μTongue: een op microfluïdica gebaseerd functioneel beeldvormingsplatform voor de tong in vivo

Dit protocol maakt het mogelijk om de functies van smaakcellen in een natuurlijke micro-omgeving te observeren, waarbij neurale verbindingen en bloedcirculatie intact blijven. Met behulp van deze techniek kan cel-naar-cel communicatie in vivo worden onderzocht. Vul om te beginnen de reservoirs van het onder druk staande stroomperfusiesysteem met kunstmatig speeksel en smaakstoffen.

Sluit de persluchtleiding aan op de ingang van de regelaar en stel de luchtdruk in het vloeistoftoevoersysteem in op 30 tot 50 pond per vierkante inch. Stel de uitgangsdruk van de regelaar in op 0,4 pond per vierkante inch en controleer of er vloeistof uit de buis begint te stromen. Sluit het spruitstuk van de reservoirs aan op de ingangspoort van de microtong, sluit vervolgens de uitgangspoort van de microtong aan op een spuitpomp en zuig vloeistof op met ongeveer 300 microliter per minuut om een steady state-toestand vast te stellen.

Controleer of het volume van de druppel die onder de microtong hangt constant blijft en pas de luchtdruk en het debiet aan om de gewenste monsterhoogte te verkrijgen. Zodra het microfluïdische systeem is ingesteld, koppelt u de persluchtleiding los en schakelt u de spuitpomp uit totdat de muis is voorbereid op in vivo beeldvorming. Na toediening van anesthesie aan de muis, intraveneus injecteren TRITC-dextran via een retro-orbitale route om de bloedcirculatie tijdens de beeldvorming te observeren.

Met de muis in rugligging spuit je 70% ethanol op zijn kop. Gebruik een tang om de hoofdhuid licht op te tillen en gebruik vervolgens een schaar om ongeveer zeven vierkante millimeter huid af te knippen. Na het reinigen van het haar rond de hoofdhuid, verwijdert u het botvlies van onder de huid en brengt u een onmiddellijke lijm aan op de schedel.

Bevestig vervolgens de op maat gemaakte hoofdfixer. Zodra de instantlijm is uitgehard, breng je tandlijm aan rond de hoofdfixer en stolt je deze door verlichting met een blauw licht. Gebruik instantlijm om de onderlip van de muis aan de onderkant van de microtong te lijmen, plaats de muis vervolgens op het muisvoorbereidingsbord en bevestig de onderste eenheid bij de microtong aan de houdpalen door de gaten aan de rand van de microtong uit te lijnen met de palen.

Draai de muiskopfixer vast aan de hoofdfixerhouder op het bord en pas de afstand tussen de muiskop en het apparaat aan. Gebruik vervolgens de hoofdfixerhouder en draai de muiskop ongeveer 45 graden soepel. Nadat je de muis aan het bord hebt vastgepind, gebruik je een plastic pincet om zijn tong voorzichtig te trekken.

Bevestig vervolgens met behulp van instantlijm de ventrale kant van de tong aan de bovenkant van de onderste eenheid van de microtong. Om de tong vochtig te houden, veegt u het oppervlak af met een nat wattenstaafje en plaatst u vervolgens een stuk weefsel gedrenkt in kunstmatig speeksel op het blootgestelde oppervlak van de tong. Plaats de gebogen ringen op de palen, houd het onderste deel van de microtong vast en verplaats vervolgens de muisvoorbereiding naar de microscoopfase.

Plaats de blootgestelde tong van de muis onder het geschatte midden van het microscoopobject, zorg ervoor dat u niet afwijkt van het dynamische bereik van het podium en draai vervolgens de schroeven aan om het muisbord stevig op het podium te bevestigen. Plaats een verwarmingskussen onder de muis om de lichaamstemperatuur tussen 36,5 en 37,5 graden Celsius te houden. Om te voorkomen dat vloeistof de luchtpijp van de muis binnendringt, plaatst u een dun stuk gedraaid papier in de mond van de muis, verwijdert u vervolgens het natte weefsel dat op het oppervlak van de tong is geplaatst en plaatst u de voorbereide microtong op de muizentong, zodat het oppervlak van de tong zichtbaar is door het beeldvormingsvenster.

Zet de microtong vast door beide uiteinden voorzichtig te schroeven met minimale drukdruk. Om te beginnen met het verkrijgen van afbeeldingen, opent u de microscoopsoftware en schakelt u vervolgens de 920 nanometer tweefotonlaser in. Monteer het onderdompelingsobject objectief op de microscoop, laat het objectief vervolgens op het beeldvenster van de microtong zakken en dompel het objectief onder.

Verlicht in de cameramodus het oppervlak van de tong door het blauwe licht van een kwiklamp in te schakelen. Om het geschatte brandpuntsvlak te vinden, past u de Z-as aan en zoekt u naar een autofluorescentiesignaal van de filiforme papillen. Gebruik vervolgens de X- en Y-instelknop om een smaakpapillen te vinden.

Schakel over naar de multi-fotonmodus en stel vervolgens de excitatiegolflengte, de emissiesfilterset, de scanmodus en de framegrootte in voor beeldacquisitie. Met de smaakpapillen in het midden van het beeldvormingsvenster, lokaliseer je de bloedvaten rond de smaakpapillen op ongeveer tweederde van de hoogte van de smaakpapillen en visualiseer je de bloedcirculatie. Als de bloedstroom verstopt is, maak dan de bevestigingsschroeven iets los om de bloedstroom te hervatten.

Pas de Z-as aan om het Z-vlak van een smaakpapillen te vinden die een voldoende aantal smaakcellen bevat en ga vervolgens verder met calciumbeeldvorming bij twee tot zes Hertz gedurende 80 seconden. Nadat de beeldvorming is gestart, schakelt u het reservoir van het vloeistofsysteem in om gedurende 20 seconden een smaakoplossing te bieden. Schakel na 20 seconden smaakstimulatie het reservoir terug naar kunstmatig speeksel.

Wacht tijdens het afbeelden ongeveer drie tot vier minuten tussen de sessies en geef consequent kunstmatig speeksel om de tong vochtig te houden en het smakelijke dat overblijft van de vorige sessie weg te spoelen. Het tongoppervlak van de Pirt-GCaMP6f-tdTomato-muis is bedekt met autofluorescente filiforme papillen en dun gespreide smaakpapillen. De filiforme papillen in geel worden vastgelegd met behulp van een fotodetector op 500 tot 550 nanometer en kunnen worden waargenomen vanaf het oppervlak van de tong tot ongeveer 25 micrometer diep.

De GCaMP-signalen in het groen gedetecteerd door het 500 tot 550 nanometer filter en de tdTomato-signalen in rood, gedetecteerd door het 607 tot 670 nanometer filter, vertegenwoordigen de smaakcellen. Het tdTomato-signaal wordt verkregen voor ratiometrische analyse. De bloedvaten die de smaakpapillen omringen, worden verkregen met behulp van de 500 tot 550 nanometer filterset in het collageen bindweefsel, dat de smaakpapillen structureel ondersteunt, wordt verkregen met behulp van de 447 tot 460 nanometer filterset.

In dit representatieve voorbeeld van in-vivo smaakscreening met behulp van calciumbeeldvorming wordt elke smaakcel afgebakend door stippellijnen. In deze proef reageerde cel 2 op zowel zoete als umami-smaakstoffen. En cel 3 reageerde op zowel laag als hoog zout.

Geen van de cellen in deze smaakpapillen reageerde op zure smaken. Omdat het doel van dit experiment is om de smaakcelfunctie in de natuurlijke omgeving te observeren, is het belangrijk om de fluorescentiestoffen tijdens de bereidingsstap in de bloedvaten af te geven en de circulatie tijdens het experiment te bevestigen.