Detectie van SARS-CoV-2 neutraliserende antilichamen met behulp van high-throughput fluorescerende beeldvorming van pseudovirusinfectie

Deze methode biedt een manier om een van de belangrijkere vragen over de SARS-coronavirus-2-vaccins in ontwikkeling te beantwoorden. Is het vaccin in staat om een neutraliserende antilichaamrespons uit te lokken? Het grote voordeel van deze techniek is dat het kan worden gedaan in een containment niveau twee faciliteit.

Het is ook relatief snel en goedkoop, waardoor het zeer geschikt is om veel monsters tegelijk te analyseren. Om de neutraliserende zuurprocedure te demonstreren, hebben we Ricardo Marius, een senior technicus in het laboratorium en Taylor Jamieson, een MD PhD-student. Begin met het kweken van Vero E6-cellen in DMEM aangevuld met 10% FBS bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Om de cellen te passeren, wast u ze eerst door 10 milliliter PBS toe te voegen en de schaal vier tot vijf keer voorzichtig te wiegen. Voeg na het aanzuigen van de PBS drie milliliter trypsine EDTA toe en laat de schaal schommelen om ervoor te zorgen dat het hele oppervlak bedekt is voordat je het bij 37 graden Celsius incubeert. Zodra de cellen zich hebben losgemaakt, deactiveert u de trypsine door zeven milliliter DMEM toe te voegen, aangevuld met 10% FBS, en vervolgens de cellen opnieuw opsuspend door meerdere keren op en neer te pipetteren.

Verwijder de trypsine door centrifugering en adem het supernatant op zonder de celkorrel te verstoren voordat u de cellen opnieuw opsuspendeert in 10 milliliter verse DMEM. Voeg na het tellen ongeveer één keer 10 tot de zevende cellen toe aan elke plaat van 15 centimeter en incubeer de cultuur gedurende één tot twee dagen totdat de cellen 100% confluent zijn. Om het VSV spike EGFP pseudovirus voor te bereiden op titering, infecteer de cellen bij 0,01 multipliciteit van infectie met het stamvirus verdund in 12 milliliter serumvrije DMEM.

Na het toevoegen van het virus, incubeer de cellen gedurende een uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide met af en toe schommelen. Vervang aan het einde van de incubatie het entmateriaal door verse DMEM aangevuld met 2% FBS en 20 millimolaire hopen en incubeer vervolgens de cellen bij 34 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur. Gebruik de volgende dag een fluorescerende microscoop om de EGFP-expressie van de geïnfecteerde cellen te visualiseren.

Zodra een uitgebreid cytopathisch effect en celdetachement zijn waargenomen, verzamelt u het kweeksupernatant en verwijdert u het puin door centrifugatie. Om meerdere vries-dooicycli te voorkomen, moet u het supernatant vóór opslag bij min 80 graden Celsius aliquoten. Om de virale titer te bepalen, vero E6-cellen in zes putplaten met een zaaidichtheid van zes keer 10 tot de vijfde cel per put en 's nachts incuberen.

Stel de volgende dag een tienvoudige serie seriële verdunningsreeks van de virale voorraad in door 900 microliter medium toe te voegen aan zeven microcentrifugebuizen en 100 microliter virale voorraad toe te voegen aan de eerste buis. Breng na korte vortexing 100 microliter verdund virus over naar elke volgende buis, vortexing tussen elke buis. Vervang vervolgens het supernatant in elke put van de Vero E6-cultuurplaat door 500 microliter van de 10 tot de min seconde tot 10 tot de minus zevende virale verdunningen.

Na een incubatie van 45 minuten in de celkweekincubator met zacht schommelen om de 15 minuten, vervang het ent het cellen bij 34 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 48 uur. Aan het einde van de incubatie, om de plaques door kristalvioletkleuring te visualiseren, wast u de cellen één keer met PBS voordat u twee milliliter van 0,1% kristalviolet aan elke put toevoegt. Leg de plaat ongeveer 20 minuten op een wip op kamertemperatuur voordat u elke put twee keer voorzichtig wast met PBS.

Laat de platen na de laatste wasbeurt ten minste één uur aan de lucht drogen voordat u de formule gebruikt zoals aangegeven om de titer van het virus in elke put in plaquevormende eenheden per milliliter te berekenen. Om cellen te platen voor een neutralisatietest, gebruikt u een meerkanaalspipet om 100 microliter Vero E6-cellen toe te voegen aan elke put van een 96-putplaat met een dichtheid van twee keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter en incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. De volgende dag inactiveert de warmte de serummonsters van de patiënt om gedurende 30 minuten in een waterbad van 56 graden Celsius te worden getest.

Stel vervolgens een tienvoudige verdunningsreeks van de serummonsters van de patiënt op in een lege 96 put weefselkweekplaat door acht microliter van het serum toe te voegen aan 72 microliter serumvrije DMEM met antibiotica in elke put van rij A.Voeg vervolgens 40 microliter serumvrije DMEM toe aan elke put van rijen B tot G en 80 microliter aan elke put van rij H.Gebruik een 12-put meerkanaalspipet, meng de monsters in rij A en breng vervolgens 40 microliter van het monster over van elke put van rij A naar elke put van rij B.Herhaal na het mengen de verdunning voor elke volgende rij putjes tot rij F.Voeg vervolgens 40 microliter VSV-spike EGFP met 0,05 multipliciteit van infectie toe aan elke put in rijen A tot en met G; en meng door vier tot vijf keer te pipetteren voordat je de plaat een uur lang incubeert bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Aspirateer aan het einde van de incubatie zorgvuldig het supernatant uit elke put van de Vero E6-cultuurplaat en breng 60 microliter antilichaamvirusmengsel over van elke put van de monsterverdunningsplaat naar de overeenkomstige put van de celkweekplaat. Wanneer alle monsters zijn overgebracht, plaatst u de celkweekplaat op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende een uur met schommelen om de 20 minuten.

Nadat de incubatie is voltooid, voegt u 140 microliter carboxymethylcellulose-overlayoplossing toe aan elke put van de celkweekplaat en breng u de plaat over naar een incubator van 34 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Breng na 24 uur de platen in beeld op een geautomatiseerde fluorescerende imager met een golflengte van 488 nanometer en gebruik de geautomatiseerde telfunctie van de imager om de individuele EGFP-foci te kwantificeren. In dit representatieve voorbeeld werd een commercieel beschikbaar neutraliserend antilichaam tegen het SARS-coronavirus-2 spike receptor binding domein gebruikt als een positieve controle, naast IgG als een negatieve controle.

De procentuele remming werd berekend op basis van het aantal EGFP-foci gedetecteerd via fluorescerende beeldvorming. Pseudovirusneutralisatie door herstellende patiëntmonsters verzameld ongeveer drie maanden na SARS-coronavirus-2-infectie toonde aan dat gehospitaliseerde patiënten een verhoogde neutraliserende capaciteit vertoonden in vergelijking met degenen die geen ziekenhuisopname nodig hadden. Deze procedure kan ook worden gebruikt om andere COVID-19-preventie en therapeutische middelen te evalueren die gericht zijn op het blokkeren van virale infecties.