters gedurende 3 keer. Deze stap is essentieel voor een goede resuspensie en op zijn beurt helpt dit bij gelijke belasting van de monsters.</li>
</ol>4. Gel elektroforese
<ol><li>Stop de pre-run en was de putten voordat het monster wordt geladen.</li>
	<li>Verwarm de monsters op 98 °C gedurende 1 min en laad de monsters heet in de put met capillaire uiteinden. Steek de punt aan de onderkant van de put, zodat het monster neemt een dunne laag in de put.</li>
	<li>Volledige lading van alle monsters. Opnemen om RNA decade marker te laden.</li>
	<li>Voer de gel op 80 V tot de bromophenol blauwe kleurstof loopt bijna volledig. Bromophenol blauw loopt op 10 bp in een 15% denaturering acrylamide gel.</li>
</ol>5. Voorbereiding op elektroblotting
<ol><li>Snijd het N+nylon membraan in de afmetingen van de glasplaat en label het membraan in de rechterbovenhoek met een HB-potlood.</li>
	<li>Plaats het membraan voorzichtig op het oppervlak van steriel water, met de gelabelde kant naar het wateroppervlak. Laat het membraan 15 minuten voor weken.</li>
	<li>Snijd 4 stukken van blotting papier I aan de afmetingen van vezel pad.</li>
	<li>Bereid de gelsandwich voor het plaatsen van de grijze kant van de cassette naar beneden in een schone lade.</li>
	<li>Maak het vezelpad nat en leg het over de cassette. Verwijder luchtbellen.</li>
	<li>Voorwet een stuk blotting papier in 1x TBE en plaats over de vezel pad. Verwijder luchtbellen door het rollen van een plastic pipet over het papier. Leg nog een stuk voorwett vloeipapier en verwijder luchtbellen.</li>
	<li>Verwijder de gel voorzichtig uit de lopende cassette en plaats deze over de sandwichsetup, zodat het eerste geladen RNA-monster naar rechts is.</li>
	<li>Dompel het voorweekte membraan voorzichtig onder in 1x TBE en leg het over de gel, met uitzicht op de geëtiketteerde kant naar beneden. Rol uit om de luchtbellen te verwijderen.</li>
	<li>Dompel een stuk blotting papier, leg het over het membraan, en verwijder de luchtbellen. Dip een ander stuk blotting papier, plaats het over sandwich setup en verwijder luchtbellen.</li>
	<li>Maak de sandwich compleet door een voornatte vezelpad over de setup te plaatsen en sluit de cassette stevig af.</li>
	<li>Plaats de transblot cassette in de module en vul 1x TBE, pH 8.2 tot aan de blotting merk.</li>
	<li>Transfer bij 10 V, 's nachts bij 4 °C.</li>
	<li>Plaats na overdracht het vochtige membraan op een papierblad en koppel het RNA onmiddellijk aan het membraan door bestraling met 254 nm UV-licht (120.000 μjoules/cm²). De cross-linked vlek misschien opgeslagen bij 4 °C voor verdere hybridisatie.</li>
</ol>6. Voorbereiding van radioactief gelabelde sonde
<ol><li>Ontwerp een sonde die volledig complementair is aan het kleine RNA dat moet worden gedetecteerd.</li>
	<li>Label de sonde met behulp van ƳP32ATP (verkregen van BRIT) aan het einde van 5' door de componenten te combineren volgens het in tabel 1opgenomen recept .</li>
	<li>Incubeer het bovenstaande reactiemengsel 37 °C gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Afzonderlijke niet-geëtiketteerde ƳP32ATP van de sonde met behulp van een Sephadex G-25 kolom volgens het protocol van de fabrikant.</li>
</ol>7. Hybridisatie van de vlek
<ol><li>Plaats de gekruiste-gekoppelde vlek, RNA kant naar boven in een hybridisatie fles.</li>
	<li>Meng krachtig de ultragevoelige hybridisatiebuffer, voeg er 10 mL van toe en ontcubeer de vlek in een hybridisatieoven die op 35 °C wordt gehandhaafd, met rotatie.</li>
	<li>Voer pre-hybridisatie uit gedurende 20 minuten.</li>
	<li>Haal de fles uit de oven en voeg de gelabelde sonde voorzichtig in de hybridisatiebuffer.</li>
	<li>Verhybrial de vlek bij 35 °C, met rotatie voor 12 h.</li>
	<li>Na hybridisatie voorzichtig overbrengen van de hybridisatie oplossing in 15 mL buis. Deze oplossing kan tot het hergebruik bij 4 °C worden opgeslagen.</li>
	<li>Voer een snelle wasbeurt van de vlek voor 2 min om overtollige hybridisatie oplossing te verwijderen door het toevoegen van 2x SSC buffer plus 0,5% SDS. Gooi de oplossing weg.</li>
	<li>Incubeer de vlek met 2x SSC buffer plus 0,5% SDS voor 35 °C, met rotatie gedurende 30 min.</li>
	<li>Was de vlek opnieuw met een 0,5x SSC-buffer plus 0,5% SDS voor 35°C, met rotatie gedurende 30 min.</li>
	<li>Plaats de vlek in een hybridisatiedeksel, verwijder de overtollige buffer en verzegel deze.</li>
	<li>Stel het 's nachts bloot aan een stralingsvrij fosforbeeldscherm in een cassette.</li>
	<li>Detecteer het hybridisatiesignaal met behulp van biomoleculaire imager en analyseer de resultaten met behulp van geschikte software.</li>
	<li>Strip de vlek door het uit te broeden op 80 °C, met rotatie voor 30 min met 0,5 X SSC buffer plus 0,1% SDS en 0,1 X SSC buffer plus 0,1% SDS voor 30 min.</li>
</ol>

<ol><li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431, 356-363 (2004).</li>
<li>Anushree, N., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Plant+miRNA+Biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Indian+National+Science+Academy%22%5BJournal%5D)">Regulation of Plant miRNA Biogenesis.</a> Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).</li>
<li>Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+sequence+signature+is+essential+for+robust+plant+miRNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. , (2020).</li>
<li>Chen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((22-Nucleotide+RNAs+trigger+secondary+siRNA+biogenesis+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).</li>
<li>Shivaprasad, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+superfamily+regulates+nucleotide+binding+site-leucine-rich+repeats+and+other+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs.</a> Plant Cell. 24, 859-874 (2012).</li>
<li>Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraordinary+transgressive+phenotypes+of+hybrid+tomato+are+influenced+by+epigenetics+and+small+silencing+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs.</a> The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).</li>
<li>Akbergenov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+geminivirus-derived+small+RNAs+in+different+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species.</a> Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).</li>
<li>Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR828+and+miR858+regulate+VvMYB114+to+promote+anthocyanin+and+flavonol+accumulation+in+grapes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes.</a> Journal of Experimental Botany. , (2019).</li>
<li>Li, C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Small+RNAs+by+Northern+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).</li>
<li>Swetha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+domestication-related+phenotypes+in+indica+rice+are+due+to+loss+of+miRNA-mediated+laccase+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing.</a> The Plant Cell. , (2018).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Deze methode kan op grote schaal worden gebruikt voor detectie en kwantificering van kleine RNAs, waaronder minder overvloedige miRNAs. Het protocol beschrijft voornamelijk de stappen voor het denatureren van het totale RNA in een laadbuffer, groottescheiding door gel elektroforese, overdracht van RNA naar een membraan, kruis-link het RNA op membraan en hybridiseren met behulp van de gewenste radiolabeled oligo sondes.
De cruciale stap voor elk blotting experiment is het gebruik van goede kwal...

De recente ontdekking van kleine regulerende RNAs, microRNAs, heeft geleid tot onderzoek in het begrijpen van hen en hun rol in planten en dieren1. Lange voorlopers van miRNAs worden verwerkt tot 21 tot 24 nt volwassen miRNAs door HYL1 en specifieke dicer-achtige eiwitten2,3. Een miRNA van 22 nt kan cascade-uitschakeling initiëren door secundaire siRNAs4te genereren. Studies hebben aangetoond dat de rol van miRNAs en secundaire siRNAs in ontwikkeling, cellot en stress reacties5,6.
Noordelijke hybridisatie is een experimentele methode die routinematig wordt gebruikt om specifieke RNA-moleculen te detecteren. Deze methode past het gebruik ervan aan bij de detectie van ongeveer 19-24 nt lange kleine RNAs uit een pool van totale RNAs7. In deze demonstratie illustreren we het gebruik van deze techniek voor de detectie en kwantificering van miRNAs. Deze methode maakt gebruik van de etikettering van sondes met behulp van radio-isotopen; zo kunnen miRNA-niveaus in het monster worden gedetecteerd met een verhoogde gevoeligheid. In tegenstelling tot pcr-gebaseerde methoden, deze methode zorgt voor kwantificering van de expressie, alsmede de grootte bepaling van de miRNAs. In dit protocol laten we cruciale stappen zien die de miRNA-detectie verbeteren. We hebben stappen in blotting en hybridisatie aangepast voor het verkrijgen van hoge resolutie signaaldetectie van miRNAs. Deze techniek kan ook worden gebruikt voor de detectie van andere endogene kleine RNAs zoals siRNAs, tasi-secundaire RNAs en snoRNAs.

<table><tbody><tr><td>40% Acrylamide-bisacrylamide solution</td><td>Sigma</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulphate (APS)</td><td>BioRad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>Blotting paper</td><td>whatmann blotting paper I</td><td>1001-125</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>Capillary loading tips</td><td>BioRad</td><td>2239915</td><td></td></tr><tr><td>Deionized formamide</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>Heating block</td><td>Eppendorff</td><td>5350</td><td></td></tr><tr><td>Hybond N+nylon membrane</td><td>GE</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization bottle</td><td>Sigma</td><td>Z374792-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Oven</td><td>Thermo Scientific</td><td>1211V79</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&rsquo;,N&rsquo;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma</td><td>T7024-25ml</td><td></td></tr><tr><td>PhosphorImager</td><td>GE- Typhoon scanner</td><td>29187194</td><td></td></tr><tr><td>PhosphorImager screen and cassette</td><td>GE healthcare</td><td>GE28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Gilson, models: P20 and P10</td><td>FA10002M, FA10003M</td><td></td></tr><tr><td>Plastic pipette</td><td>Falcon</td><td>357550</td><td></td></tr><tr><td>Polyacrylamide gel apparatus</td><td>BioRad</td><td>1658003EDU</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25 column</td><td>GE healthcare</td><td>27532501</td><td></td></tr><tr><td>Speed Vac Concentrator</td><td>Thermo Scientific</td><td>20-548-130</td><td></td></tr><tr><td>Spinwin</td><td>Tarsons</td><td>1010</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase (PNK)</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Transblot apparatus</td><td>BioRad</td><td>1703946</td><td></td></tr><tr><td>ULTRAHyb hybridization buffer</td><td>Ambion</td><td>AM8670</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Fischer Scientific</td><td>15985</td><td></td></tr><tr><td>UV-crosslinker</td><td>UVP</td><td>CL-1000L</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Tarsons</td><td>3020</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>NEOLAB</td><td>D-8810</td><td></td></tr><tr><td>Xylene cyanol</td><td>Sigma</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr></tbody></table>

rna blot analyse voor de detectie en kwantificering van plant micrornas

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) zijn een klasse van endogene uitgedrukte niet-codering, ~ 21 nt kleine RNAs die betrokken zijn bij de regulering van genexpressie in zowel planten als dieren. De meeste miRNAs fungeren als negatieve schakelaars van genexpressie gericht op belangrijke genen. In planten worden primaire miRNAs (pri-miRNAs) transcripties gegenereerd door RNA polymerase II, en ze vormen verschillende lengtes van stabiele stam-lusstructuren genaamd pre-miRNAs. Een endonuclease, Dicer-like1, verwerkt de pre-miRNAs tot miRNA-miRNA* duplexen. Een van de strengen van miRNA-miRNA* duplex wordt geselecteerd en geladen op Argonaute 1-eiwit of de homologs ervan om het decolleté van doelmrnas te bemiddelen. Hoewel miRNAs belangrijke signaalmoleculen zijn, wordt hun detectie vaak uitgevoerd door minder dan optimale PCR-gebaseerde methoden in plaats van een gevoelige noordelijke vlekanalyse. We beschrijven een eenvoudige, betrouwbare en uiterst gevoelige noordelijke methode die ideaal is voor de kwantificering van miRNA-niveaus met een zeer hoge gevoeligheid, letterlijk van elk plantweefsel. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om de grootte, stabiliteit en de overvloed aan miRNAs en hun precursoren te bevestigen.

In deze demonstratie hebben we de expressie van miR397 ontdekt en gekwantificeerd in verschillende weefsels van indica rijst var whiteponni (figuur 1). miR397 is een 22 nt miRNA en geconserveerd miRNA. De expressie van miR397 kan worden gedetecteerd in alle geteste monsters. Volgens de volgende generatie sequencing gegevens, monster 1 (zaailing weefsel) heeft miR397 op 5 leest per miljoen (rpm). We ontdekten het signaal comfortabel, wat aangeeft dat de methode zeer gevoelig...

Deze methode toont het gebruik van de noordelijke hybridisatie techniek om miRNAs te detecteren van de totale RNA extract.

RNA Blot Analyse voor de detectie en kwantificering van Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Hoi. Dit is een klein RNA noordelijk protocol. Het is een afgeleide van het protocol oorspronkelijk geoptimaliseerd door Dr.Rashid Akbergenov.In deze methode kan men kleine RNA's detecteren van ergens tussen 20-24 nucleotide in lengte, zeer nauwkeurig en bij zeer hoge resolutie. Het protocol is eigenlijk een gewijzigde vorm van traditionele noordelijke analyse, maar hier is het percentage acrylamide vrij hoog, het is 15 procent. Deze noordelijke kan worden gebruikt voor het opsporen van reeds bekende kleine RNA, hetzij micro RNA of andere set van kleine RNA, wanneer de sequentie bekend is of het kan worden gebruikt voor de bevestiging van overvloed van kleine RNA afkomstig van de volgende generatie sequencing datasets.Voordeel van deze methode is dat men niet alleen kan kijken naar micro RNA overvloed, maar ook de overvloed aan precursoren, bijvoorbeeld micro RNAs kan weglaten een voorloper die ongeveer 30 tot een paar honderd nucleotide lang kan zijn, dit kan ook gelijktijdig worden gedetecteerd, samen met de micro RNA. Het protocol is zeer eenvoudig, zeer rechttoe rechtaan, maar men moet zeer voorzichtig zijn tijdens het uitvoeren van een aantal kritische stappen die worden vermeld in het einde van dit protocol. Voeg voor de bereiding van 10 mL gelmix 4,8 gram ureum, 3,75 mL van 40%Acrylamide-oplossing en 1 mL vers bereide 10X TBE, pH 8.2 en meng de oplossing voorzichtig.Los ureum volledig op, door het mengsel in een waterbad te verwarmen, totdat de oplossing er helder uitziet. Maak het volume op tot 10 mL, gebruik steriel MilliQ water en koel het gelmengsel af tot kamertemperatuur. Was het benodigde apparaat met wasmiddel, schrob ze voorzichtig om resterende TBE en Acrylamide te verwijderen.Spoel ze verder af met MilliQ water en laat het drogen. Monteer de glasplaat samen, zorg ervoor dat beide op hetzelfde niveau zijn. Leg ze stevig op de spons.Voeg 8 micro liter TEMED en 80 micro liter 10% vers bereide APS toe aan de gelmix. Meng en giet de gelmix voorzichtig naar de geassembleerde platen. Zorg ervoor dat de gel niet lekt.Plaats de kam voorzichtig. Laat de gel ongeveer 45 minuten polymeriseren. Verwijder na de polymerisatie van de gel de glasplaten uit de montage.Was de glasplaten met MilliQ water. En plaats ze in de lopende cassette. Plaats de lopende cassette in de tank.Giet vers bereide 1X TBE, pH 8.2. Verwijder de kam voorzichtig. Was de putten van de gel grondig door de buffer te pipetten.Deze stap verwijdert neerslag van ureum uit de put en vergemakkelijkt het RNA om gelijkmatig over de gel te lopen. Sluit het deksel van het apparaat en voer de lege gel gedurende 30 minuten uit op 80 volt om te controleren op eventuele bufferlekkage. Voor de bereiding van 10 mL ladingkleurstof weegt u 5 mg bromofenolblauw, 5 mg xyleencyanol en voeg 10 mL gedeioiniseerde formamide toe en meng ze goed.Aliquot de kleurstof en op te slaan op 4 graden voor verder gebruik. Aliquot 10 microgram totaal RNA in steriele 1,5 mL buizen. Zorg ervoor dat de kwaliteit van het RNA, d.w.z.de verhouding 260:230 is groter dan of dichter bij twee. Plaats de buis in een speedVac en vacuüm droog de monsters. Schort de gedroogde RNA-monsters opnieuw op in 8 microliter ladingskleurstof.Verwarm de monsters op 98 graden gedurende twee minuten. Koel ze voor een minuut op kamertemperatuur. Vortex de gekoelde RNA monsters om een goede re-schorsing in de lading kleurstof te garanderen.Draai aan de buizen. Herhaal de stappen van verwarming, koeling en vortex voor drie keer voor het krijgen van vrij stromend RNA. Stop de pre-run van de gel.Was de putten grondig, voordat u het monster laadt, om afzettingen van de ureum in de putten te verwijderen. Verwarm de opnieuw opgehangen RNA-monsters op 98 graden gedurende een minuut. Laad de monsters heet in de putten met capillaire tips.Vermijd de invoering van luchtbellen. Volledige belasting van alle monsters en monteer het deksel. Laat de gel drie uur lang op 80 volt lopen of tot het bromofolblauw volledig loopt.Gebruik positief geladen nylon membraan voor de overdracht. Snijd het aan de afmetingen van de glasplaat. Label het membraan in de rechterbovenhoek.Plaats het membraan voorzichtig op het oppervlak van steriel MilliQ-water en zorg ervoor dat u de etiketzijde naar beneden plaatst, met uitzicht op het wateroppervlak. Neem een schone lade en bereiden gel sandwich voor electro transfer. Plaats de grijze kant van de cassette naar beneden.Giet 1X TBE iets boven het niveau van de cassette. Maak het vezelpad voor nat in 1X TBE en knijp erin om luchtbellen te verwijderen. Snijd twee stukken blotting papier ter grootte van vezel pad.Maak een stuk blottingpapier voor in 1X TBE en leg het over het vezelpad. Verwijder luchtbellen door het rollen van een plastic pipet over het papier. Voorweten een ander stuk blotting papier in 1X TBE en leg het over de cassette.Rol om om luchtbellen te verwijderen. Nu is de sandwich setup klaar voor electro transfer. Na voltooiing van de elektroforese, stop de run en verwijder het deksel van het apparaat.Verwijder de lopende cassette uit de setup. Haal de glasplaten uit de lopende cassette. Verwijder de gel voorzichtig uit de montage.Leg het over de blotting papier zodanig dat de eerste geladen RNA monster is naar rechts. Dompel het voorweekte membraan voorzichtig onder in 1X TBE en plaats het over de gel, met de gelabelde zijkant naar beneden. Laat het membraan en de gel niet drogen.Rol voorzichtig om luchtbel te verwijderen. Dompel een stuk blotting papier in 1X TBE en leg het over het membraan. Verwijder luchtbellen.Plaats een ander stuk blotting papier en verwijder de luchtbellen. Maak de sandwich compleet door het vezelpad over de montage te leggen. Sluit de cassette stevig.Plaats de trans-vlek cassette in de module. Vul de tank met 1X TBE, pH 8.2, tot aan de blotting merk. Sluit het deksel van het apparaat en breng 's nachts op 10 volt bij 4 graden of in een koude kamer.Houd de UV-kruis linker klaar en zet het op 1200, net voor de voltooiing van de elektrooverdracht. Verwijder na voltooiing van de overdracht de cassette uit de module. Plaats het vochtige membraan op een A4-vel en plaats de gemarkeerde zijde naar boven.Kruis het RNA met het membraan door bestraling met 254 nanometer UV-licht op 120 milli joules. De kruisgebonden vlek kan worden opgeslagen op vier graden of worden gebruikt voor hybridisatie. Ontwerp een sonde die volledig gratis is voor het kleine RNA dat moet worden gedetecteerd.Einde label van de sonde op het vijf prime end met behulp van PNK enzym en combineren de componenten zoals afgebeeld. Incubeer het reactiemengsel op 37 graden gedurende 30 minuten. Na 30 minuten incubatie gebruik G-25 kolommen om niet-gelabelde sondes te scheiden van het reactiemengsel.Voor een betere etikettering van de sonde moet u de G-25-kolom voor gebruik voorbereiden. Plaats de vlek, RNA kant naar boven gericht, in een hybridisatie fles. Meng de hybridisatiebuffer krachtig voor gebruik.Voeg 10 mL hybridisatiebuffer binnen toe en plaats de hybridisatiefles in de hybridisatieoven, houd op 35 graden met rotatie. Voer pre-hybridisatie uit gedurende 20 tot 30 minuten. Haal na de voorverbridering de fles uit de oven.Voeg de gelabelde sonde voorzichtig toe aan de hybridisatiebuffer. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Incubeer de vlek in de oven op 35 graden met rotatie gedurende 12 uur.Verwijder na hybridisatie de hybridisatiebuffer uit de fles. Voer een snelle wasbeurt van de vlekken, met behulp van wasbuffer-I. Deze stap wordt uitgevoerd om overtollige hybridisatieoplossing uit de vlekken te verwijderen.Verder incubeer de vlekken op 35 graden gedurende 30 minuten met behulp van wasbuffer-I. Voer een andere was met behulp van buffer-II op 35 graden gedurende 30 minuten. Na het wassen van de vlek, plaats het in een hybridisatie deksel, verwijder overtollige buffer en verzegelen.Plaats het in een cassette en bloot te stellen aan een stralingsvrije fosfo-imager scherm voor 12 uur. Detecteer het hybridisatiesignaal met behulp van tyfoon biomoleculaire imager en analyseer de resultaten met behulp van ImageJ software. Voor hybridisatie van de vlek met andere sondes voert u strippensstappen uit zoals afgebeeld.Met deze techniek kan men de overvloed aan micro-RNA schatten, evenals zijn lengte. Uit deze afbeelding kan expressie van micro RNA 397 worden gedetecteerd in alle monsters. In deze vlek, de overvloed van monster een is ongeveer 5 leest per miljoen, volgens de volgende generatie sequencing gegevens, wat suggereert dat onze techniek kan detecteren minder overvloedige micro RNAs ook.Bovendien kan men met behulp van ImageJ kwantificeringssoftware de expressie van micro 397 onder de monsters kwantificeren. Hier hebben we U6 en micro RNA 168 gebruikt als laadregelaars. Ik zal het hebben over een aantal cruciale stappen die moeten worden overwogen tijdens het uitvoeren van het experiment.Zorg ervoor dat u RNA van goede kwaliteit gebruikt voor de voorbereiding van het monster. Tijdens het vacuüm drogen van de monsters, vermijd dan drogen. Re-schorsing van RNA in de lading kleurstof is van cruciaal belang.Zorg ervoor dat u een vrij stromend monster voorbereidt. Let op bij het laden van de gel. De putten van de gel moeten worden gewassen en het monster moet in een rechte lijn in de putten worden geladen.Tijdens de elektrooverdracht is het verspreiden van het membraan in water, vlak voordat het in 1X TBE dompelt essentieel, het verbetert de overdracht. De hybridisatie van de vlek moet worden uitgevoerd op 35 graden. Houd de temperatuur van de hybridisatieoven in stand.Voor herhaald gebruik van de vlekken moeten membranen worden opgeslagen op 4 graden. Ze moeten vochtig worden gehouden in 2X SSE. In tegenstelling tot andere PCR-gebaseerde methoden, deze methode zorgt voor kwantificering van de uitdrukking, evenals de bepaling van de grootte van de micro RNAs.

rna-blot-analysis-for-detection-quantification-plant

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In this video, we demonstrate the northern blot, a hybridization technique to detect and quantify microRNAs (miRNAs) from total RNA extracted from plant tissue.

Northern Blot to Detect and Quantify Specific MicroRNA in Total RNA Extract of Plant Tissue

Moleculaire signalering via zowel oestrogeen en microRNA's zijn cruciaal in de ontwikkeling en de groei van borstkanker. Oestrogeen activeert de oestrogeenreceptoren die transcriptiefactoren. Veel transcriptiefactoren kan de expressie van microRNA's te reguleren, en oestrogeen-gereguleerde microRNA kunnen worden geprofileerd met behulp van verschillende grootschalige technieken.

Profilering van oestrogeen-gereguleerde MicroRNA in borstkankercellen

Het doel van deze publicatie is om te visualiseren en te discussiëren over de operatieve stappen van een Enhanced Northern Blot protocol op RNA geëxtraheerd uit Drosophila melanogaster embryo's, cellen en weefsels. Dit protocol is bijzonder bruikbaar voor de efficiënte detectie van kleine RNA species.

Verbeterde Northern Blot detectie van kleine RNA Species in Drosophila melanogaster

Circulerende microRNAs zijn onlangs naar voren gekomen als veelbelovend en nieuwe biomarkers voor verschillende vormen van kanker en andere ziekten. Het doel van dit artikel is om drie verschillende probes gebaseerde real-time PCR-platforms en methoden die beschikbaar zijn om te kwantificeren en te bepalen de overvloed aan circulerende microRNAs zijn te bespreken.

Probe-gebaseerde real-time PCR Benaderingen voor kwantitatieve meting van microRNAs

We beschrijven het gebruik van een multiplexe hoogdoorvoerige genexpressieplatform die genexpressie kwantificeert door middel van barcodes en het tellen van moleculen in biologische substraten zonder de noodzaak voor amplificatie. We gebruikten het platform om microRNA (miRNA) expressie in vol bloed te kwantificeren bij personen met en zonder prikdarm syndroom.

Verstoringen van circulerende miRNAs in het prikkelbare darm syndroom gedetecteerd met een multiplexverzending High-throughput genexpressie Platform

Dit verslag wordt een snelle en betrouwbare methode voor het valideren van mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs beschreven. Het gebruik van de methode synthetische biotinyleerd vergrendeld nucleïnezuur LNA gebaseerde miRNA bootst te vangen target mRNA. Vervolgens daar beklede magnetische kralen pulldown worden gebruikt de doelstelling mRNA voor kwantificering van qPCR polymerase-kettingreactie.

Biotine gebaseerde Pulldown Assay te valideren mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs

Een bioinformatica-pijpleiding, namelijk miRDeep-P2 (kortweg miRDP2), met bijgewerkte plant miRNA-criteria en een gereviseerd algoritme, kan microRNA transcriptomes nauwkeurig en efficiënt analyseren in planten, vooral voor soorten met complexe en grote Genomes.

Een bioinformatica-pijpleiding om de MicroRNA Transcriptomes in fabrieken nauwkeurig en efficiënt te analyseren

Hier beschrijven we een stapsgewijze strategie voor het isoleren van kleine Rna's, verrijkend voor Microrna's en het voorbereiden van samples voor sequentiëren met hoge doorvoer. Vervolgens beschrijven we hoe u de volgorde leest en lijnt u deze uit op microRNAs met behulp van open source tools.

Een complete pijplijn voor het isoleren en Sequentiëren van Microrna's en het analyseren ervan met open source tools

De methylated RNA immunoprecipitation assay is een antilichaamgebaseerde methode die wordt gebruikt om te verrijken voor gemethyleerde RNA-fragmenten. In combinatie met diepe sequencing leidt het tot de identificatie van transcripties met de m5C-wijziging.

Gemethyleerde RNA ImmunoprecipatieTest voor studie m5C Modificatie in Arabidopsis

Hierin presenteren we een nieuwe en volledig geautomatiseerde miRNA-pijplijn, mirMachine die 1) bekende en nieuwe miRNA's nauwkeuriger kan identificeren en 2) volledig geautomatiseerd en vrij beschikbaar is. Gebruikers kunnen nu een kort indieningsscript uitvoeren om de volledig geautomatiseerde mirMachine-pijplijn uit te voeren.

mirMachine: een one-stop-shop voor miRNA-annotatie van planten

Het protocol beschrijft een tandem-immunofluorescentiehybridisatietest met in formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel om microRNA en gemultiplexte eiwitten tegelijkertijd te detecteren en te kwantificeren.

MicroRNA-amplificatie en -herkenning door middel van locked-nucleic-acid in situ hybridisatie als een nieuwe detectie- en kwantificeringsmethode

Leer een gemodificeerde northern hybridisatiemethode voor nauwkeurige detectie van plant microRNAs tussen 20-24 nucleotiden. Dit protocol valideert kleine RNA-sequenties uit next-generation sequencing datasets met hoge resolutie.

RNA Blot Analyse voor de detectie en kwantificering van Plant MicroRNAs

Meer video's verkennen