Name: μTongue: een op microfluïdica gebaseerd functioneel beeldvormingsplatform voor de tong in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Leer intravitaal fluorescentiemicroscopie van smaakcellen met het µTongue-systeem bij muizen. Deze methode behoudt neurale en vasculaire verbindingen en ondersteunt onderzoek naar celcommunicatie in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Institute of Basic Science (IBS-R015-D1), de National Research Foundation of Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (nr. 2019M3A9E2061789), en door de National Research Foundation of Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (nr. 2019M3E5D2A01058329). We zijn Eunsoo Kim en Eugene Lee dankbaar voor hun technische assistentie.

Alle chirurgische ingrepen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Sungkyunkwan University en Seoul National University.
1. Bereiding van oplossingen: kunstmatig speeksel en smaakstoffen
<ol><li>Bereid kunstmatig speeksel door 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3,3 mM KHCO3,0,25 mM CaCl2,0,25 mM MgCl2,0,12 mM K2HPO4,0,12 mM KH2PO4en 1,8 mM HCl in gedestilleerd water (>1 L) op te lossen en de pH van de oplossing aan te passen aan 7 (zie Materialentabel)12.</li>
	<li>Bereid smaakstoffen, zoals zuur: 10 mM citroenzuur; zout: 400 mM NaCl, optioneel met 50 μM amiloride; zoet: 40 mM acesulfaam K; bitter: een mengsel van 5 mM kinine, 5 mM denatonium en 20 μM cycloheximide, door het oplossen van de smaakstof in het kunstmatige speeksel bereid in stap 1.1.</li>
</ol>2. Voorbereiding van het microfluïdische systeem
OPMERKING: Tastanten werden aan de muizentong geleverd met behulp van een meerkanaals vloeistofafgiftesysteem onder druk (zie figuur 1 en tabel met materialen).
<ol><li>Vul de reservoirs van het onder druk staande stroomperfusiesysteem met het kunstmatige speeksel en de smaakstoffen.</li>
	<li>Sluit de persluchtleiding aan op de ingang van de regelaar en stel de luchtdruk in tussen 30 en 50 psi in het vloeistoftoevoersysteem.</li>
	<li>Stel de uitgangsdruk van de regelaar in op 0,4 psi en controleer of er onder deze druk vloeistof uit de buis komt.</li>
	<li>Sluit het spruitstuk van de reservoirs aan op de ingangspoort van μTongue.</li>
	<li>Sluit de uitgangspoort van μTongue aan op een spuitpomp en zuig vloeistof op met ~ 300 μL ∙ min-1 om de steady-state conditie vast te stellen. Observeer het constante volume van een hangende druppel onder de μTongue. Pas de waarde van de instellingsparameter aan, afhankelijk van de hoogte van het monster.</li>
	<li>Koppel de persluchtleiding los en stop de spuitpomp totdat protocolstap 3 is voltooid.</li>
</ol>3. Voorbereiding van muizen op in vivo beeldvorming(figuur 2).
OPMERKING: Alle dierpreparaten werden overdag onder aseptische omstandigheden op een laboratoriumwerkbank uitgevoerd.
<ol><li>Muis anesthesie<ol>
<li>Bereid een 7 weken oude of oudere muis van beide geslachten voor. Gebruik een genetisch gemodificeerde muizenlijn die calciumgevoelige fluorescentie-eiwitten in de smaakcellen tot expressie brengen.</li>
		<li>De muis wordt in bedwang gehouden voor anesthesie. Een mengsel van 100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine wordt intraperitoneaal in de muis geïnjecteerd13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>TRITC-dextran (500 kDa) in 2,5% W/V fosfaatbuffer zoutoplossing wordt intraveneus toegediend in de muis via een retro-orbitale route om de bloedcirculatie te observeren tijdens een beeldvormingssessie.</li>
	<li>Bevestig een hoofdfixer op de schedel van de muis om bewegingsartefacten te minimaliseren.<ol>
<li>De muiskop wordt besproeid met 70% ETOH terwijl de muis in rugligging wordt geplaatst. Til de kophuid licht op met een tang en knip ongeveer 7 mm2 af met een schaar.</li>
		<li>Reinig het haar rond de hoofdhuid, verwijder het botvlies onder de huid, breng een onmiddellijke lijm aan op de schedel en bevestig een aangepaste hoofdfixer.</li>
		<li>Nadat de instantlijm is uitgehard, breng je tandlijm aan rond de hoofdfixer en verlicht je met een blauw licht om tandlijm te stollen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats de muizentong op de onderste eenheid van μTongue.<ol>
<li>Bevestig de onderlip van de muis met een instantlijm aan de onderste eenheid van μTongue.</li>
		<li>Plaats de muis op het bord (muisvoorbereidingsbord in figuur 1B) en plaats de onderste eenheid van de μTongue op de palen (μTongue houd paal in figuur 1B). Zorg ervoor dat de gaten aan de rand van de onderste eenheid zijn uitgelijnd met de paal.</li>
		<li>Draai de muiskopfixer vast aan de hoofdfixerhouder aan het bord. Pas vervolgens de afstand tussen de muiskop en het apparaat aan. Draai de muiskop ongeveer 45° soepel met behulp van de kopfixerhouder. Dit proces voorkomt fysiek contact van de muizenneus met microscoopdoel.</li>
		<li>Teken de muizentong voorzichtig met een plastic pincet en bevestig de ventrale kant van de tong aan de bovenzijde van de onderste eenheid van de μTongue. Veeg vervolgens het oppervlak van de muizentong af met een nat wattenstaafje.</li>
		<li>Week een stuk papier in het kunstmatige speeksel en plaats het op het blootgestelde oppervlak van de muizentong om een natte toestand te behouden.</li>
		<li>Plaats de gebogen ringen op de palen die beide uiteinden van het onderste deel van μTongue vasthouden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats de muisvoorbereiding op het microscoopstadium. Plaats de blootgestelde muizentong onder het geschatte midden van het microscoopobject. Zorg ervoor dat u niet afwijkt van het dynamische bereik van het podium. Draai vervolgens het muisbord op het podium vast met schroeven.</li>
	<li>Plaats het verwarmingskussen onder het muisbehang en houd de temperatuur op 36,5 °C-37,5 °C. Bewaak de lichaamstemperatuur van de muis met een temperatuursensor en regel de temperatuur van het verwarmingskussen met behulp van een feedbacksignaal van de temperatuursensor.</li>
	<li>Draai een dun stuk papier en plaats het in de mond van de muis om te voorkomen dat er vloeistof in de luchtpijp van de muis komt.</li>
	<li>Verwijder het natte weefsel van de muizentong en plaats de bereide μTongue op de muizentong. Plaats een microfluïdisch kanaal op de tong en pas de positie aan om het oppervlak van de tong door het beeldvormingsvenster te observeren.</li>
	<li>Zet de μTongue vast door voorzichtig aan beide uiteinden te schroeven met minimale drukdruk.</li>
</ol>4. Acquisitie van beeldvorming
<ol><li>Schakel de 920 nm tweefotonenlaser en de microscoop in voor gebruik.</li>
	<li>Monteer het water-onderdompelingsobject objectief (16x, NA 0,80 of 25x, NA 1.1) op de microscoop. Laat het gedestilleerde water op het beeldvormingsvenster van de μTongue vallen en dompel het objectief onder.</li>
	<li>Schakel in de cameramodus het licht in met de kwiklamp en verlicht het oppervlak van de tong.</li>
	<li>Door de Z-as aan te passen, zoekt u het autofluorescentiesignaal van de filiforme papillen om het geschatte brandpuntsvlak te vinden. Zoek vervolgens met behulp van de X- en Y-instelknop een smaakpapillen.</li>
	<li>Schakel over naar de multifoton-modus. Stel de beeldacquisitievoorwaarden als volgt in: excitatiegolflengte: 920 nm; emissiespelset: 447/60 nm, 525/50 nm en 607/70 nm; bidirectionele rasterscanmodus, framegrootte: 512 x 512.</li>
	<li>Pas de X- en Y-posities aan om de smaakpapillen in het midden van het afbeeldingsvenster te plaatsen.</li>
	<li>Doorzoek de bloedvaten rond de smaakpapillen op ongeveer tweederde hoogte van de smaakpapillen. Visualiseer de bloedcirculatie door TRITC-dextran (500 kDa) injectie uit protocol stap 3.2. Als de bloedstroom verstopt, maak dan de bevestigingsschroeven iets los om de bloedstroom mogelijk te maken.</li>
	<li>Pas de Z-as aan en zoek het Z-vlak van smaakpapillen dat een voldoende aantal smaakcellen bevat.</li>
	<li>Ga verder met calciumbeeldvorming met 2-6 Hz gedurende 80 s. Zorg voor een smaakoplossing van 20 s door het reservoir van het vloeistofsysteem in te schakelen nadat de beeldvorming is gestart. Schakel na 20 s smaakstimulatie het reservoir terug naar kunstmatig speeksel.</li>
	<li>Nadat de sequentiële beeldvorming is voltooid, wacht u ongeveer 3-4 minuten van tevoren tot de volgende beeldvormingssessie. Houd het kunstmatige speeksel naar de muizentong om het smakelijke remanent van de vorige beeldvormingssessie weg te spoelen. Afhankelijk van het ontwerp van het experiment herhaalt u de sessie indien nodig.</li>
	<li>Wanneer in vivo calciumbeeldvorming is voltooid, euthanaseer de muis volgens de IACUC-procedure. De muis onder narcose wordt opgeofferd in de CO2-kamer. OPMERKING: Controleer de diepte van de anesthesie met behulp van een teen-knijpreflex. Tijdens een beeldvormingssessie moet kunstmatig speeksel uit de reservoirs consequent worden verstrekt. Als er bellen verschijnen in het beeldvormingsvenster van de μTongue, verwijder dan de bellen door ze met een sterke vloeistofdruk door de ingang of de uitgang van de μTongue te duwen.</li>
</ol>5. Beeldanalyse (Figuur 3)
<ol><li>Beeldconversie<ol>
<li>Open de RAW-afbeeldingsbestanden met Fiji14 of een vergelijkbare beeldanalysesoftware.</li>
		<li>Converteer het afbeeldingsbestand naar een RGB-stackbestand om de NPL Bud Analyzer-code te gebruiken.<ol>
<li>Afbeelding > kleur > gesplitste kanalen</li>
			<li>
Afbeelding > Kleur > samenvoegen en selecteer de afbeelding in stap 5.2.1.</li>
			<li>Afbeelding > kleur > stack naar RGB</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beeldregistratie OPMERKING: Gebruik de op maat geschreven code voor gegevensanalyse. Zie https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.<ol>
<li>Voer de codenaam Taste_GUI.muit; er verschijnt een GUI-venster met de naam NPL Bud Analyzer. Klik op de knop Nieuwe analyse in de rechterbovenhoek en laad vervolgens de geconverteerde afbeelding uit stap 5.1. Stel de framesnelheid in boven de geladen afbeelding.</li>
		<li>Teken het interessegebied (ROI) over de geladen afbeelding voor registratie. Dubbelklik op de geselecteerde ROI en er wordt een automatisch berekende registratie gestart.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verkrijg de relatieve fluorescentie-intensiteitsveranderingen (ΔF/F)<ol>
<li>Ga terug naar het venster NPL Bud Analyzer om de geregistreerde afbeelding uit stap 5.2 automatisch weer te geven. Als de gebruiker al een reg-bestand heeft, klikt u op de knop Gegevens laden en selecteert u het _reg.tif bestand.</li>
		<li>Klik op de knop CIRKEL of POLYGOON en plaats de ROI van de smaakcel over de afbeelding van de smaakpapillen.</li>
		<li>Dit presenteert de ruwe fluorescentie-intensiteit en het calciumspoor (ΔF/F) van de geselecteerde smaakcel automatisch onder het smaakpapillenbeeld.</li>
		<li>Klik op Trace opslaan om het calciumspoor (ΔF/F) aan de rechterkant van de GUI te presenteren, terwijl de ROI wordt weergegeven over de afbeelding van de smaakpapillen. Herhaal stap 5.3.2-5.3.4 totdat de ROI-selectie is voltooid. OPMERKING: Klik op de knop Traceren verwijderen als de ROI verkeerd is geselecteerd om de laatst geselecteerde ROI en calciumtracering te elimineren.</li>
		<li>Nadat de ROI-selectie is voltooid, schrijft u de bestandsnaam in de rechterbenedenhoek en klikt u op de knop Voltooien om het ΔF/ F-calciumtraceer als een .xls-indeling en de tase bud-afbeelding met ROI's in een .bmp-indeling te exporteren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse van het calciumspoor<ol>
<li>Analyseer het calciumspoor verkregen uit stap 5.3. Bedenk dat smaakcellen hebben gereageerd op tastant wanneer de fluorescentie-intensiteit meer dan twee standaardafwijkingen van de uitgangswaarde stijgt nadat het smaakstof is afgeleverd4, en p-waarden zijn minder dan 0,01, met behulp van gepaarde of ongepaarde t-tests10.</li>
		<li>Beschouw de smaakcel als een respondercel, als deze meer dan twee van de drie onderzoeken (~ 60%) op een bepaald smaakstof reageert15.</li>
		<li>Verkrijg de representatieve calciumsporen door het gemiddelde te nemen van individuele calciumsporen verkregen uit stap 5.4.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+subcellular+targeting+of+GCaMP-type+genetically-encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators.</a> PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).</li>
<li>Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence+microscopy%3A+Lessons+from+observing+cell+behavior+in+their+native+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment.</a> Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).</li>
<li>Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+Ca2%2B+imaging+reveals+neurotransmitter+receptors+for+glutamate+in+taste+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).</li>
<li>Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+and+taste+coding+in+mammalian+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds.</a> Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).</li>
<li>Dando, R., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+communication+in+intact+taste+buds+through+ATP+signalling+from+pannexin+1+gap+junction+hemichannels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels.</a> The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).</li>
<li>Chandrashekar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cells+and+peripheral+representation+of+sodium+taste+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The cells and peripheral representation of sodium taste in mice.</a> Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).</li>
<li>Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+salt+recruits+aversive+taste+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High salt recruits aversive taste pathways.</a> Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).</li>
<li>Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopic+interrogation+of+peripheral+taste+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation.</a> Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).</li>
<li>Han, J., Choi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+functional+screening+of+taste+sensation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo.</a> bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).</li>
<li>Thestrup, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+ratiometric+calcium+sensors+for+functional+in+vivo+imaging+of+neurons+and+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes.</a> Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).</li>
<li>Danilova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glossopharyngeal+nerves+to+taste+stimuli+in+C57BL+%2F+6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BME+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice.</a> BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).</li>
<li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Tan, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut-brain+axis+mediates+sugar+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The gut-brain axis mediates sugar preference.</a> Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).</li>
<li>Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+anion+in+salt+%28NaCl%29+detection+by+mouse+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).</li>
<li>Kusuhara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+responses+in+mice+lacking+taste+receptor+subunit+T1R1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1.</a> Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren concurrerende financiële belangen: J. Han en M. Choi zijn uitvinders van de gepatenteerde μTongue-technologie die in dit artikel wordt beschreven, en het μTongue-systeem is commercieel verkrijgbaar via SciTech Korea.

Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven om μTongue toe te passen op het onderzoek naar functionele activiteiten van smaakcellen in vivo. In dit protocol wordt de functionele beeldvorming op de smaakcellen met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren uitgevoerd. Naast het gebruik van transgene muizen kan de elektroforetische belasting van calciumkleurstoffen (of spanningsgevoelige kleurstoffen) op de smaakcellen een alternatieve optie zijn.
Alle smaakoplossingen van ...

De intravitale fluorescentiemicroscoop wordt veel gebruikt om de spatiotemporale dynamiek op levende weefsels te bestuderen. Onderzoekers ontwikkelen snel genetisch gecodeerde sensoren die specifieke en gevoelige transformaties van de biologische processen in fluorescentiesignalen bieden - die gemakkelijk kunnen worden geregistreerd met behulp van fluorescentiemicroscopen die op grote schaal beschikbaar zijn1,2. Hoewel de meeste inwendige organen bij knaagdieren zijn onderzocht met behulp van de microscoop, is de succesvolle toepassing ervan op de tong nog niet succesvol geweest3.
Eerdere studies naar de calciumbeeldvorming van smaakcellen werden ex vivo uitgevoerd door een tongweefsel dun te sectien om circumvallaat smaakpapillen te verkrijgen4,5,6 of door het smaakepitheel af te pellen om fungiforme smaakpapillen te verkrijgen7,8. De voorbereiding van deze monsters was onvermijdelijk invasief, dus de natuurlijke micro-omgevingen zoals zenuwinnervatie, permeabiliteitsbarrières en bloedcirculatie werden grotendeels verstoord. Het eerste intravitale tongbeeldvormingsvenster werd in 2015 gerapporteerd door Choi et al., maar betrouwbare functionele opname was niet haalbaar vanwege de beweging en optische artefacten veroorzaakt door fluïde smaakstofstimuli9.
Onlangs werd microfluïdica-op-een-tong (μTongue) geïntroduceerd10. Dit apparaat integreert een microfluïdisch systeem met een beeldvenster op de muizentong. Door gedurende de hele beeldvormingsperiode een quasi-steady-state stroom van smakelijke stimuli te bereiken, konden artefacten van vloeiende bewegingen worden geminimaliseerd(figuur 1). De ingangspoort wordt gevoed door een reeks meerkanaals drukregelaars, terwijl de uitgangspoort is aangesloten op een spuitpomp, die 0,3 ml / min behoudt. Bovendien werden optische artefacten veroorzaakt door het verschil in brekingsindices van smaakoplossingen geminimaliseerd door ratiometrische analyse die een calciumongevoelige indicator (tdTomato) en de calciumindicator (GCaMP6) introduceerde11. Dit ontwerp zorgde voor microscopische stabiliteit van smaakcellen in vivo, zelfs bij abrupt schakelen tussen vloeistofkanalen. Bijgevolg implementeert de μTongue een betrouwbare functionele screening van meerdere smaakstoffen op de smaakpapillen van de muis in vivo.
In dit protocol worden de experimentele procedures in detail uitgelegd voor calciumbeeldvorming van de fungiforme smaakpapillen van muizen in vivo met behulp van μTongue. Eerst wordt de bereiding van kunstmatig speeksel en smakelijke oplossingen beschreven. Ten tweede wordt het opzetten van het microfluïdische systeem geïntroduceerd om de quasi-steady-state flow te bereiken. Ten derde worden de procedures die worden gebruikt om de muizentong op de μTongue te monteren om beeldacquisitie mogelijk te maken, afgebakend. Ten slotte wordt elke stap voor beeldanalyse, inclusief correctie van laterale bewegingsartefacten en ratiometrie, gespecificeerd. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan elk onderzoekslaboratorium met een muisfaciliteit en een microscoop met twee fotonen of gelijkwaardige apparatuur.

<table><tbody><tr><td>acesulfame K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04054-25G</td><td>Kunstmatige speeksel / smaakstof</td></tr><tr><td>calciumchloride-oplossing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>21115-100ML</td><td>Kunstmatige speeksel / smaakstof</td></tr><tr><td>citroenzuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0759-100G</td><td>Kunstmatige speeksel / smaakstof</td></tr><tr><td>cycloheximide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>01810-5G</td><td>Kunstmatige speeksel / smaakstof</td></tr><tr><td>denatoniium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5765-5G</td><td>Kunstmatige speeksel / smaakstof</td></tr><tr><td>Tandlijm</td><td>Denkist</td><td>P0000CJT-A2</td><td>Voorbereiding op dieren</td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td>Gegevensanalyse</td></tr><tr><td>IMP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57510-5G</td><td>Kunstmatige speeksel / smaakstof</td></tr><tr><td>Onmiddellijke lijm</td><td>Loctite</td><td>Loctite 4161, Henkel</td><td>Voorbereiding op dieren</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-100G</td><td>Kunstmatige speeksel / smaakstof</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td>Kunstmatige speeksel / smaakstof</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Yuhan</td><td>Ketamine 50</td><td>Voorbereiding op dieren</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662-25G</td><td>Kunstmatige speeksel / smaakstof</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>237205-500G</td><td>Kunstmatige speeksel / smaakstof</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathwork</td><td>MATLAB</td><td>Gegevensanalyse</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td>Kunstmatige speeksel / smaakstof</td></tr><tr><td>MPG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49601-100G</td><td>Kunstmatige speeksel / smaakstof</td></tr><tr><td>Mutiphoton-microscoop</td><td>Thorlab</td><td>&nbsp;Bergamo II</td><td>Microscoop</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td>Kunstmatige speeksel / smaakstof</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>792519-500G</td><td>Kunstmatige speeksel / smaakstof</td></tr><tr><td>Objectief</td><td>Nikon</td><td>N16XLWD-PF</td><td>Microscoop</td></tr><tr><td>Octaflow</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>OCTAFLOW II</td><td>Vloeistofcontrole</td></tr><tr><td>PC</td><td>LG</td><td>Lg15N54</td><td>Vloeistofcontrole</td></tr><tr><td>PH-meter</td><td>Thermoscientific</td><td>ORION STAR AZ11</td><td>Kunstmatige speeksel / smaakstof</td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferde zoutoplossing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>806562</td><td>Kunstmatige speeksel / smaakstof</td></tr><tr><td>quinine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Q1125-5G</td><td>Kunstmatige speeksel / smaakstof</td></tr><tr><td>Spuitpomp</td><td>Havard Apparatus</td><td>PHD ULTRA 4400</td><td>Vloeistofcontrole</td></tr><tr><td>TRITC-dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52194-1G</td><td>Voorbereiding op dieren</td></tr><tr><td>Ultrasnelle vezellaser</td><td>Toptica</td><td>FFultra920 01042</td><td>Microscoop</td></tr><tr><td>Xylacine</td><td>Bayer Korea</td><td>Rompun</td><td>Voorbereiding op dieren</td></tr></tbody></table>

μtongue: een op microfluïdica gebaseerd functioneel beeldvormingsplatform voor de tong in vivo

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

Intravitale fluorescentiemicroscopie is een hulpmiddel dat op grote schaal wordt gebruikt om meercellige dynamica in een levend dier te bestuderen. Het is echter niet met succes gebruikt in het smaaksensorische orgaan. Door microfluïdica te integreren in het intravitale tongbeeldvormingsvenster, biedt de μTongue betrouwbare functionele beelden van smaakcellen in vivo bij gecontroleerde blootstelling aan meerdere smaakstoffen. In dit artikel wordt een gedetailleerde stapsgewijze procedure gepresenteerd om het μTongue-systeem te gebruiken. Er zijn vijf subsecties: voorbereiden van smakelijke oplossingen, opzetten van een microfluïdische module, monstermontage, verkrijgen van functionele beeldgegevens en gegevensanalyse. Enkele tips en technieken om de praktische problemen op te lossen die zich kunnen voordoen bij het gebruik van de μTongue worden ook gepresenteerd.

De Pirt-GCaMP6f-tdTomato muis werd gebruikt om een smaakpapillenbeeld te verkrijgen. Het oppervlak van de muizentong was bedekt met autofluorescente filiforme papillen. Smaakpapillen worden schaars verspreid over het oppervlak van de tong(figuur 4A). De beelden van de smaakpapillen en zijn structuur werden verkregen met behulp van drie verschillende filterdetectoren. Met behulp van de 607/70 nm filterset werd het tdTomato signaal van de smaakcellen verkregen voor ratiometrische analyse<stron...

Het artikel introduceert het μTongue (microfluidics-on-a-tongue) apparaat voor functionele smaakcelbeeldvorming in vivo door microfluïdica te integreren in een intravitaal beeldvormingsvenster op de tong.

μTongue: een op microfluïdica gebaseerd functioneel beeldvormingsplatform voor de tong in vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...

Dit protocol maakt het mogelijk om de functies van smaakcellen in een natuurlijke micro-omgeving te observeren, waarbij neurale verbindingen en bloedcirculatie intact blijven. Met behulp van deze techniek kan cel-naar-cel communicatie in vivo worden onderzocht. Vul om te beginnen de reservoirs van het onder druk staande stroomperfusiesysteem met kunstmatig speeksel en smaakstoffen.Sluit de persluchtleiding aan op de ingang van de regelaar en stel de luchtdruk in het vloeistoftoevoersysteem in op 30 tot 50 pond per vierkante inch. Stel de uitgangsdruk van de regelaar in op 0,4 pond per vierkante inch en controleer of er vloeistof uit de buis begint te stromen. Sluit het spruitstuk van de reservoirs aan op de ingangspoort van de microtong, sluit vervolgens de uitgangspoort van de microtong aan op een spuitpomp en zuig vloeistof op met ongeveer 300 microliter per minuut om een steady state-toestand vast te stellen.Controleer of het volume van de druppel die onder de microtong hangt constant blijft en pas de luchtdruk en het debiet aan om de gewenste monsterhoogte te verkrijgen. Zodra het microfluïdische systeem is ingesteld, koppelt u de persluchtleiding los en schakelt u de spuitpomp uit totdat de muis is voorbereid op in vivo beeldvorming. Na toediening van anesthesie aan de muis, intraveneus injecteren TRITC-dextran via een retro-orbitale route om de bloedcirculatie tijdens de beeldvorming te observeren.Met de muis in rugligging spuit je 70% ethanol op zijn kop. Gebruik een tang om de hoofdhuid licht op te tillen en gebruik vervolgens een schaar om ongeveer zeven vierkante millimeter huid af te knippen. Na het reinigen van het haar rond de hoofdhuid, verwijdert u het botvlies van onder de huid en brengt u een onmiddellijke lijm aan op de schedel.Bevestig vervolgens de op maat gemaakte hoofdfixer. Zodra de instantlijm is uitgehard, breng je tandlijm aan rond de hoofdfixer en stolt je deze door verlichting met een blauw licht. Gebruik instantlijm om de onderlip van de muis aan de onderkant van de microtong te lijmen, plaats de muis vervolgens op het muisvoorbereidingsbord en bevestig de onderste eenheid bij de microtong aan de houdpalen door de gaten aan de rand van de microtong uit te lijnen met de palen.Draai de muiskopfixer vast aan de hoofdfixerhouder op het bord en pas de afstand tussen de muiskop en het apparaat aan. Gebruik vervolgens de hoofdfixerhouder en draai de muiskop ongeveer 45 graden soepel. Nadat je de muis aan het bord hebt vastgepind, gebruik je een plastic pincet om zijn tong voorzichtig te trekken.Bevestig vervolgens met behulp van instantlijm de ventrale kant van de tong aan de bovenkant van de onderste eenheid van de microtong. Om de tong vochtig te houden, veegt u het oppervlak af met een nat wattenstaafje en plaatst u vervolgens een stuk weefsel gedrenkt in kunstmatig speeksel op het blootgestelde oppervlak van de tong. Plaats de gebogen ringen op de palen, houd het onderste deel van de microtong vast en verplaats vervolgens de muisvoorbereiding naar de microscoopfase.Plaats de blootgestelde tong van de muis onder het geschatte midden van het microscoopobject, zorg ervoor dat u niet afwijkt van het dynamische bereik van het podium en draai vervolgens de schroeven aan om het muisbord stevig op het podium te bevestigen. Plaats een verwarmingskussen onder de muis om de lichaamstemperatuur tussen 36,5 en 37,5 graden Celsius te houden. Om te voorkomen dat vloeistof de luchtpijp van de muis binnendringt, plaatst u een dun stuk gedraaid papier in de mond van de muis, verwijdert u vervolgens het natte weefsel dat op het oppervlak van de tong is geplaatst en plaatst u de voorbereide microtong op de muizentong, zodat het oppervlak van de tong zichtbaar is door het beeldvormingsvenster.Zet de microtong vast door beide uiteinden voorzichtig te schroeven met minimale drukdruk. Om te beginnen met het verkrijgen van afbeeldingen, opent u de microscoopsoftware en schakelt u vervolgens de 920 nanometer tweefotonlaser in. Monteer het onderdompelingsobject objectief op de microscoop, laat het objectief vervolgens op het beeldvenster van de microtong zakken en dompel het objectief onder.Verlicht in de cameramodus het oppervlak van de tong door het blauwe licht van een kwiklamp in te schakelen. Om het geschatte brandpuntsvlak te vinden, past u de Z-as aan en zoekt u naar een autofluorescentiesignaal van de filiforme papillen. Gebruik vervolgens de X- en Y-instelknop om een smaakpapillen te vinden.Schakel over naar de multi-fotonmodus en stel vervolgens de excitatiegolflengte, de emissiesfilterset, de scanmodus en de framegrootte in voor beeldacquisitie. Met de smaakpapillen in het midden van het beeldvormingsvenster, lokaliseer je de bloedvaten rond de smaakpapillen op ongeveer tweederde van de hoogte van de smaakpapillen en visualiseer je de bloedcirculatie. Als de bloedstroom verstopt is, maak dan de bevestigingsschroeven iets los om de bloedstroom te hervatten.Pas de Z-as aan om het Z-vlak van een smaakpapillen te vinden die een voldoende aantal smaakcellen bevat en ga vervolgens verder met calciumbeeldvorming bij twee tot zes Hertz gedurende 80 seconden. Nadat de beeldvorming is gestart, schakelt u het reservoir van het vloeistofsysteem in om gedurende 20 seconden een smaakoplossing te bieden. Schakel na 20 seconden smaakstimulatie het reservoir terug naar kunstmatig speeksel.Wacht tijdens het afbeelden ongeveer drie tot vier minuten tussen de sessies en geef consequent kunstmatig speeksel om de tong vochtig te houden en het smakelijke dat overblijft van de vorige sessie weg te spoelen. Het tongoppervlak van de Pirt-GCaMP6f-tdTomato-muis is bedekt met autofluorescente filiforme papillen en dun gespreide smaakpapillen. De filiforme papillen in geel worden vastgelegd met behulp van een fotodetector op 500 tot 550 nanometer en kunnen worden waargenomen vanaf het oppervlak van de tong tot ongeveer 25 micrometer diep.De GCaMP-signalen in het groen gedetecteerd door het 500 tot 550 nanometer filter en de tdTomato-signalen in rood, gedetecteerd door het 607 tot 670 nanometer filter, vertegenwoordigen de smaakcellen. Het tdTomato-signaal wordt verkregen voor ratiometrische analyse. De bloedvaten die de smaakpapillen omringen, worden verkregen met behulp van de 500 tot 550 nanometer filterset in het collageen bindweefsel, dat de smaakpapillen structureel ondersteunt, wordt verkregen met behulp van de 447 tot 460 nanometer filterset.In dit representatieve voorbeeld van in-vivo smaakscreening met behulp van calciumbeeldvorming wordt elke smaakcel afgebakend door stippellijnen. In deze proef reageerde cel 2 op zowel zoete als umami-smaakstoffen. En cel 3 reageerde op zowel laag als hoog zout.Geen van de cellen in deze smaakpapillen reageerde op zure smaken. Omdat het doel van dit experiment is om de smaakcelfunctie in de natuurlijke omgeving te observeren, is het belangrijk om de fluorescentiestoffen tijdens de bereidingsstap in de bloedvaten af te geven en de circulatie tijdens het experiment te bevestigen.

tongue-microfluidics-based-functional-imaging-platform-for-tongue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een uitgebreid overzicht van de technieken die betrokken zijn bij het genereren van een muismodel van orale kanker en kwantitatieve controle van de tumor invasie in de tong door middel van multi-foton microscopie van gelabelde cellen wordt gepresenteerd. Dit systeem kan dienen als een nuttig platform voor de moleculaire beoordeling en werkzaamheid van het geneesmiddel van anti-invasieve verbindingen.

Multi-foton Imaging van de tumorcel invasie in een orthotope Muis Model van Oral plaveiselcelcarcinoom

Lensfree optische tomografie een driedimensionale microscopie techniek die een ruimtelijke resolutie van &lt;1 um heeft x &lt;1 um x &lt;3 urn x, y en z afmetingen respectievelijk over een groot volume beeldvorming van 15-100...

Lensfree On-chip Tomografische Microscopie Gebruikmakend van Multi-angle Verlichting en Pixel Super-resolutie

We geven hierin een gedetailleerde beschrijving van het experimentele protocol voor beeldvorming met een nieuw ontwikkeld handbediend optoakoestisch (fotoakoestisch) systeem voor driedimensionale functionele en moleculaire beeldvorming in real time. De aangetoonde krachtige prestaties en veelzijdigheid kunnen nieuwe toepassingsgebieden van de optoakoestische technologie in preklinisch onderzoek en klinische praktijk definiëren.

Universal Hand-held Driedimensionale opto-akoestische Imaging Probe voor Deep Tissue Human-angiografie en Functional preklinisch Studies in Real Time

Deze studie succesvol menselijk Videofluoroscopisch slikken studie (VFSS) methoden voor gebruik met murine ziektemodellen behoeve van translationeel dysfagie onderzoek vergemakkelijken aangepast.

Het aanpassen van de Mens Videofluoroscopisch Swallow Studie Methoden voor het opsporen en karakteriseren Dysphagia in Muizen Disease Models

Echografie kan worden gebruikt om de vorm en bewegingen van de tong in realtime weer te geven tijdens het spreken. De beelden kunnen worden gebruikt om de aard van spraakgeuschen te bepalen. Visuele feedback van de tong kan worden gebruikt om verbeteringen in de productie van spraakgeuschen te bevorderen in klinische populaties.

Echografie Foto&#39;s van de Tong: A Tutorial voor onderzoek en sanering van meningsuiting Sound Fouten

Doelgroepen gerichte sondes vertegenwoordigen een vernieuwend hulpmiddel voor het analyseren van de moleculaire mechanismen, zoals eiwituitdrukking in verschillende soorten ziekten (b.v., ontsteking, infectie en tumorvorming). In deze studie beschrijven we een kwantitatieve driedimensionale tomografische beoordeling van intestinale macrofaag infiltratie in een lymfkliertest model van colitis met F4/80-specifieke fluorescentie-gemedieerde tomografie.

Fluorescentie-gemedieerde tomografie voor de detectie en kwantificering van macrofaag-gerelateerde lymfkliertest darmontstekingen

We beschrijven een chirurgische procedure in een verdoofd ratmodel voor het bepalen van de spiertonus en de viscoelastische eigenschappen van de tong. De procedure omvat specifieke stimulatie van de hypoglossale zenuwen en toepassing van passieve Lissajous kracht / vervormingskrommen op de spier.

In Vivo Evaluatie van de Mechanische en Viscoelastische Eigenschappen van de Rat Tongue

We hebben een gegeneraliseerd protocol ontwikkeld om een grote hoeveelheid hoogwaardige enkelvoudige cellen te scheiden van het epitheel en mesenchym/bindweefsel van embryonale en volwassen muistongs.

Celdissociatie van het tongepitheel en mesenchym/bindweefsel van embryonale dag 12,5 en 8 weken oude muizen

Het protocol presenteert een methode voor het kweken en verwerken van linguale organoïden afgeleid van smaakstamcellen geïsoleerd uit de achterste smaakpapillen van volwassen muizen.

Generatie en cultuur van linguale organoïden afgeleid van volwassen muizensmaak stamcellen

Een hangende drop surface filmbalans geïmplementeerd met een multi-subfase uitwisseling, bijgenaamd de OCTOPUS, maakt het mogelijk om spijsverteringsproblemen na te bootsen door de sequentiële subfase-uitwisseling van de originele bulkoplossing met gesimuleerde gastro-intestinale vloeistoffen. De gesimuleerde in vitro vertering wordt gemonitord door in situ de interfaciale spanning van de verteerde interfaciale laag te registreren.

In vitro Vertering van emulsies in een enkele druppel via multi-subfase-uitwisseling van gesimuleerde gastro-intestinale vloeistoffen

Het doel van dit protocol is een gestandaardiseerde benadering te bieden voor het kwantitatief beoordelen van de integriteit van de muisachtige gingivale epitheliale barrière door topisch fluorescentie-gelabelde dextrans van verschillende molecuulgroottes op het gingivale oppervlak in vivo toe te passen, gevolgd door ex vivo beeldvorming met een enkelfotonmicroscopiesysteem.

Functionele beoordeling van de muis-gingivale epitheliale barrière met behulp van fluorescerende tracers

Leer intravitaal fluorescentiemicroscopie van smaakcellen met het µTongue-systeem bij muizen. Deze methode behoudt neurale en vasculaire verbindingen en ondersteunt onderzoek naar celcommunicatie in vivo.

μTongue: een op microfluïdica gebaseerd functioneel beeldvormingsplatform voor de tong in vivo

Meer video's verkennen