Patroonvorming van micro-organismen en microdeeltjes door sequentiële capillariteitsondersteunde assemblage

Deze methode maakt het mogelijk om door de gebruiker gedefinieerde patronen van micro-organismen te produceren binnen een microfluïdisch kanaal. Eenmaal gemodelleerd, kunnen de micro-organismen worden gecontroleerd om hun langetermijnfysiologie en interactie met hoge doorvoer te evalueren. Het gebruik van capillaire krachten maakt een niet-specifieke route voor patroonvorming mogelijk, die toepasbaar is in verschillende klassen van materialen.

Bijvoorbeeld colloïdale deeltjes en bacteriën. Bovendien maakt het het mogelijk om grote arrays te produceren met een uitstekende controle over de ruimtelijke ordening van het materiaal van belang. Tot op heden hebben we de methode getest en toegepast op colloïdale deeltjes en microbiële cellen.

Als gevolg hiervan kan het toepassingen vinden in materiaaltechniek en gebieden die kwantitatieve eencellige analyse vereisen, zoals geneesmiddelenscreening. Bereid om te beginnen een PDMS-mengsel door het elastomeer te mengen met het cross-linking-middel. Roer vervolgens het mengsel krachtig om de twee componenten gelijkmatig te mengen totdat luchtbellen zijn gevormd en het PDMS-mengsel er ondoorzichtig uitziet.

Ontgas het mengsel nu in een vacuümsiccator totdat alle luchtbellen zijn verwijderd en het mengsel er weer transparant uitziet. Om een 400 micrometer dikke sjabloonvloer van de microfluïdische chip te verkrijgen, giet u drie gram van het mengsel op de siliciummaster en plaatst u de siliciummaster op een spincoater om gedurende vijf seconden op 21 keer G en gedurende 10 seconden op 21 keer G te spincoaten. Degas opnieuw voor het verwijderen van de opgesloten luchtbellen zoals eerder beschreven.

Giet 20 gram van het PDMS-mengsel in de 3D-geprinte mal om het microkanaal te maken dat zal dienen als het dak van de microfluïdische chip en ontgas het gedurende 30 minuten zoals eerder beschreven. Bak de siliciumwafel en de 3D-geprinte mal minstens twee uur op 70 graden Celsius, snijd vervolgens de PDMS langs de omtrek van de 3D-geprinte mal en pel deze af. Knip de PDMS met een mes rond de microkanalen en pons de gaten die zullen dienen als in- en uitlaat van het microfluïdische kanaal.

Knip nu het PDMS en pel het van de siliciummaster en snijd de PDMS-laag in kleinere stukken met dezelfde afmetingen van de microfluïdische kanalen die bovenop de sjablonen worden gebonden. Wrijf de sjablonen en microkanalen voorzichtig in met een wasmiddeloplossing van 1% gedurende vijf minuten en spoel vervolgens af met gedeïoniseerd water. Spoel vervolgens de sjablonen en microkanalen met isopropanol, voordat u ze spoelt met gedeïoniseerd water.

Droog nu de sjablonen en microkanalen een minuut op kamertemperatuur met perslucht op één bar. Plaats de sjablonen en de microkanalen in een plasmareiniger met de hechtoppervlakken naar boven gericht. Na het inschakelen van de plasmareiniger, behandelt plasma de sjablonen en microkanalen gedurende 40 seconden, haalt ze vervolgens uit de plasmareiniger en bindt onmiddellijk de microkanalen bovenop de sjablonen.

Bewaar de microfluïdische chips vijf dagen in een oven op 70 graden Celsius om PDMS hydrofoob herstel te garanderen. Stel op de dag van het experiment de boxincubator enkele uren voor het experiment in op 37 graden Celsius en stel vervolgens de spuitpomp en de verwarmde glasplaat op de microscooptrap in, waarbij dezelfde temperatuur wordt ingesteld als die van de boxincubator. Plaats 90 minuten voor het experiment de microfluïdische chip in een vat gevuld met 100% ethanol en spoel het kanaal gedurende ten minste 10 minuten met 100% ethanol, plaats vervolgens de microfluïdische chip in een vacuümsiccator en ontgas gedurende ten minste 30 minuten.

Wissel nu de ethanol met gedestilleerd water en behandel de chip minstens 30 minuten vacuüm. Zet de microfluïdische chip gedurende 10 minuten in de oven op 70 graden Celsius om eventuele sporen van vloeistof in het kanaal te verwijderen. Pipetteer één milliliter MOPS-medium in een injectieflacon met centrifuge en voeg 10 microliter 0,132 molair kaliumfosfaat toe.

Aliquot 100 microliter van de nachtkweek in de injectieflacon van de centrifuge en centrifugeer de cultuur gedurende twee minuten bij 2.300 maal G. Gooi het supernatant voorzichtig weg om de pellet opnieuw te suspenderen in één milliliter vers MOPS-medium met 0,015% Tween 20 en 0,01% kaliumfosfaat en laad de bacteriële suspensie in een spuit van één milliliter. Om de spuit en de slangverbinding vast te zetten, steekt u direct een naald in de slang.

Monteer nu de spuit op de spuitpomp en injecteer de suspensie in de microfluïdische chip via de inlaat aan het stroomopwaartse deel van het kanaal totdat de suspensie het sjabloongebied bedekt met vallen. Stel de spuitpomp in op een debiet van 0,07 tot 0,2 microliter per minuut om de bacteriële suspensie op te zuigen en het patroonproces via microscoopsoftware te bewaken. Zodra de sjabloon is voorzien van cellen, verhoogt u de onttrekkingsstroomsnelheid om het microfluïdische kanaal snel te legen en spoelt u het met verse LB die eerder gedurende ten minste 30 minuten werd ontgast en voorgewarmd bij 30 graden Celsius.

Stel nu de spuitpomp in op een debiet van twee microliter per minuut om het kanaal voorzichtig door te spoelen. Zodra het kanaal is gevuld, verhoogt u opnieuw het debiet. Verkrijg beelden van groeiende bacteriën met de gewenste vergroting en tijdsinterval.

Pipetteer 900 microliter van een 0,015% Tween 20 waterige oplossing in een injectieflacon met centrifuge en pipetteer vervolgens 100 microliter van de oorspronkelijke colloïdale suspensie erin. Centrifugeer de suspensie gedurende één minuut op 13.500 maal G en vervang het supernatant voorzichtig door de waterige Tween 20-oplossing. Laad de colloïdale suspensie in een spuit van één milliliter en sluit de spuit aan op de chip via microfluïdische slangen.

Injecteer de suspensie in de microfluïdische chip door de inlaat in het centrale gedeelte aan het stroomopwaartse deel van het kanaal en duw de suspensie geleidelijk in totdat de sjabloon is bedekt. Trek de colloïdale suspensie op met een stroomsnelheid van 0,07 tot 0,2 microliter per minuut en breng het patroonproces in beeld via microscoopsoftware. Verhoog de stroomsnelheid zodra de meniscus snel het einde van de sjabloon bereikt.

De rechte kanaalgeometrie werd gebruikt om stationaire gefaseerde cellen van een fluorescerende Escherichia coli-stam te modelleren die 83% van de 5.000 geanalyseerde vallen afzetten. Patroonbacteriën hervatten de groei op verschillende tijdstippen binnen 1,5 uur vanaf het moment dat het kanaal was gevuld met verse LB. Zodra de groei werd hervat, begonnen enkele bacteriële cellen individuele kolonies te vormen die zich uitbreidden totdat een oppervlaktelaag werd gevormd en de resolutie van één cel verloren ging. Analyse uitgevoerd over 55.000 vallen toonde aan dat groenrode dimeren gemaakt door deeltjes met een diameter van twee en één micrometer werden gevormd in respectievelijk 93% en 89% van de geanalyseerde vallen.

En groen-rood-groene trimmers werden gevormd in 52% van de vallen. De afstand tussen deeltjes met patronen kan nauwkeurig worden geregeld door twee afzettingen in tegengestelde richtingen uit te voeren, waardoor dergelijke deeltjes aan de tegenovergestelde uiteinden van elke val worden gevangen. Het is belangrijk om te zorgen voor een uniforme temperatuur in de sjabloon om condensatie tijdens het patroonproces te voorkomen.

Hiertoe plaatsen we een verwarmde glazen plaat onder de sjabloon en stellen deze in op dezelfde temperatuur als de doosincubator. Deze methode kan worden gebruikt in een verscheidenheid aan biologische studies met kwantitatieve eencellige analyse. Een uniek voordeel is dat de hoge doorvoerkarakter die het mogelijk maakt om duizenden cellen te modelleren en grote statistieken binnen dezelfde experimentele arena te leveren.