Directe agroinoculatie van maïszaailingen door injectie met recombinant vossenstaartmozaïekvirus en suikerrietmozaïekvirus Infectieuze klonen

Dit protocol maakt het mogelijk om virale vectoren rechtstreeks in maïsplanten te inenten die gemakkelijk kunnen worden toegepast in de meeste laboratoriumomgevingen zonder de noodzaak van dure gespecialiseerde apparatuur. Directe inenting elimineert het gebruik van een alternatieve gastheer als entbron, waardoor zowel tijd als middelen worden bespaard. Deze methode kan worden toegepast op extra virale vectoren, maïslijnen en mogelijk andere eenzaadlobbige soorten.

Begin met het planten van 1 tot 2 maïszaden in het op turf gebaseerde groeimedium in kleine inzetstukken die in trays worden geplaatst. Plaats de trays in een groeikamer onder 16 uur per dag bij 25 graden Celsius en 8 uur 's nachts bij 22 tot 25 graden Celsius, of in een kas bij 22 tot 25 graden Celsius met 16 uur dagen en 8 uur nachten. Geef planten regelmatig water en bemest eenmaal per week met 15-5-15 vloeibare meststof met een concentratie van 330 delen per miljoen.

Bereid agrobacterium voor injectie door de agrobacterium-stam met het gewenste virale construct in LB-media in te enten met antibiotica. Incubeer vervolgens de kolf of buizen bij 28 graden Celsius terwijl u gedurende 24 uur bij 225 RPM schudt. Pellet de volgende dag de bacteriën door centrificatie op 4.000 keer G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg.

Was vervolgens de pellet met één milliliter gedeïoniseerd water. Suspensie de pellet opnieuw in een milliliter magnesiumsulfaatoplossing van 10 millaris en meet de optische dichtheid op 600 nanometer. Stel het vervolgens in op 1.0.

Gebruik 4 tot 7 dagen oude maïszaailingen voor het injecteren van agrobacterium. Monteer de spuit en naald. Injecteer de bacteriële suspensie voorzichtig 2-3 millimeter boven de coleoptilulaire knoop totdat deze de coleoptiel vult, of zichtbaar is in de krans, in afwachting van het groeistadium van de planten.

Injecteer alle zaailingen en vervang de spuit en naalden voor het injecteren van elk construct. Bevestig fenotypische infectie door laesies te observeren van het uitschakelen van de controlegenen, laesie bootst 22 of fytoeendesaturase op de bladeren na. Gebruik een fluorescentiebeeldvormingsapparaat voor snelle screening van planten en fluorescentiemicroscopie om de aanwezigheid van GFP-expressie te detecteren.

Voer genexpressieanalyse uit voor moleculaire detectie van infecties. Extraheer totaal RNA uit bladeren van geïnfecteerde planten 14 tot 21 dagen na infectie en synthetiseerde eerste streng cDNA zoals beschreven in het tekstmanuscript. Voer reverse transcriptase PCR uit om de infectie te bevestigen en de integriteit of het genfragment van belang te bepalen met behulp van specifieke primers die zijn ontworpen voor verschillende virale constructen.

Visualiseer het PCR-product op een 1% agarosegel met een nucleïnezuurvlek om de aan- of afwezigheid van virus en gen- of genfragment te bepalen. Dit protocol werd gebruikt om recombinante virussen die zijn ontworpen voor gen in maïszaailingen in te brengen. Ongeveer 12 dagen na injectie werden uitschakelingsfenotypen op bladeren waargenomen als necrose en een fotobleaching.

De aanwezigheid van construct in bladeren na infectie werd gedetecteerd door groene fluorescerende eiwitexpressie onder fluorescentie te observeren met behulp van een ander GFP-filter. Groene fluorescerende eiwitexpressie in met vossenstaartmozaïekvirus geïnfecteerde bladeren werd gevisualiseerd als kleine punctate gebieden van fluorescentie verdeeld over de bladeren en als grote vlekken in met suikerrietmozaïekvirus geïnfecteerde bladeren. Met behulp van de genexpressieanalyse werd systemische vossenstaartmozaïekvirusinfectie bevestigd en werd gen-uitschakeling of onderdrukking van fytoeendesaturase en laesie-nabootsing 22 waargenomen.

De constructie gebruikte ook beïnvloede infectie-efficiëntie. In het geval van vossenstaartmozaïekvirusinfectie hadden vossenstaartmozaïekvirus lege vector en vossenstaartmozaïekviruslaesie nabootsing 22 meestal de hoogste infectie-efficiëntie bij respectievelijk 53% en 54%. Vossenstaartmozaïekvirus fytoeen desaturase met een iets lagere efficiëntie bij 39% en vossenstaartmozaïekvirus groen fluorescerend eiwit, bij het laagste rendement bij 16%Ondertussen was de infectie-efficiëntie van suikerrietmozaïekvirus groen fluorescerend eiwit 8%Timing en symptomen zullen gebaseerd zijn op de gebruikte virale vector en maïslijn.

Gebrek aan een visueel fenotype betekent mogelijk niet een gebrek aan uitschakeling of expressie. Deze methode kan ook worden toegepast op genbewerkingstechnologieën door de toedieningsmethoden voor gids-RNA's te verbeteren.