RNA Blot Analyse voor de detectie en kwantificering van Plant MicroRNAs

Hoi. Dit is een klein RNA noordelijk protocol. Het is een afgeleide van het protocol oorspronkelijk geoptimaliseerd door Dr.Rashid Akbergenov.

In deze methode kan men kleine RNA's detecteren van ergens tussen 20-24 nucleotide in lengte, zeer nauwkeurig en bij zeer hoge resolutie. Het protocol is eigenlijk een gewijzigde vorm van traditionele noordelijke analyse, maar hier is het percentage acrylamide vrij hoog, het is 15 procent. Deze noordelijke kan worden gebruikt voor het opsporen van reeds bekende kleine RNA, hetzij micro RNA of andere set van kleine RNA, wanneer de sequentie bekend is of het kan worden gebruikt voor de bevestiging van overvloed van kleine RNA afkomstig van de volgende generatie sequencing datasets.

Voordeel van deze methode is dat men niet alleen kan kijken naar micro RNA overvloed, maar ook de overvloed aan precursoren, bijvoorbeeld micro RNAs kan weglaten een voorloper die ongeveer 30 tot een paar honderd nucleotide lang kan zijn, dit kan ook gelijktijdig worden gedetecteerd, samen met de micro RNA. Het protocol is zeer eenvoudig, zeer rechttoe rechtaan, maar men moet zeer voorzichtig zijn tijdens het uitvoeren van een aantal kritische stappen die worden vermeld in het einde van dit protocol. Voeg voor de bereiding van 10 mL gelmix 4,8 gram ureum, 3,75 mL van 40%Acrylamide-oplossing en 1 mL vers bereide 10X TBE, pH 8.2 en meng de oplossing voorzichtig.

Los ureum volledig op, door het mengsel in een waterbad te verwarmen, totdat de oplossing er helder uitziet. Maak het volume op tot 10 mL, gebruik steriel MilliQ water en koel het gelmengsel af tot kamertemperatuur. Was het benodigde apparaat met wasmiddel, schrob ze voorzichtig om resterende TBE en Acrylamide te verwijderen.

Spoel ze verder af met MilliQ water en laat het drogen. Monteer de glasplaat samen, zorg ervoor dat beide op hetzelfde niveau zijn. Leg ze stevig op de spons.

Voeg 8 micro liter TEMED en 80 micro liter 10% vers bereide APS toe aan de gelmix. Meng en giet de gelmix voorzichtig naar de geassembleerde platen. Zorg ervoor dat de gel niet lekt.

Plaats de kam voorzichtig. Laat de gel ongeveer 45 minuten polymeriseren. Verwijder na de polymerisatie van de gel de glasplaten uit de montage.

Was de glasplaten met MilliQ water. En plaats ze in de lopende cassette. Plaats de lopende cassette in de tank.

Giet vers bereide 1X TBE, pH 8.2. Verwijder de kam voorzichtig. Was de putten van de gel grondig door de buffer te pipetten.

Deze stap verwijdert neerslag van ureum uit de put en vergemakkelijkt het RNA om gelijkmatig over de gel te lopen. Sluit het deksel van het apparaat en voer de lege gel gedurende 30 minuten uit op 80 volt om te controleren op eventuele bufferlekkage. Voor de bereiding van 10 mL ladingkleurstof weegt u 5 mg bromofenolblauw, 5 mg xyleencyanol en voeg 10 mL gedeioiniseerde formamide toe en meng ze goed.

Aliquot de kleurstof en op te slaan op 4 graden voor verder gebruik. Aliquot 10 microgram totaal RNA in steriele 1,5 mL buizen. Zorg ervoor dat de kwaliteit van het RNA, d.w.z.

de verhouding 260:230 is groter dan of dichter bij twee. Plaats de buis in een speedVac en vacuüm droog de monsters. Schort de gedroogde RNA-monsters opnieuw op in 8 microliter ladingskleurstof.

Verwarm de monsters op 98 graden gedurende twee minuten. Koel ze voor een minuut op kamertemperatuur. Vortex de gekoelde RNA monsters om een goede re-schorsing in de lading kleurstof te garanderen.

Draai aan de buizen. Herhaal de stappen van verwarming, koeling en vortex voor drie keer voor het krijgen van vrij stromend RNA. Stop de pre-run van de gel.

Was de putten grondig, voordat u het monster laadt, om afzettingen van de ureum in de putten te verwijderen. Verwarm de opnieuw opgehangen RNA-monsters op 98 graden gedurende een minuut. Laad de monsters heet in de putten met capillaire tips.

Vermijd de invoering van luchtbellen. Volledige belasting van alle monsters en monteer het deksel. Laat de gel drie uur lang op 80 volt lopen of tot het bromofolblauw volledig loopt.

Gebruik positief geladen nylon membraan voor de overdracht. Snijd het aan de afmetingen van de glasplaat. Label het membraan in de rechterbovenhoek.

Plaats het membraan voorzichtig op het oppervlak van steriel MilliQ-water en zorg ervoor dat u de etiketzijde naar beneden plaatst, met uitzicht op het wateroppervlak. Neem een schone lade en bereiden gel sandwich voor electro transfer. Plaats de grijze kant van de cassette naar beneden.

Giet 1X TBE iets boven het niveau van de cassette. Maak het vezelpad voor nat in 1X TBE en knijp erin om luchtbellen te verwijderen. Snijd twee stukken blotting papier ter grootte van vezel pad.

Maak een stuk blottingpapier voor in 1X TBE en leg het over het vezelpad. Verwijder luchtbellen door het rollen van een plastic pipet over het papier. Voorweten een ander stuk blotting papier in 1X TBE en leg het over de cassette.

Rol om om luchtbellen te verwijderen. Nu is de sandwich setup klaar voor electro transfer. Na voltooiing van de elektroforese, stop de run en verwijder het deksel van het apparaat.

Verwijder de lopende cassette uit de setup. Haal de glasplaten uit de lopende cassette. Verwijder de gel voorzichtig uit de montage.

Leg het over de blotting papier zodanig dat de eerste geladen RNA monster is naar rechts. Dompel het voorweekte membraan voorzichtig onder in 1X TBE en plaats het over de gel, met de gelabelde zijkant naar beneden. Laat het membraan en de gel niet drogen.

Rol voorzichtig om luchtbel te verwijderen. Dompel een stuk blotting papier in 1X TBE en leg het over het membraan. Verwijder luchtbellen.

Plaats een ander stuk blotting papier en verwijder de luchtbellen. Maak de sandwich compleet door het vezelpad over de montage te leggen. Sluit de cassette stevig.

Plaats de trans-vlek cassette in de module. Vul de tank met 1X TBE, pH 8.2, tot aan de blotting merk. Sluit het deksel van het apparaat en breng 's nachts op 10 volt bij 4 graden of in een koude kamer.

Houd de UV-kruis linker klaar en zet het op 1200, net voor de voltooiing van de elektrooverdracht. Verwijder na voltooiing van de overdracht de cassette uit de module. Plaats het vochtige membraan op een A4-vel en plaats de gemarkeerde zijde naar boven.

Kruis het RNA met het membraan door bestraling met 254 nanometer UV-licht op 120 milli joules. De kruisgebonden vlek kan worden opgeslagen op vier graden of worden gebruikt voor hybridisatie. Ontwerp een sonde die volledig gratis is voor het kleine RNA dat moet worden gedetecteerd.

Einde label van de sonde op het vijf prime end met behulp van PNK enzym en combineren de componenten zoals afgebeeld. Incubeer het reactiemengsel op 37 graden gedurende 30 minuten. Na 30 minuten incubatie gebruik G-25 kolommen om niet-gelabelde sondes te scheiden van het reactiemengsel.

Voor een betere etikettering van de sonde moet u de G-25-kolom voor gebruik voorbereiden. Plaats de vlek, RNA kant naar boven gericht, in een hybridisatie fles. Meng de hybridisatiebuffer krachtig voor gebruik.

Voeg 10 mL hybridisatiebuffer binnen toe en plaats de hybridisatiefles in de hybridisatieoven, houd op 35 graden met rotatie. Voer pre-hybridisatie uit gedurende 20 tot 30 minuten. Haal na de voorverbridering de fles uit de oven.

Voeg de gelabelde sonde voorzichtig toe aan de hybridisatiebuffer. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Incubeer de vlek in de oven op 35 graden met rotatie gedurende 12 uur.

Verwijder na hybridisatie de hybridisatiebuffer uit de fles. Voer een snelle wasbeurt van de vlekken, met behulp van wasbuffer-I. Deze stap wordt uitgevoerd om overtollige hybridisatieoplossing uit de vlekken te verwijderen.

Verder incubeer de vlekken op 35 graden gedurende 30 minuten met behulp van wasbuffer-I. Voer een andere was met behulp van buffer-II op 35 graden gedurende 30 minuten. Na het wassen van de vlek, plaats het in een hybridisatie deksel, verwijder overtollige buffer en verzegelen.

Plaats het in een cassette en bloot te stellen aan een stralingsvrije fosfo-imager scherm voor 12 uur. Detecteer het hybridisatiesignaal met behulp van tyfoon biomoleculaire imager en analyseer de resultaten met behulp van ImageJ software. Voor hybridisatie van de vlek met andere sondes voert u strippensstappen uit zoals afgebeeld.

Met deze techniek kan men de overvloed aan micro-RNA schatten, evenals zijn lengte. Uit deze afbeelding kan expressie van micro RNA 397 worden gedetecteerd in alle monsters. In deze vlek, de overvloed van monster een is ongeveer 5 leest per miljoen, volgens de volgende generatie sequencing gegevens, wat suggereert dat onze techniek kan detecteren minder overvloedige micro RNAs ook.

Bovendien kan men met behulp van ImageJ kwantificeringssoftware de expressie van micro 397 onder de monsters kwantificeren. Hier hebben we U6 en micro RNA 168 gebruikt als laadregelaars. Ik zal het hebben over een aantal cruciale stappen die moeten worden overwogen tijdens het uitvoeren van het experiment.

Zorg ervoor dat u RNA van goede kwaliteit gebruikt voor de voorbereiding van het monster. Tijdens het vacuüm drogen van de monsters, vermijd dan drogen. Re-schorsing van RNA in de lading kleurstof is van cruciaal belang.

Zorg ervoor dat u een vrij stromend monster voorbereidt. Let op bij het laden van de gel. De putten van de gel moeten worden gewassen en het monster moet in een rechte lijn in de putten worden geladen.

Tijdens de elektrooverdracht is het verspreiden van het membraan in water, vlak voordat het in 1X TBE dompelt essentieel, het verbetert de overdracht. De hybridisatie van de vlek moet worden uitgevoerd op 35 graden. Houd de temperatuur van de hybridisatieoven in stand.

Voor herhaald gebruik van de vlekken moeten membranen worden opgeslagen op 4 graden. Ze moeten vochtig worden gehouden in 2X SSE. In tegenstelling tot andere PCR-gebaseerde methoden, deze methode zorgt voor kwantificering van de uitdrukking, evenals de bepaling van de grootte van de micro RNAs.