Microdissectie van muizenhersenen in functioneel en anatomisch verschillende regio's

Het bestuderen van verschillende hersengebieden is een opstap naar het begrijpen van de moleculaire en structurele complexiteit van de hersenen. Dit protocol beschrijft een systematische dissectie van muizenhersenen om verschillende hersengebieden te isoleren. In het perspectief van de hersenanatomie is het een top-down benadering die gemakkelijk kan worden gereproduceerd.

De voordelen van dit protocol zijn tweeledig. Ten eerste biedt deze benadering een kans om de moleculaire onderbouwing van kleine, maar kritieke hersengebieden te begrijpen. Ten tweede is dit hele dissectieproces voldoende kort om het behoud van moleculaire integriteit te garanderen, een kritieke voorwaarde voor rug- en moleculaire assays.

Deze procedure omvat oefening en delicate behandeling. De timing is hier zeer cruciaal om de structurele oriëntatiepunten te behouden en kan worden bereikt met de juiste training en oefening. De procedure van het verwijderen van muizenhersenen zal worden aangetoond door Seid Muhie, een onderzoekschemicus en bio-informaticus uit ons laboratorium.

Verdere demonstratie van de procedure van hersendissectie bij muizen is James Meyerhoff, een neurowetenschapper uit ons laboratorium. Om te beginnen, reinig en verwijder de huid voor een goede grip. Klem de maxilla van de onthoofde kop vast met een hemostat en gebruik een gaasje om de hoofdhuid rostrale te reflecteren.

Steek de fijne gebogen schaar in het foramen magnum om de klevende hersenvliezen te scheiden. Plaats vervolgens de schaar in de opening van de schedelbasis waar het ruggenmerg passeert met het mes verticaal gericht, maar parallel aan en drukkend tegen het binnenoppervlak van het basale plaatbot, waarbij het blad 45 graden naar de linkerkant en vervolgens naar de rechterkant wordt gedraaid. Verwijder het achterhoofdsbot in het intrapariëtale bot om het cerebellum bloot te leggen.

Beweeg de schaar rostrale langs de middelste sagittale hechting tot aan de bregma en knip deze door omhoog te tillen om scheuring van cerebrale cortices te voorkomen. Terwijl de pariëtale botten worden opgetild, identificeert en snijdt u de resterende meningeale aanhechtingen. Maak twee parallelle sneden in het sagittale vlak en verwijder de fragmenten van het frontale bot, vermijd het scheuren van het hersenoppervlak.

Terwijl u meningeale aanhechtingen en hersenzenuwen snijdt, keert u de schedel om om de zwaartekracht toe te staan om te helpen bij het verwijderen van de hersenen in een kleine beker die vooraf is gevuld met zoutoplossing. Houd auditieve bulla intact zodat de hypofyseanatomie identificeerbaar is. Maak een extreem kleine parasaggitale snede aan beide zijden in de rand van de membraantent die de hypofyse op zijn plaats houdt en til de achterkwab van de hypofyse op met een ultrafijne tang.

Maak een sagittale snede tussen de laterale randen van de voorkwab van de hypofyse in de dichtstbijzijnde trigeminuszenuw en til vervolgens de voorkwab van de hypofyse op. Richt de bron van wit licht over het weefsel. Plaats de hersenen op een voorgekoeld roestvrijstalen blok en houd het blok koud door het te omringen met ijs in een ijskoude zoutoplossing.

Bevochtig het weefsel periodiek met ijskoude zoutoplossing om de structuren te behouden. Plaats de hersenen zo dat de cerebrale cortices naar boven zijn gericht. Verwijder met behulp van kleine gebogen tangen het cerebellum.

Gebruik de dorsale benadering om de gesloten bladen van een kleine gebogen tang onder het corpus callosum te laten glijden en deze voorzichtig te verspreiden om de neocortex bilateraal in te trekken om de kritisch opvallende middellijnoriëntatiepunten te behouden. Uiteindelijk zouden structuren zoals optische chiasme, hypothalamus, olfactorische bollen, medulla oblongata, hypofyse en pontinebrug zichtbaar zijn. Probeer de hemisferen te scheiden.

Draai de ventrale plaats van de hersenen omhoog en maak een mid-sagittale snede vanaf de dorsum tussen de olfactorische bollen in de hersenhelften. Verwijder medulla en scheid vervolgens voorzichtig de twee hemisferen. Maak vervolgens een coronale snede aan de binnenrand van de vijvers om de achterhersenen te verkrijgen en scheid de medulla aan de achterste rand van de vijvers.

Draai het hersenweefsel om voor een zorgvuldige scheiding van de twee hersenhelften. Verwijder de olfactorische lamp bij deze stap. Maak een coronale snede een millimeter voor de genu van het corpus callosum en verwijder de accessoire olfactorische bollen, gevolgd door het scheiden van de mediale en laterale prefrontale cortex.

Snijd gedeeltelijk horizontaal of coronaal door het transversale deel van de voorste commissure vanaf de middellijn onder de voorste hoorn van de laterale ventrikel om de septumkern dorsaal en het ventrale striatum ventraal te bevrijden. Verwijder de kleine hoeveelheid cortex van het laterale oppervlak om de nucleus sucbence en olfactorische tuberkel te verwijderen. Scheid het rostrale deel van het corpus striatum van de bovenliggende cortex via een gebogen scalpelsnede net buiten de externe capsule.

Identificeer de septumkernen of septum en isoleer ze uit deze sectie. Maak een gebogen snede om de hypothalamus bij deze stap te scheiden. Dit zal gebeuren met behulp van een gedeeltelijke coronale snede na de mammillaire lichamen die zich slechts zijdelings uitstrekt als de hypothalamische sulcus.

Bevrijd vervolgens de doorsnede van de hypothalamus met een parasagittale snede langs de lengte van de hypothalamussulfcus. Evert de laterale ventrikel om extra intralimbische verbindingen in de resterende limbische systeemcomponenten te onthullen. Aan de binnenkant van de interne cortex wordt een waaierachtige structuur waargenomen na het openen van de ventrikel.

Gebruik de waaierachtige structuur in de entorhinale cortex om de marges te definiëren voor dissectie, identificeer en verwijder vervolgens de amygdala, entorhinale cortex, posterieure cingulate cortex en hippocampus. Bevestig de identificatie van de thalamus door visualisatie van de stria medullaris op het dorsale oppervlak dat zich uitstrekt in het midline rostrale corticale vlak. Scheid de thalamus volledig van de middenhersenen door een coronale snede.

Dit protocol kan worden gebruikt voor onmiddellijke verwijdering van de hersenen uit de schedel, gevolgd door dissectie. De ontleedde weefsels kunnen later worden bewaard en verwerkt, afhankelijk van de vereisten van het onderzoek. Geëxtraheerd RNA uit meerdere ontleedde weefsels kan worden getest op genexpressie.

De representatieve resultaten werden verkregen met behulp van geoogste hersenen die enkele maanden vóór de RNA-extractie bij min 80 graden Celsius werden opgeslagen. Verschillende hersengebieden samen met gewichtsgegevens werden verzameld onder de studie agressor blootgestelde sociale stress model van PTSS. RNA-concentraties en spectrofotometrische metingen worden hier weergegeven.

Zorg er bij het volgen van dit protocol voor dat de weefsels te allen tijde worden gekoeld door de hersenen op een ijskoud stalen blok te houden en het weefsel periodiek te overgieten met ijszoutoplossing. Zodra weefsels zijn verzameld en onmiddellijk zijn ingevroren, kunnen ze op een later tijdstip worden gebruikt voor testen zoals transcriptomics, metabolomics en proteomics.