Retinale pathofysiologische evaluatie in een rattenmodel

Het algemene doel van deze technieken is om de retinale pathofysiologie in het streptozotocine-geïnduceerde diabetische retinopathie rattenmodel te evalueren. De diabetische retinopathie is een van de belangrijkste oorzaken van blindheid. De voortdurende zoektocht gaat door naar farmacologische middelen met een betere werkzaamheid en een langere werking om diabetische retinopathie te behandelen.

Het proces van het ontdekken van farmacologische middelen in preklinische diermodellen speelt een vitale rol. Deze diermodellen helpen om de structurele en functionele veranderingen van de achterste segmentweefsels van het oog te begrijpen. Daarom zullen we drie verschillende technieken demonstreren om deze veranderingen in de problemen met het achterste segment te bestuderen.

We demonstreren histologie om morfologische veranderingen van retinale cellen in lagen te bestuderen, BRB-afbraaktest om gecompromitteerde BRB te bestuderen door gelekt eiwit in het glasvocht uit plasma te kwantificeren, en ook fluoresce-angiografie om retinale vasculatuur te visualiseren met behulp van FITC-dextran-kleurstof. Euthanaseer de rat met een hoge dosis pentobarbital en bevestig de dood zonder detecteerbare hartslag. Enucleeer het oog door incisies te maken met behulp van een scalpelmes op de neus- en temporale gebieden van het oog.

Snijd vervolgens langs de randen om het oog uit de orbitale kom te verwijderen. Verwijder het overtollige vet rond het oog en plaats het in 5 ml fixatieve oplossing. Incubeer het oog in een fixatieve oplossing gedurende 24 tot 48 uur.

Verwijder na fixatie het oog uit de fixatieve oplossing en breng het over naar de petrischaal gevuld met 10 ml PBS. Houd met behulp van een microtang het oog vast met de oogzenuw en maak een inkeping op pars plana met behulp van een microschaar. Snijd door de hele rand van het hoornvlies om de voorste beker en de achterste oogbeker te scheiden.

Verwijder de lens en snijd de oogzenuw door. Snijd de achterste cup in twee helften en passeer de oogzenuw. Breng elke helft over in de afzonderlijke cassettes.

Droog het weefsel uit door de concentratie ethanol geleidelijk te verhogen van 50% naar 100% ethanol. En tot slot, verwijder de ethanol met xyleen. Impregneer het weefsel met voorverwarmde paraffine bij 60 graden Celsius om xyleen in het weefsel te vervangen.

Bereid de paraffineblokken voor met behulp van een stalen mal om het weefsel en de cassette als basis vast te houden. Tijdens het voorbereiden van het blok moet het optische schijfgedeelte van het oog naar de onderkant van de stalen mal kijken. Vul de cassette met paraffine en breng deze over op een koel oppervlak.

Monteer het mes en de cassette op de respectievelijke houders op microtoom. Knip met behulp van een microtoom de overtollige paraffinewas en knip een lint van vijf tot zes secties met een dikte van 5 micrometer. Breng het lint over op het oppervlak van het voorverwarmde waterbad om het lint uit te vouwen.

Verzamel de secties op een glazen dia bedekt met albumine. Laat de glijbanen een nacht drogen bij 37 graden Celsius. Om hematoxyline- en eosinekleuring uit te voeren, verwarmt u de dia's gedurende 1 uur op 60 graden Celsius om de paraffine te smelten.

Volg de kleuringsprocedure zoals gegeven in manuscript. Begin met de rehydratatie van weefsel en vervolgens met hematoxyline, gevolgd door eosine. Droog nu het weefsel uit en voeg montagemedium toe aan de secties.

Plaats de afdekplaat op secties en visualiseer onder de lichtmicroscoop. Om bloed-retinale barrièreafbraaktest uit te voeren, verdooft u de rat met ketamine en xylazine en bevestigt u de anesthetische toestand door teen knijpen. Lokaliseer het hart en plaats een spuit van 1 ml met een naald van 24 gauge om het bloed te trekken door een hartpunctie.

Zodra het voldoende bloed is verzameld, brengt u het over naar de met EDTA bedekte buis. Meng het voorzichtig om hemolyse te voorkomen. Enucleeer het oog en breng het onmiddellijk over op droogijs.

Begin onder bevroren omstandigheden met de dissectie van het oog door het hoornvlies en de lens te verwijderen. Trek het glasvocht uit het achterste oogsegment met een tang zonder enige besmetting van het netvlies. Breng het over in de homogeniseerbuis met drie tot vier kralen.

Homogeniseer de monsters met behulp van kradelhomogenisator op gemiddelde snelheid gedurende 10 seconden. Breng bloed- en glasvochthumormonsters over in microcentrifugebuizen om verder te verwerken. Centrifugeer beide monsters bij 5, 200 g gedurende 10 minuten bij 4 graden Celsius.

Voeg met behulp van een meerkanaalspion 250 microliter Bradford-reagens toe aan putten. Verdun glasvochtmonsters 10 keer en plasmamonsters 20 keer met PBS. Voeg 5 microliter verdunde monsters toe aan Bradford-reagens en meng goed.

Incubeer de monsters gedurende 20 tot 30 minuten en meet vervolgens de absorptie op 590 nanometer met behulp van een 96-well plaatlezer. De intensiteit van het monster is recht evenredig met de concentratie van het eiwit. Om fluorescentieangiografie uit te voeren, verdooft u de rat met 3% isofluraan en bevestigt u de verdovingstoestand door teenstoot.

Dompel de staart in warm water voordat u de kleurstof injecteert. Injecteer 1 ml van 50 mg per ml FITC-dextran oplossing in de laterale staartader. Laat de kleurstof 5 tot 10 minuten circuleren.

Euthanaseer de rat met pentobarbital en bevestig zijn dood door geen detecteerbare hartslag. Enucleeer het oog en ga verder met flat mount voorbereiding. Om retinale flat mount voor te bereiden, plaatst u het oog op een vezelvrije Kimwipe en snijdt u het voorste deel van het oog.

Trek langzaam de lens, samen met de glasvochthumor, uit het achterste segment van het oog. Breng het achterste segment over in een petrischaal gevuld met PBS en snijd de oogzenuw door. Plaats nu de punt van de puntige tang tussen sclera en netvlies.

Beweeg het voorzichtig langs de rand van de beker om ervoor te zorgen dat het netvlies op geen enkel moment aan sclera is bevestigd. Snijd in de buurt van de optische schijf, zodat het netvlies volledig loskomt van de sclera. Zodra is bevestigd dat het netvlies aan geen enkele kant aan sclera is bevestigd, duwt u het langzaam in de PBS-oplossing.

Breng met behulp van een tang het netvlies over op een schone glasplaat zonder deze te beschadigen. Maak met behulp van een microschaar of scalpelmes vier sneden op het netvlies, zoals getoond, om het in vier kwadranten te verdelen. Verwijder overtollige PBS uit de retinale omgeving en voeg anti-vervagend montagemedium toe aan de retinale flat mount.

Bedek het met een coverslip en visualiseer de platte houder onder een confocale microscoop. Het is belangrijk om hier op te merken dat het hele proces van fluorescentieangiografie wordt uitgevoerd onder minimaal licht om het doven van fluorescentie van FITC-dextran-kleurstof te voorkomen. Bij diabetische ratten ondergaan de retinale cellen degeneratie, wat leidt tot verdere complicaties.

Deze structurele veranderingen kunnen worden gevisualiseerd door histologietechniek om het celnummer en de dikte van het netvlies te bepalen. In het geval van diabetische ratten neemt de dikte van retinale lagen toe als gevolg van oedeem. Vandaar dat deze techniek helpt bij het screenen van verschillende potentiële farmacologische middelen om diabetische retinopathie te behandelen.

Metabole veranderingen in het netvlies als gevolg van diabetes veroorzaken verlies van pericyten en afbraak van de bloed-retinale barrière. Omdat er lekkage van eiwitten en andere biomoleculen in het netvlies en het glasvocht is, nemen de niveaus van totaal eiwit toe in het glasvocht van diabetische ratten. Het voorkomen van de afbraak van de bloed-retinale barrière kan de voortgang van diabetische retinopathie aanzienlijk belemmeren.

Bij diabetische retinopathie neemt de expressie van vasculaire endotheelgroeifactor toe die leiden tot de vorming van nieuwe bloedvaten. Deze vaten verstoren de normale retinale structuur en daarom is de innervatie ervan van primair belang voor de behandeling van diabetische retinopathie. Fluorescentieangiografietechniek wordt gebruikt om nieuwe bloedvaten en ook lekkage van bloedvaten te visualiseren, zoals hier wordt benadrukt.

Angiogenese is echter pas prominent na zes tot 12 maanden diabetesinductie. Deze techniek helpt ons om het effect van medicamenteuze behandeling op innervatie van angiogenese en vasculaire lekkage te kwantificeren. De toekomstige behandeling van diabetische retinopathie heeft efficiëntere farmacologische middelen nodig, maar de toekomstige behandelingen kunnen alleen worden bereikt door een beter begrip van de pathogenese van de ziekte.

Het beheersen van deze technieken zou onderzoekers kunnen helpen om een beter begrip te krijgen van de pathogenese van diabetische retinopathie, wat zou kunnen leiden tot een ontdekking van betere farmacologische interventies.