Patroonvorming van micro-organismen en microdeeltjes door sequentiële capillariteitsondersteunde assemblage
4 november 2021
We presenteren een technologie die capillariteitsondersteunde assemblage in een microfluïdisch platform gebruikt om microgrote objecten die in een vloeistof zijn gesuspendeerd, zoals bacteriën en colloïden, te modelleren in voorgeschreven arrays op een polydimethylsiloxaansubstraat.
Deze methode maakt het mogelijk om door de gebruiker gedefinieerde patronen van micro-organismen te produceren binnen een microfluïdisch kanaal. Eenmaal gemodelleerd, kunnen de micro-organismen worden gecontroleerd om hun langetermijnfysiologie en interactie met hoge doorvoer te evalueren. Het gebruik van capillaire krachten maakt een niet-specifieke route voor patroonvorming mogelijk, die toepasbaar is in verschillende klassen van materialen.
Bijvoorbeeld colloïdale deeltjes en bacteriën. Bovendien maakt het het mogelijk om grote arrays te produceren met een uitstekende controle over de ruimtelijke ordening van het materiaal van belang. Tot op heden hebben we de methode getest en toegepast op colloïdale deeltjes en microbiële cellen.
Als gevolg hiervan kan het toepassingen vinden in materiaaltechniek en gebieden die kwantitatieve eencellige analyse vereisen, zoals geneesmiddelenscreening. Bereid om te beginnen een PDMS-mengsel door het elastomeer te mengen met het cross-linking-middel. Roer vervolgens het mengsel krachtig om de twee componenten gelijkmatig te mengen totdat luchtbellen zijn gevormd en het PDMS-mengsel er ondoorzichtig uitziet.
Ontgas het mengsel nu in een vacuümsiccator totdat alle luchtbellen zijn verwijderd en het mengsel er weer transparant uitziet. Om een 400 micrometer dikke sjabloonvloer van de microfluïdische chip te verkrijgen, giet u drie gram van het mengsel op de siliciummaster en plaatst u de siliciummaster op een spincoater om gedurende vijf seconden op 21 keer G en gedurende 10 seconden op 21 keer G te spincoaten. Degas opnieuw voor het verwijderen van de opgesloten luchtbellen zoals eerder beschreven.
Giet 20 gram van het PDMS-mengsel in de 3D-geprinte mal om het microkanaal te maken dat zal dienen als het dak van de microfluïdische chip en ontgas het gedurende 30 minuten zoals eerder beschreven. Bak de siliciumwafel en de 3D-geprinte mal minstens twee uur op 70 graden Celsius, snijd vervolgens de PDMS langs de omtrek van de 3D-geprinte mal en pel deze af. Knip de PDMS met een mes rond de microkanalen en pons de gaten die zullen dienen als in- en uitlaat van het microfluïdische kanaal.
Knip nu het PDMS en pel het van de siliciummaster en snijd de PDMS-laag in kleinere stukken met dezelfde afmetingen van de microfluïdische kanalen die bovenop de sjablonen worden gebonden. Wrijf de sjablonen en microkanalen voorzichtig in met een wasmiddeloplossing van 1% gedurende vijf minuten en spoel vervolgens af met gedeïoniseerd water. Spoel vervolgens de sjablonen en microkanalen met isopropanol, voordat u ze spoelt met gedeïoniseerd water.
Droog nu de sjablonen en microkanalen een minuut op kamertemperatuur met perslucht op één bar. Plaats de sjablonen en de microkanalen in een plasmareiniger met de hechtoppervlakken naar boven gericht. Na het inschakelen van de plasmareiniger, behandelt plasma de sjablonen en microkanalen gedurende 40 seconden, haalt ze vervolgens uit de plasmareiniger en bindt onmiddellijk de microkanalen bovenop de sjablonen.
Bewaar de microfluïdische chips vijf dagen in een oven op 70 graden Celsius om PDMS hydrofoob herstel te garanderen. Stel op de dag van het experiment de boxincubator enkele uren voor het experiment in op 37 graden Celsius en stel vervolgens de spuitpomp en de verwarmde glasplaat op de microscooptrap in, waarbij dezelfde temperatuur wordt ingesteld als die van de boxincubator. Plaats 90 minuten voor het experiment de microfluïdische chip in een vat gevuld met 100% ethanol en spoel het kanaal gedurende ten minste 10 minuten met 100% ethanol, plaats vervolgens de microfluïdische chip in een vacuümsiccator en ontgas gedurende ten minste 30 minuten.
Wissel nu de ethanol met gedestilleerd water en behandel de chip minstens 30 minuten vacuüm. Zet de microfluïdische chip gedurende 10 minuten in de oven op 70 graden Celsius om eventuele sporen van vloeistof in het kanaal te verwijderen. Pipetteer één milliliter MOPS-medium in een injectieflacon met centrifuge en voeg 10 microliter 0,132 molair kaliumfosfaat toe.
Aliquot 100 microliter van de nachtkweek in de injectieflacon van de centrifuge en centrifugeer de cultuur gedurende twee minuten bij 2.300 maal G. Gooi het supernatant voorzichtig weg om de pellet opnieuw te suspenderen in één milliliter vers MOPS-medium met 0,015% Tween 20 en 0,01% kaliumfosfaat en laad de bacteriële suspensie in een spuit van één milliliter. Om de spuit en de slangverbinding vast te zetten, steekt u direct een naald in de slang.
Monteer nu de spuit op de spuitpomp en injecteer de suspensie in de microfluïdische chip via de inlaat aan het stroomopwaartse deel van het kanaal totdat de suspensie het sjabloongebied bedekt met vallen. Stel de spuitpomp in op een debiet van 0,07 tot 0,2 microliter per minuut om de bacteriële suspensie op te zuigen en het patroonproces via microscoopsoftware te bewaken. Zodra de sjabloon is voorzien van cellen, verhoogt u de onttrekkingsstroomsnelheid om het microfluïdische kanaal snel te legen en spoelt u het met verse LB die eerder gedurende ten minste 30 minuten werd ontgast en voorgewarmd bij 30 graden Celsius.
Stel nu de spuitpomp in op een debiet van twee microliter per minuut om het kanaal voorzichtig door te spoelen. Zodra het kanaal is gevuld, verhoogt u opnieuw het debiet. Verkrijg beelden van groeiende bacteriën met de gewenste vergroting en tijdsinterval.
Pipetteer 900 microliter van een 0,015% Tween 20 waterige oplossing in een injectieflacon met centrifuge en pipetteer vervolgens 100 microliter van de oorspronkelijke colloïdale suspensie erin. Centrifugeer de suspensie gedurende één minuut op 13.500 maal G en vervang het supernatant voorzichtig door de waterige Tween 20-oplossing. Laad de colloïdale suspensie in een spuit van één milliliter en sluit de spuit aan op de chip via microfluïdische slangen.
Injecteer de suspensie in de microfluïdische chip door de inlaat in het centrale gedeelte aan het stroomopwaartse deel van het kanaal en duw de suspensie geleidelijk in totdat de sjabloon is bedekt. Trek de colloïdale suspensie op met een stroomsnelheid van 0,07 tot 0,2 microliter per minuut en breng het patroonproces in beeld via microscoopsoftware. Verhoog de stroomsnelheid zodra de meniscus snel het einde van de sjabloon bereikt.
De rechte kanaalgeometrie werd gebruikt om stationaire gefaseerde cellen van een fluorescerende Escherichia coli-stam te modelleren die 83% van de 5.000 geanalyseerde vallen afzetten. Patroonbacteriën hervatten de groei op verschillende tijdstippen binnen 1,5 uur vanaf het moment dat het kanaal was gevuld met verse LB. Zodra de groei werd hervat, begonnen enkele bacteriële cellen individuele kolonies te vormen die zich uitbreidden totdat een oppervlaktelaag werd gevormd en de resolutie van één cel verloren ging. Analyse uitgevoerd over 55.000 vallen toonde aan dat groenrode dimeren gemaakt door deeltjes met een diameter van twee en één micrometer werden gevormd in respectievelijk 93% en 89% van de geanalyseerde vallen.
En groen-rood-groene trimmers werden gevormd in 52% van de vallen. De afstand tussen deeltjes met patronen kan nauwkeurig worden geregeld door twee afzettingen in tegengestelde richtingen uit te voeren, waardoor dergelijke deeltjes aan de tegenovergestelde uiteinden van elke val worden gevangen. Het is belangrijk om te zorgen voor een uniforme temperatuur in de sjabloon om condensatie tijdens het patroonproces te voorkomen.
Hiertoe plaatsen we een verwarmde glazen plaat onder de sjabloon en stellen deze in op dezelfde temperatuur als de doosincubator. Deze methode kan worden gebruikt in een verscheidenheid aan biologische studies met kwantitatieve eencellige analyse. Een uniek voordeel is dat de hoge doorvoerkarakter die het mogelijk maakt om duizenden cellen te modelleren en grote statistieken binnen dezelfde experimentele arena te leveren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een microfluïdisch platform dat capillariteit-ondersteunde assemblage gebruikt om micro-grootte objecten, zoals bacteriën en colloïden, in gedefinieerde arrays te patternen. Deze methode maakt het mogelijk om de lange-termijn fysiologie en interacties van micro-organismen te monitoren.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Microfluidica
- Biotechnologie
- Microbiologie
Achtergrond
- Microfluïdische kanalen maken nauwkeurige manipulatie van kleine vloeistofvolumes mogelijk.
- Kapillaire krachten kunnen worden benut voor het patternen van verschillende materialen.
- Het begrijpen van het gedrag van micro-organismen is cruciaal voor verschillende toepassingen.
- Bestaande methoden missen mogelijk de flexibiliteit voor gebruikersgedefinieerde patronen.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het produceren van gebruikersgedefinieerde patronen van micro-organismen.
- Om de lange-termijn fysiologie van gepatternde micro-organismen te evalueren.
- Om de toepasbaarheid van capillaire krachten over verschillende materiaalklassen te verkennen.
Gebruikte methoden
- Capillariteit-ondersteunde assemblage in microfluïdische kanalen.
- Patterning van colloïdale deeltjes en microbiële cellen.
- Monitoring van micro-organismen na patterning.
- Evaluatie van controle over de ruimtelijke arrangement.
Belangrijkste resultaten
- Gebruikersgedefinieerde patronen van micro-organismen werden succesvol gemaakt.
- De methode toonde controle over de ruimtelijke arrangement van materialen.
- Langdurige monitoring van micro-organismen was haalbaar.
- Kapillaire krachten boden een veelzijdige benadering voor verschillende materialen.
Conclusies
- De technologie biedt een nieuwe benadering voor het patternen van micro-organismen.
- Het heeft potentiële toepassingen in het bestuderen van microbiële interacties.
- De methode is aanpasbaar voor verschillende soorten materialen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This microfluidic platform enables high-throughput, user-defined patterning of microorganisms and microparticles, supporting quantitative single-cell analysis in drug discovery and microbial ecology studies. By combining geometric control with environmental modulation, it enhances predictive confidence in target validation and phenotypic screening workflows. The method addresses a key discovery-stage challenge: achieving reproducible spatial arrangements for mechanistic de-risking of microbial interactions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise spatial patterning of microbial strains for interaction studies.
- Operational Value: Supports biological de-risking by allowing controlled co-culture configurations to clarify pathway dependencies.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating quantitative data on distance-dependent microbe-microbe interactions under defined conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by depositing thousands of individual cells with high spatial fidelity.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through capillary-force-driven patterning applicable across material classes.
- Screening Readiness: Enables reliable compound evaluation by providing large arrays of patterned microorganisms for high-throughput monitoring.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant systems by coupling single-cell deposition with microfluidic environmental control for microbial physiology studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Connects discovery through preclinical validation by enabling long-term monitoring of growth and colony formation post-patterning.
- Predictive De-risking: Focuses on mechanistic insights from patterned arrays, such as green-red dimer and trimer formation rates, to inform translational decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification, supporting hypothesis testing and assay readiness for antimicrobial or probiotic candidate evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled patterning of microbial strains to study interaction dynamics.
- Screening: Describes assay readiness through high-throughput patterning of microorganisms, allowing quantitative imaging of growth and interaction over time.
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as trap occupancy rates (e.g., 83% for E. coli, 93% for 2μm particles) that help compare conditions and material behaviors.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling long-term physiology monitoring under controlled environmental conditions, relevant for microbial ecology translation.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable platform for patterning diverse materials, including bacteria and colloids, across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in microbial interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of patterning across microbial and colloidal systems.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in antimicrobial development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative single-cell interaction data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, plasma bonding, and hydrophobic recovery of PDMS.
- Depends on instrumentation including syringe pumps, heated stages, plasma cleaners, and microscopy systems for patterning and monitoring.
- Necessitates cross-team standardization of channel preparation, bacterial suspension handling, and environmental control protocols.
- Involves adaptation considerations for different microorganism sizes, growth rates, and colloidal material properties.
- Includes practical limitations such as the need for uniform temperature to prevent condensation and potential loss of single-cell resolution during colony expansion.
